IL-37通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化而诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡和自噬

目的观察白细胞介素37(IL-37)诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡和自噬的机制。方法体外培养SMMC-7721细胞,SMMC-7721细胞分为处理组和对照组,处理组分别予以不同剂量(50、100、200)ng/mL的重组人IL-37(rh IL-37)。CCK-8法检测SMMC-7721细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测凋亡和自噬相关蛋白Bax、Bcl-2、微管相关蛋白1轻链3(LC3)和beclin 1及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的水平,透射电子显微镜观察自噬体的形成情况。结果 IL-37可抑制SMMC-7721肝细胞癌细胞的增殖、诱导SMMC-7721细胞凋亡和自噬;IL-37处理组Bax、LC3和beclin 1水平增加,Bcl-2水平降低,mTOR的磷酸化被抑制;可见明显自噬体形成。结论 IL-37可诱导肝细胞癌SMMC-7721细胞发生凋亡和自噬,可能与mTOR的磷酸化有关。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路与调节性T细胞营养代谢调控机制研究进展

肿瘤微环境中发生的代谢重编程会影响T细胞的代谢特征,诱导免疫抑制促进肿瘤免疫逃逸。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路在调控各种免疫细胞的不同功能方面发挥着重要作用。本文主要回顾了mTOR信号调节细胞能量代谢进程的分子机制,以及不同营养环境下mTOR信号的活化状态。此外,还总结了目前研究中mTOR信号在调节性T细胞(Treg)代谢和功能过程中的作用,评估了mTOR作为临床免疫治疗靶点的潜力和目前应用的挑战性。

组氨酸对体外培养奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白及酪氨酸激酶2-信号转导与转录激活子5/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路相关磷酸化蛋白表达的影响

本试验旨在研究不同浓度的组氨酸对体外培养奶牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白及酪氨酸激酶2（JAK2）-信号转导与转录激活子5（STAT5）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（m TOR）信号通路相关磷酸化蛋白表达的影响。将原代奶牛乳腺上皮细胞进行体外培养,分为对照组和7个试验组,采用无必需氨基酸的培养基,对照组不添加组氨酸,试验组是在对照组基础上分别添加0.15、0.60、1.20、2.40、4.80、9.60、19.20 mmol/L的组氨酸。采用噻唑蓝比色法检测原代奶牛乳腺上皮细胞12 h增殖情况;运用蛋白质免疫印迹检测β-酪蛋白和8个信号通路相关磷酸化蛋白表达。结果表明：1）当组氨酸浓度为0.15~9.60 mmol/L时,与对照组相比,奶牛乳腺上皮细胞数量均增加。2）β-酪蛋白表达量随组氨酸浓度的增加出现先升高后降低的趋势,但试验组均极显著高于对照组（P〈0.01）。3）与对照组相比,组氨酸的添加可极显著促进各信号通路相关磷酸化蛋白的表达（P〈0.01）;试验组中,随着组氨酸浓度的升高,磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白[P-m TOR（Ser2481）]和磷酸化真核细胞翻译延伸因子2[P-e EF2（Thr56）]蛋白的表达量下降,而磷酸化核糖体S6蛋白激酶1[P-S6K1（Thr389）]的蛋白表达增加;当组氨酸浓度为2.40 mmol/L时,磷酸化酪氨酸激酶2[P-JAK2（Tyr1007/1008）]、磷酸化真核细胞始动因子4E结合蛋白1[P-4EBP1（Thr37）]和磷酸化真核细胞起始因子2α[P-e IF2α（Ser51）]蛋白的表达量最高,磷酸化信号转导与转录激活子5[P-STAT5（Tyr694）]、磷酸化m TOR调控蛋白[P-raptor（Ser863）]和m TOR复合物1中的绑定蛋白（GβL）蛋白在组氨酸浓度为9.60 mmol/L时表达量最高。综合可知,组氨酸的添加可通过促进JAK2-STAT5信号通路中P-JAK2（Tyr1007/1008）和PSTAT5（Tyr694）蛋白的表达来进而调控β-酪蛋白表达。最适浓度（0.15～9.60 mmol/L）范围内的组氨酸还可通过m TORC1的P-raptor（Ser863）蛋白作用于下游靶点P-4EBP1（Thr37）来促进β-酪蛋白表达,最终调控乳蛋白合成。

胃肠间质瘤危险性分级与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白表达的关系

目的研究胃肠间质瘤危险性分级与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号传导通路中mTOR和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)表达的关系。方法用免疫组织化学法检测40例胃肠间质瘤中PI3K/Akt/mTOR信号传导通路相关蛋白mTOR和p-mTOR的阳性表达率,分析其在不同危险程度组之间的差异。结果 mTOR、p-mTOR蛋白在部分胃肠间质瘤呈阳性表达,定位于细胞质。mTOR、p-mTOR在极低和低度危险组的阳性表达率均低于中高度危险组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论胃肠间质瘤PI3K/Akt/mTOR信号传导通路中mTOR和p-mTOR与其侵袭危险性有关,提示该信号传导通路在介导胃肠间质瘤发生、发展过程中起重要作用。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白调控前列腺癌22RV1细胞雄激素受体及Akt磷酸化

目的:探索哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTORC1和mTORC2在前列腺癌22RV1细胞增殖及凋亡中的作用。方法:噻唑蓝(MTT)比色法检测mTORC1和mTORC2沉默后前列腺癌22RV1细胞增殖改变;流式细胞术(FCM)检测mTORC1和mTORC2沉默后前列腺癌22RV1细胞凋亡;Western印迹检测mTORC1和mTORC2沉默后前列腺癌22RV1细胞雄激素受体(AR)和Akt磷酸化表达。结果:MTT显示mTORC1沉默后,前列腺癌22RV1细胞的生长率无明显变化(P>0.05),而mTORC2沉默后,细胞的增殖受到了显著抑制(P<0.01);FCM显示mTORC1沉默后,细胞的凋亡率明显增加(P<0.01),而mTORC2沉默后,细胞的凋亡率无明显变化(P>0.05);Western印迹检测显示mTORC1沉默后,前列腺癌22RV1细胞中AR和Akt磷酸化表达显著增加(P<0.05),而mTORC2沉默后则显著抑制了前列腺癌22RV1细胞中AR和Akt磷酸化表达(P<0.05)。结论:mTORC2对于前列腺癌22RV1细胞的存活是必需的,mTORC2有可能成为治疗前列腺癌的一个有意义的靶点。

竹红菌素A通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白依赖途径促进瘢痕疙瘩成纤维细胞自噬的研究

目的:探究竹红菌素A(HA)通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)依赖途径促进瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFs)自噬的作用机制。方法:原代培养KFs并进行传代,将第3代KFs分为对照组、不同剂量HA组(分别予0.125、0.25、0.5、1.0μmol/L HA处理)、si-阴性对照(NC)组、si-NC+HA组(转染NC si RNA+1.0μmol/L HA)及si-磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)+HA组(转染PTEN siRNA+1.0μmol/L HA)。采用CCK8法检测细胞增殖情况;采用酶联免疫吸附试验检测胶原代谢指标Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)的含量;采用western blot检测自噬标志物微管相关蛋白1的轻链3(LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1及m TOR途径中PTEN、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、p-mTOR的表达水平。结果:不同剂量HA组KFs的A_(450)值,Col-Ⅰ、α-SMA、FN含量以及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达水平均低于对照组;而PTEN、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表达水平均高于对照组(P<0.05),且呈剂量依赖性。si-PTEN+HA组KFs的A_(450)值,Col-Ⅰ、α-SMA、FN含量以及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达水平均高于si-NC+HA组(P<0.05);而PTEN、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1表达水平均低于si-NC+HA组(P<0.05)。结论:HA通过调控m TOR途径介导的细胞自噬可抑制KFs增殖。

磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白在卵巢上皮癌组织中的表达及意义

目的探讨磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)在卵巢上皮癌组织中的表达和临床意义。方法采用免疫组化方法检测154例卵巢上皮癌、25例良性上皮瘤和34正常卵巢组织中p-mTOR蛋白表达情况,并分析其与卵巢上皮癌临床病理特征的关系。结果 p-mTOR在卵巢上皮癌组织阳性表达率为53.90%(83/154),在正常卵巢和良性卵巢上皮瘤组织中表达缺失。其中卵巢浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、内膜样腺癌患者组织中的p-mTOR蛋白阳性表达率依次为54.78%、58.33%、40%(P>0.05)。卵巢上皮癌Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期患者中p-mTOR蛋白阳性表达率分别为23.08%和56.03%(P<0.05)。在卵巢上皮癌高、中分化和低分化患者组织中,p-mTOR蛋白阳性表达率分别为53.95%和53.85%,(P>0.05)。结论 p-mTOR在卵巢上皮癌中的高表达与肿瘤性质及发生发展相关,可能成为预测卵巢癌发生进展的新肿瘤标记物和治疗的靶点。

Myc诱导的核抗原通过调控蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/信号通路促进急性髓细胞性白血病细胞增殖

目的探讨Myc诱导的核抗原(Myc induced nuclear antigen,MINA)在急性髓细胞性白血病(AML)中的表达及其对HL-60细胞的增殖影响及其分子机制。方法研究时间为2021年5月至2023年1月。AML数据集来自癌症基因组图谱(TCGA)。通过TCGA数据库下载AML的临床信息和MINA的表达水平。构建MINA基因的过表达慢病毒载体,通过慢病毒感染,建立稳定MINA基因过表达的人原髓细胞白血病细胞(HL-60)细胞系,通过细胞计数法检测其对细胞增殖的影响;蛋白质印迹法检测MINA对HL-60细胞蛋白激酶B(Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化的影响。TCGA数据库分析MINA与mTOR在AML中表达的相关性。结果分析TCGA数据库,结果显示MINA mRNA在AML中表达16.25±0.58明显高于健康对照者10.20±0.29,MINA的表达水平与AML病人预后密切相关,相对于低表达者,高表达MINA的AML癌病人预后较差(HR=2.30,P=0.003)。成功构建稳定MINA高表达的HL-60细胞系,过表达MINA促进HL-60细胞增殖,第6天细胞数过表达组明显高于对照组(P<0.01);过表达MINA可明显增加Akt和mTOR的磷酸化水平,Akt抑制剂哌立福新(Perifosine)可逆转过表达MINA导致的HL-60细胞增殖。MINA与mTOR的表达水平在AML中具有明显的正相关性(r=0.36,P<0.01)。结论MINA在AML病人中高表达,高表达MINA的AML病人预后较差,MINA可能通过调控Akt/mTOR通路促进AML细胞增殖。

靶向调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路对心力衰竭小鼠调节性T细胞/辅助性T细胞17免疫自稳失衡的影响

目的:探究哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的拮抗剂雷帕霉素(RAPA)调节mTOR信号通路对心力衰竭(心衰)小鼠调节性T细胞(Treg)/辅助性T细胞17(Th17)免疫自稳失衡的影响。方法:选用34只健康C57BL/6小鼠,采用冠状动脉左前降支结扎术构建心肌梗死后心衰小鼠模型。按随机数字表法将其随机分为假手术组、心衰组、低剂量RAPA组(RAPAL组)、中剂量RAPA组(RAPAM组)、高剂量RAPA组(RAPAH组),除心梗后心衰造模手术过程中死亡4只,最终每组6只小鼠。假手术组采取同样手术操作但不结扎。采用尾静脉给药的方式,RAPAL组、RAPAM组、RAPAH组的给药剂量分别为1、2、4 mg/(kg·d),其余组尾静脉注射等量生理盐水,持续干预4周。超声心动图检测小鼠心脏结构和功能;苏木素-伊红(HE)染色观察心肌组织病理形态;天狼星红染色观察心肌纤维化程度;流式细胞技术检测外周血Treg、Th17水平;蛋白免疫印迹(Western blot)法检测心肌组织mTOR、磷酸化mTOR(p-mTOR)蛋白表达水平。结果:超声心动图检测发现,与假手术组相比,心衰组左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS)均显著降低(P均<0.01),左心室舒张末期容积(LVEDD)、左心室收缩末期容积(LVEDS)均显著升高(P均<0.05);RAPAL、RAPAM、RAPAH组LVEF、LVFS均显著高于心衰组(P均<0.05)。RAPAM、RAPAH组LVEDS均显著低于心衰组(P均<0.05)。HE染色、天狼星红染色发现,与假手术组相比,心衰组小鼠的心肌组织排列紊乱、断裂,心肌纤维化。与心衰组相比,RAPAL组、RAPAM组、RAPAH组小鼠的心肌组织排列紊乱、断裂,心肌纤维化等现象有所改善;流式细胞技术、Western blot法检测发现,与假手术组相比,心衰组小鼠外周血Treg百分比降低,Th17细胞百分比升高(P<0.01),Treg/Th17比值降低(P<0.01)、心肌组织p-mTOR蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。与心衰组相比,RAPAL组、RAPAM组、RAPAH组小鼠的外周血Treg百分比均升高(P均<0.01),Th17细胞百分比均降低(P均<0.05),RAPAM组、RAPAH组的Treg/Th17比值均升高(P均<0.01),心肌组织p-mTOR蛋白表达水平均降低(P均<0.01)。结论:靶向抑制mTOR信号具有调节心衰小鼠Treg/Th17免疫自稳失衡,改善心肌纤维化及心功能的作用,其中高剂量RAPA的作用最显著。

多囊卵巢综合征患者血清磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白表达及临床意义

目的探讨多囊卵巢综合征(PCOS)患者血清磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)表达水平与血清睾酮(T)水平及胰岛素抵抗(IR)的相关性及临床意义。方法选择2019年1月至2020年7月于新乡医学院第一附属医院妇产科住院的80例PCOS患者为PCOS组,另选择同期于新乡医学院第一附属医院体检的卵巢功能正常的80例女性为对照组。收集2组受试者的一般资料,包括年龄、身高、体质量、腰围、臀围、收缩压、舒张压,并计算腰臀比及体质量指数(BMI);采集2组受试者静脉血,采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法检测血清p-mTOR、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)水平,电化学发光免疫分析法检测血清黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、T、雌二醇(E_(2))、孕酮(P)、泌乳素(PRL)水平,葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖(FPG)水平,电化学发光免疫分析法检测空腹胰岛素(FINS)水平,计算LH/FSH及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);采用t检验比较2组间各指标的差异,Pearson相关分析PCOS患者血清p-mTOR水平与血清T水平、HOMA-IR及BMI的相关性。结果PCOS组患者血清p-mTOR、LH、T水平及LH/FSH、BMI、HOMA-IR值显著高于对照组(P<0.05);PCOS组与对照组受试者的年龄、腰围、臀围、腰臀比、收缩压、舒张压、mTOR、FSH、E_(2)、P、PRL及FPG比较差异无统计学意义(P>0.05);PCOS患者血清p-mTOR水平与血清T水平、HOMA-IR呈正相关(r;=0.076、0.071,P<0.05),与BMI无相关性(r^(2)=0.011,P>0.05)。结论PCOS患者血清p-mTOR表达水平显著升高,且PCOS患者血清p-mTOR与血清T水平及IR呈明显正相关,p-mTOR、T和IR可能协同参与PCOS的发生和发展。

七氟醚联合丙帕他莫对老年患者术后认知功能及磷酸化雷帕霉素靶蛋白/生长因子受体结合蛋白通路的影响

目的探讨七氟醚联合丙帕他莫对老年患者术后认知功能及磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)/生长因子受体结合蛋白(Grb)通路的影响。方法选取2019年1月至2020年12月于南平市第一医院行择期全身麻醉腹腔镜下胆囊切除术老年患者76例为研究对象,采用随机数字表法将其分为观察组和对照组,每组各38例。观察组在麻醉诱导前15 min给予2 g丙帕他莫配伍100 ml氯化钠注射液静脉滴注,对照组仅给予100 ml氯化钠注射液静脉滴注。比较两组患者的手术情况、手术前后简明精神症状量表(MMSE)评分,比较两组患者在麻醉诱导前、术后1、6、12 h(T_(0)~T_(3))血流动力学、血清炎症因子、中枢神经特异蛋白(S100-β)、p-mTOR、Grb水平。结果两组患者的手术时间、输液量及术中出血量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。观察组T_(1)~T_(3)时间点平均动脉压(MAP)、T_(1)的中心静脉压(CVP)、T_(1)、T_(2)的心率和血氧饱和度(SpO_(2))高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者T_(0)~T_(3)时点血清C反应蛋白(CRP)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素8(IL-8)水平呈逐渐升高趋势,而观察组T_(1)~T_(3)血清CRP、IL-4、IL-8低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者T_(1)~T_(3)时的血清S100-β蛋白水平高于T_(0),而观察组T_(1)~T_(3)血清S100-β蛋白水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者T_(1)~T_(3)时血清p-mTOR、Grb蛋白水平高于T_(0)时,观察组T_(1)~T_(3)时的血清p-mTOR、Grb蛋白水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组术后MMSE各项评分高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论给予老年全身麻醉患者丙帕他莫超前镇痛联合七氟醚吸入麻醉,能有效维持围手术期血流动力学稳定,通过影响mTOR/Grb信号通路磷酸化,减轻麻醉后炎症反应,改善术后认知功能。

肝细胞DEP结构域蛋白5/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1信号轴在非酒精性脂肪肝形成中的作用

目的建立肝细胞Dishevelled/Egl-10/pleckstrin(DEP)结构域蛋白5(DEPDC5)基因(Depdc5)肝细胞特异性敲除小鼠高脂喂养模型,探讨DEPDC5/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)信号轴对非酒精性脂肪肝的调控。方法构建肝细胞特异性敲除Depdc5^(flox/flox)模型;Alb-Cre小鼠(LKO),Depdc5^(flox/flox)小鼠(Loxp)作为对照。32只2~3月龄雄性小鼠随机分为高脂LKO组、高脂Loxp对照组、高脂+雷帕霉素LKO组及高脂+雷帕霉素Loxp对照组,每组8只。检测肝脏血清生物化学指标、脂质含量、蛋白、mRNA及病理切片,采用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。结果高脂喂养导致LoxP小鼠肝脏脂肪变性,LKO小鼠肝脏脂肪变性减轻但合并出现肝损伤;雷帕霉素抑制了Depdc5敲除引起的mTORC1通路激活,显著改善Loxp小鼠肝脏脂肪变性,并改善LKO小鼠的肝损伤。结论Depdc5基因敲除能够保护高脂喂养小鼠肝脏脂肪变性,雷帕霉素可以改善DEPDC5缺失诱发的肝损伤。

腺苷酸活化蛋白激酶-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路介导线粒体自噬在男性生殖中的研究进展

线粒体自噬是指细胞利用自噬机制选择性地降解受损或多余线粒体的过程。近年来,有证据表明线粒体自噬在男性生殖中至关重要,其可清除异常的线粒体,从而减少氧化应激并维持生殖细胞的能量稳态。作为调控细胞生长代谢的经典通路,腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路通过产生自噬装置,调控线粒体蛋白,可促进自噬体包裹线粒体等过程,从而介导线粒体自噬。本文对AMPK-mTOR通路在下丘脑-垂体-性腺(HPG)轴中枢水平及性腺水平调节线粒体自噬的机制作一综述,以期为改善精子质量提供新的观点和思路。

口腔鳞状细胞癌中自噬蛋白和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的表达分析

目的比较口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)患者肿瘤及其临近组织的自噬相关蛋白和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)蛋白表达水平,并探讨自噬蛋白与m TOR通路蛋白表达的相关性。方法26例肿瘤标本来源于首都医科大学附属北京口腔医院确诊为OSCC并行病灶切除手术的患者,将标本组织分为3组,其中肿瘤组为肿瘤中心区域组织,正常组为距肿瘤组织边缘2 cm的正常组织,两者之间的组织为交界组。采用免疫荧光实验和蛋白免疫印迹实验检测各组样本的自噬相关蛋白微管蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)Ⅱ和p62的表达水平,采用免疫组织化学染色方法和蛋白免疫印迹实验检测m TOR通路相关蛋白的表达水平,并通过Spermann相关性分析方法探讨自噬相关蛋白与m TOR通路相关蛋白表达水平的相关性。结果免疫荧光实验结果显示,肿瘤组和交界组LC3-Ⅱ和p62的表达水平均高于正常组。蛋白免疫印迹实验结果亦表明,肿瘤组和交界组中LC3-Ⅱ和p62的表达水平均高于正常组(P<0.001),而肿瘤组与交界组LC3-Ⅱ和p62的表达水平之间的差异并无统计学意义(P>0.05)。免疫组织化学结果显示,交界组和肿瘤组的m TOR、4E-BP1的表达及其磷酸化4E-BP1水平均高于正常组。蛋白免疫印迹实验结果表明,交界组m TOR和4E-BP1及其磷酸化水平最高,肿瘤组次之,正常组最低(P<0.01);而p70S6K及其磷酸化水平在各组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Spermann相关性分析结果显示,LC3-Ⅱ与p62的表达水平在肿瘤组和交界组中均呈正相关(P<0.05),m TOR与LC3-Ⅱ和p62的表达水平在肿瘤组和交界组中均呈正相关(P<0.05)。结论OSCC患者的肿瘤中心区域和肿瘤与正常组织交界区域的m TOR通路活跃而自噬流过程受损,靶向抑制m TOR通路为OSCC患者的临床诊疗提供新的建议。

基于腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路探讨柚皮素对视网膜微血管内皮细胞的损伤机制研究

目的 基于腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路探讨柚皮素(NAR)对人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)的损伤机制。方法 将HRMECs随机分为对照组、高糖(HG)组、HG+NAR组(3 mg/L NAR)、HG+激活剂(AICAR)组(1 mmol/L AICAR)、HG+NAR+AICAR组(3 mg/L NAR+1 mmol/L AICAR);除对照组向培养基中加入5 mmol/L的D-葡萄糖处理外,其他各组均向培养基中加入30 mmol/L的D-葡萄糖处理。采用CCK-8及Transwell分别检测细胞增殖及迁移情况;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清液中白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测自噬因子LC3 mRNA、p62 mRNA表达水平;采用蛋白质免疫印迹(Western blot)检测AMPK/mTOR通路及自噬相关蛋白表达水平。结果 与对照组相比,HG组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,LC3 mRNA表达增加,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);与HG组相比,HG+NAR组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,LC3 mRNA表达下降,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达增加,但HG+AICAR组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达增加,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);与HG+NAR组相比,HG+NAR+AICAR组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,LC3 mRNA表达增加,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达下降,差异有统计学意义(P<0.05);与HG+AICAR组相比,HG+NAR+AICAR组细胞活力,迁移数,IL-1β、IL-6和TNF-α水平,p-AMPK/AMPK,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ,LC3 mRNA表达下降,p-mTOR/mTOR、p62蛋白及p62 mRNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 NAR可减轻HG诱导的HRMECs损伤,其机制可能与抑制AMPK/mTOR通路介导的自噬有关。

橘皮素通过腺苷酸活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路调控细胞自噬促进大鼠腹主动脉瘤发生发展的机制

目的探讨橘皮素通过腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路调控细胞自噬促进大鼠腹主动脉瘤(AAA)发生发展的机制。方法选取无特定病原体级SD雌性大鼠45只,其中20只大鼠皮下埋植0.9%氯化钠注射液缓释泵(对照组),剩余25只大鼠皮下埋植血管紧张素Ⅱ缓释泵(AAA组)构建AAA模型。造模过程中AAA组大鼠死亡5只,共20只造模成功。对照组予0.9%氯化钠注射液灌胃,AAA组予橘皮素灌胃1次/d,持续7 d。观察大鼠主动脉血管平滑肌细胞活力、细胞凋亡率、细胞迁移率,比较2组细胞蛋白水平、自噬细胞基因表达量、细胞因子水平及AMPK/mTOR信号通路表达量。结果AAA组细胞活力高于对照组,细胞凋亡率、细胞迁移率均低于对照组(均P<0.05);β-连环蛋白、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)相关X蛋白水平均低于对照组,细胞周期蛋白D1、Bcl-2水平均高于对照组(均P<0.05);Beclin1、Atg4b、Bnip3、Vps34、LC3基因表达量均低于对照组(均P=0.001);白细胞介素6、正常T淋巴细胞表达和分泌的细胞因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子1、单核细胞趋化蛋白1水平均低于对照组(均P<0.05);AMPK、mTOR表达量均高于对照组[(1.61±0.35)比(1.10±0.21)、(2.11±0.14)比(1.13±0.06)](均P=0.001)。结论橘皮素对AAA大鼠细胞蛋白水平、自噬细胞水平及转化生长因子水平有调节作用,其作用机制可能与AMPK/mTOR信号通路调控相关。

红参对卵巢储备功能减退大鼠卵巢储备功能和卵巢组织磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路的影响

目的探讨红参对卵巢储备功能减退(DOR)大鼠卵巢功能的改善作用以及潜在机制。方法2022年8—11月进行DOR大鼠模型建立实验。将48只SD雌性大鼠分为空白组、模型组、模型+雌二醇组以及模型+红参组,每组12只。采用腹腔注射去氧乙烯基环己烯(VCD)225 mg/kg建立DOR大鼠模型。模型组与空白组均给予0.9%氯化钠溶液灌胃,模型组+雌二醇组给予0.15 mg/kg戊酸雌二醇溶液灌胃,模型+红参组给予5 g/kg红参混悬液灌胃,1次/天,共30 d。30 d后比较各组大鼠治疗前后体质量变化;观察卵巢组织病理切片变化;检测血清促卵泡生成素(FSH)、促黄体生成素(LH)、雌二醇、促性腺激素释放激素(GnRH)和抗缪勒管激素(AMH)激素水平变化;蛋白质印迹法检测卵巢组织中磷脂酰肌醇3-激酶p85α(PI3K p85α)、蛋白激酶B(Akt)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白表达量和磷酸化水平。结果用药后,模型+雌二醇组大鼠体质量差值为(15.0±0.7)g高于模型组的(10.9±1.3)g,体质量明显增加(P<0.05)。模型+红参组大鼠体质量差值为(14.9±0.4)g,高于模型组的(10.9±1.3)g(P<0.05),但与模型+雌二醇组的(15.0±0.7)g比较差异无统计学意义(P>0.05)。病理切片显示,模型+雌二醇组和模型+红参组卵泡数量多于模型组,卵巢结构较为清晰,颗粒结构更为紧凑,黄体数量较模型组增多;ELISA实验显示,用药后,模型+红参组和模型+雌二醇组AMH、雌二醇和GnRH明显升高,FSH、LH明显降低(P<0.05),其中模型+红参组激素水平恢复更明显(P<0.05)。蛋白质印迹法显示,与模型组比较,用药后,模型+红参组和模型+雌二醇组p-PI3K p85α、p-Akt和p-mTOR均显著下降(P<0.05);与雌二醇组比较,模型+红参组p-PI3K p85α、p-Akt、p-mTOR水平降低(P<0.05)。结论红参可以有效改善DOR模型大鼠的内分泌,可能通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路参与改善卵巢功能。

间充质干细胞外泌体调节哺乳动物雷帕霉素靶点/p70核糖体蛋白S6激酶/盘卷肌球蛋白样Bcl-2-相互作用蛋白通路改善糖尿病肾病大鼠肾损伤的机制研究

目的探讨间充质干细胞外泌体(MSC-EVs)通过调节哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)/p70核糖体蛋白S6激酶(S6K1)/盘卷肌球蛋白样Bcl-2-相互作用蛋白(Beclin 1)通路改善糖尿病肾病(DN)大鼠肾损伤的机制。方法采用高脂饮食联合腹腔链脲佐菌素(STZ)注射的方法建立SD大鼠DN模型,随机分为模型组、MSC-EVs组、MSC-EVs+MHY1485(mTOR激活剂)组,每组12只。另取12只SD大鼠以正常饲料喂养6周后,腹腔注射同等剂量柠檬酸钠溶液作为对照。以MSC-EVs和MHY1485分组处理后,检测大鼠血糖及肾功能指标[血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、尿微量白蛋白(UmALB)]水平。采用苏木精-伊红(HE)染色检测各组大鼠肾组织病理形态;采用免疫组化检测各组大鼠肾组织mTOR/S6K1/Beclin 1通路相关蛋白表达;采用蛋白免疫印迹法检测各组大鼠肾组织mTOR/S6K1/Beclin 1通路及自噬相关蛋白表达。结果与对照组相比,模型组大鼠肾组织形态发生损伤,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著升高(P<0.05),微管相关蛋白1A/1B轻链3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,MSC-EVs组大鼠肾组织形态损伤减轻,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著降低(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著升高(P<0.05);与MSC-EVs组相比,MSC-EVs+MHY1485组大鼠肾组织形态损伤加重,血糖、BUN、Scr、UmALB、p-mTOR及p-S6K1相对阳性表达、p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1显著升高(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin 1蛋白表达、Beclin 1相对阳性表达显著降低(P<0.05)。结论MSC-EVs可增强自噬,降低DN大鼠血糖、SCr、BUN和尿蛋白水平,减轻肾组织损伤,其机制可能与抑制mTOR/S6K1/Beclin 1通路激活有关。

雷帕霉素通过抑制mTOR活性降低铝引起的磷酸化tau蛋白沉积

目的研究雷帕霉素是否可以通过抑制mTOR活性降低铝暴露引起的p-tau蛋白的沉积。方法24只SD大鼠随机分为四组:对照组、低剂量麦芽酚铝组、中剂量麦芽酚铝组和高剂量麦芽酚铝组。Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆能力;Western blot检测海马组织中p-tau蛋白、p-mTOR和PSD95的变化情况;PC12细胞分为对照组、铝处理组、铝+溶剂对照组、铝+雷帕霉素100 nmol组、铝+雷帕霉素300 nmol组和铝+雷帕霉素500 nmol组,Western blot检测蛋白变化情况。12只大鼠分为铝处理组和铝+雷帕霉素组,Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆能力;Western blot检测海马组织中p-tau蛋白、p-mTOR和PSD95的变化情况。结果水迷宫实验中,铝处理组大鼠的逃避潜伏期均比对照组延长,中、高剂量麦芽酚铝组逃避潜伏期明显低于对照组((35.24±4.78)、(25.92±8.80)vs(20.32±6.04),P<0.001);铝处理组大鼠的目标象限停留时间和穿越平台次数均随着铝剂量的升高而减少(P<0.05)。与对照组比较,铝处理组大鼠的海马组织中,p-mTOR/mTOR和p-tau/tau的水平均明显增高(P<0.05);PSD95蛋白明显降低(P<0.05)。在PC12细胞中,与单独铝处理组相比,雷帕霉素干预组的p-mTOR/mTOR和p-tau/tau的表达均有所减少,尤其在雷帕霉素300 nmol和雷帕霉素500 nmol干预组中,p-tau可恢复至正常对照组水平,PSD95也明显回升(P<0.05)。与单独铝处理组大鼠比较,雷帕霉素干预组的大鼠学习记忆能力明显改善,同时海马组织中p-mTOR/mTOR和p-tau/tau的表达均减少,PSD95也明显回升。结论mTOR磷酸化激活参与了铝引起的p-tau蛋白过度沉积,雷帕霉素可以通过抑制mTOR的磷酸化活性降低磷酸化tau蛋白的沉积。

替米沙坦通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路抑制硬化性胃癌细胞增殖

目的研究替米沙坦对硬化性胃癌(SGC)细胞增殖的影响,并探讨其作用机制。方法常规培养胃癌细胞MKN1和SGC细胞HSC45。采用细胞计数盒8实验检测替米沙坦对MKN1和HSC45增殖能力的影响;流式细胞仪检测替米沙坦对HSC45凋亡和细胞周期的影响;蛋白质印迹法检测激活替米沙坦对HSC45自噬和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白表达的影响;采用PI3K/AKT/mTOR信号通路激活剂SC79和替米沙坦共同处理HSC45,分别检测激活PI3K/AKT/mTOR信号通路后,替米沙坦对HSC45增殖、凋亡、自噬和细胞周期的影响。结果替米沙坦呈浓度和时间依赖性抑制MKN1和HSC45细胞增殖(均P<0.001),且对HSC45细胞增殖抑制效果更为显著(P<0.05)。替米沙坦组HSC45早期凋亡率、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达量、G_(0)/G_(1)期细胞周期比例均高于对照组[(26.2±2.6)%比(1.3±0.4)%、(1.02±0.09)比(0.29±0.04)、(53.4±3.4)%比(38.1±2.9)%],磷酸化PI3K、磷酸化AKT和磷酸化mTOR蛋白表达均低于对照组(均P<0.05)。替米沙坦组和替米沙坦+SC79组HSC45细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达及G_(0)/G_(1)期细胞比例均高于对照组,但替米沙坦+SC79组均低于替米沙坦组(均P<0.05)。结论替米沙坦下调PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进SGC细胞凋亡、自噬和周期阻滞,进而抑制SGC细胞增殖能力。