橘红素上调Cyclin B1和抑制ERK磷酸化诱导人胃癌AGS细胞周期阻滞

目的探讨橘红素对人胃癌AGS细胞增殖和周期的作用及其机制。方法采用MTT法观察橘红素对人AGS胃癌细胞增殖的作用;流式细胞仪检测橘红素对细胞周期的影响;Western blot检测橘红素对Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E1和ERK、p-ERK蛋白表达的影响。结果橘红素可明显抑制AGS胃癌细胞的增殖(P<0.01),呈时间和剂量依赖性。橘红素作用于AGS细胞24 h,S期细胞百分比明显增高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);作用48和72 h,S期阻滞消失,G2/M期细胞百分比增高(P<0.05,P<0.01)。作用48 h,橘红素可上调Cyclin B1蛋白的表达(P<0.05,P<0.01),对Cyclin D1和Cyclin E1蛋白表达无明显影响;对ERK蛋白表达无影响,可降低p-ERK蛋白的表达(P<0.01),且呈剂量依赖性。结论橘红素可明显抑制人AGS胃癌细胞的增殖,使细胞阻滞于S期和G2/M期,主要机制可能是通过抑制ERK磷酸化和上调CyclinB1蛋白表达。

电针胃经穴的大鼠血清上调胃黏膜细胞ERK磷酸化

目的探讨电针胃经穴的大鼠血清对胃黏膜细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化的影响。方法72只大鼠随机分为正常组、模型组、胃经组、胆经组、胃经+PD153035组和胆经+PD153035组,链霉蛋白酶消化法分离胃黏膜细胞,分别用表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂PD153035和100 mL/L血清孵育胃黏膜细胞,W estern b lot检测ERK的磷酸化。结果胃经组和胆经组胃黏膜细胞ERK磷酸化明显高于正常组和模型组(P<0.01);胃经组胃黏膜细胞ERK磷酸化明显高于胆经组(P<0.01);当用PD153035阻断EGFR后,胃经+PD153035组胃黏膜细胞ERK磷酸化明显低于胃经组(P<0.01)。结论电针胃经穴的大鼠血清能上调胃黏膜细胞ERK的磷酸化水平,并且存在经脉-脏腑的特异性联系。

贝母素乙对肺纤维化大鼠肺组织MEK1/2、ERK1/2及其磷酸化的影响

目的探讨贝母素乙对博莱霉素致肺纤维化大鼠肺组织MEK1/2、ERK1/2及其磷酸化的影响。方法大鼠麻醉后,经气管软骨环间隙向心端穿刺,注入博莱霉素5mg/kg建立大鼠肺纤维化模型,假手术组大鼠在同样麻醉条件下气管内注入等容积生理盐水。术后第2天开始每天灌胃给药,假手术组和模型组给予蒸馏水,地塞米松组给予等容积地塞米松蒸馏水溶液,贝母素乙A组、B组分别给予等容积贝母素乙5、2.5mg/kg蒸馏水溶液。灌胃28d后,麻醉并颈动脉取血后处死大鼠,肺组织固定,包埋切片,常规脱蜡,行免疫组化SABC法检测肺组织MEK1/2、ERK1/2水平,Western blot法检测p-MEK1/2、pERK1/2水平。结果贝母素乙可显著降低肺纤维化大鼠的肺组织ERK1/2、MEK1/2水平(P<0.01),与地塞米松作用相似(P>0.05),贝母素乙A组、B组之间比较未见明显差异(P>0.05)。贝母素乙可以显著降肺纤维化大鼠的肺组织p-MEK1/2、p-ERK1/2水平(P<0.01),较地塞米松更为显著(P<0.01),贝母素乙B组较贝母素乙A组更为显著(P<0.01)。结论贝母素乙减轻博莱霉素致肺纤维化大鼠的MEK1/2、ERK1/2及其磷酸化水平可能是其抗纤维化的作用机理之一。

磷酸化ERK,p38MAPK在婴幼儿血管瘤组织中的表达及意义

目的探讨磷酸化ERK和p38MAPK信号通路在小儿血管瘤增生、消退中的作用。方法应用免疫组化SP法检测47例血管瘤(增殖期26例、消退期21例)组织中磷酸化ERK和p38MAPK的表达情况。结果磷酸化ERK阳性定位于细胞核,其在增殖期和消退期的阳性细胞指数分别为(67.71±12.68)%和(21.54±6.85)%;磷酸化p38MAPK阳性定位于细胞核,其在增殖期和消退期的阳性细胞指数分别为(83.78±5.25)%和(57.79±7.63)%;增生期磷酸化ERK与p38MAPK阳性表达呈正相关,而消退期呈负相关。结论磷酸化ERK和p38MAPK参与血管瘤的增生、消退过程;ERK通路可介导内皮细胞的增生和存活,而p38MAPK可能主要在消退期传递内、外源性凋亡信号,诱导内皮细胞凋亡。

丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞侵袭迁移及ERK1/2磷酸化水平的影响

目的研究丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞侵袭迁移以及ERK1/2磷酸化水平的影响。方法采用细胞划痕实验和高内涵细胞成像系统分析丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞迁移的影响;应用实时细胞传感电阻仪Transwell实验动态检测丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞侵袭的影响;通过纳米级超微量蛋白质分析系统检测丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞ERK1/2磷酸化水平的影响。结果丹参-人参组分配伍可显著增加划痕空白区域的距离(P<0.01),且呈一定的时间依赖性;显著降低细胞迁移的面积(P<0.01),且呈一定的剂量依赖性;对A549细胞侵袭有抑制作用(P<0.01),且呈一定的时间依赖性;能够显著降低肺癌A549细胞ERK1/2磷酸化水平(P<0.01)。结论丹参-人参组分配伍能显著降低肺癌A549细胞迁移侵袭的能力,其作用机制可能与降低肺癌A549细胞ERK1/2磷酸化水平有关。

磷酸化Akt和ERK在大鼠腹主动脉瘤中的表达

目的观察磷酸化Ak(tp-Akt)和磷酸化ERK(p-ERK)在大鼠腹主动脉瘤模型中的表达情况,探讨腹主动脉瘤的发病机制。方法构建大鼠腹主动脉瘤模型并测量腹主动脉直径,计算直径扩张度;HE染色观察腹主动脉的病理改变;免疫组织化学技术和Western blot技术检测腹主动脉组织中p-Akt和p-ERK的相对表达量。结果腹主动脉瘤组主动脉扩张度(3.689±0.443)明显高于生理盐水组(1.175±0.159)和正常组(1),差异有统计学意义(P<0.05);HE染色显示,腹主动脉瘤组主动脉结构紊乱并有炎症细胞浸润;免疫组化结果和Western blot结果均显示p-Akt在腹主动脉瘤组中的表达明显高于生理盐水组和正常组(P<0.05);p-ERK表达差异不明显(P>0.05)。在腹主动脉瘤组中,p-Akt表达水平与主动脉扩张度呈正相关,p-ERK表达水平与主动脉扩张度无明显相关性。结论 PI3K/Akt信号通路可能参与腹主动脉瘤的发生与发展。

低氧预适应小鼠脑内ERK1/2磷酸化水平和蛋白表达量的改变

目的:初步探讨细胞外信号调节激酶(Extracellularsignal-regulatedkinases,ERK1/2)在脑低氧预适应发生发展过程中的作用。方法:按已建小鼠整体低氧预适应模型,将BALB/C小鼠(18～22g,雌雄不限)随机分为正常对照(H0)、早期(H1-H4)和延迟性(H5-H6)低氧预适应等7组(每组至少6只动物)。应用SDS-PAGE和Westernblot等生化技术,并结合GelDoc凝胶成像系统,半定量检测小鼠脑组织内ERK1/2的磷酸化水平和蛋白表达量。结果:①早期低氧预适应形成过程中,随低氧暴露次数的增加(H1-H4),小鼠海马和皮层组织内ERK1/2磷酸化水平显著降低(P<0.05,n=6),而ERK1/2蛋白表达量并无显著变化;②延迟性低氧预适应中(H5-H6),小鼠大脑皮层和海马组织内ERK1/2的蛋白表达量显著降低(P<0.05,n=6)。结论:ERK1/2的活性降低(磷酸化水平降低),以及ERK1/2蛋白表达量下调可能分别参与了脑早期低氧预适应和晚期延迟性低氧预适应的发生发展过程。

人参皂苷降低β淀粉样蛋白诱导THP-1单核细胞ERK的磷酸化和细胞因子含量

目的观察人参皂苷对β-淀粉样蛋白(-βamyloid,Aβ)1-40诱导的THP-1单核细胞系表达细胞因子和磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK)的影响。方法用Western blotting方法测定磷酸化ERK的表达,放射免疫法测定细胞培养上清液中的细胞因子IL-1β、IL-8和肿瘤坏死因子(TNF)-α的浓度。结果Aβ刺激组磷酸化ERK和细胞因子IL-1β、IL-8和TNF-α的表达明显高于对照组。人参皂苷(50、100和150 mg/L可减少Aβ诱导THP-1细胞磷酸化ERK和细胞因子IL-1β、IL-8和TNF-α的表达。与模型组比较,人参皂苷治疗组Aβ1-40诱导的THP-1细胞磷酸化ERK和细胞因子(IL-1β、IL-8和TNF-α)的表达明显降低。结论人参皂苷可抑制Aβ诱导的ERK磷酸化,进一步减少细胞因子的产生。

磷酸化ERK1/2对帕金森病模型小鼠黑质半胱氨酸蛋白酶-3表达的影响

目的研究磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)所致帕金森病(PD)模型小鼠黑质中半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3的调控作用。方法建立PD小鼠模型,观察小鼠行为学变化;免疫组化和免疫印迹法检测黑质酪氨酸羟化酶(TH)、caspase-3和p-ERK1/2的阳性细胞数和蛋白表达水平以及caspase-3酶活性改变,并观察给予p-ERK1/2特异性抑制剂U0126对上述变化的影响。结果与对照组相比,模型小鼠出现典型PD症状,TH蛋白水平下降约28.2%(P=0.009),p-ERK1/2、caspase-3阳性细胞及蛋白水平显著增加(P<0.01);经ERK1/2抑制剂U0126处理后,上述变化均显著减轻(P<0.01)。结论 P-ERK1/2对MPTP诱导的PD小鼠黑质caspase-3表达可能有调控作用,U0126对PD小鼠具有一定的神经保护作用。

磷酸化ERK、TGF-β受体Ⅱ和磷酸化Smad2蛋白在食管癌组织中的表达及意义

目的探讨磷酸化ERK(P-ERK)、TGF-β受体Ⅱ(TβRⅡ)和磷酸化Smad2(P-Smad2)蛋白在食管癌发生、发展中的作用。方法采用Western blot技术检测38份手术切除的食管癌标本和12份癌旁组织标本中P-ERK、TβRⅡ、P-Smad2蛋白表达。结果食管癌组织中TβRⅡ、P-Smad2蛋白表达明显低于癌旁组织,P-ERK蛋白表达明显高于癌旁组织,P均<0.05;P-ERK、TβRⅡ、P-Smad2蛋白表达与食管癌患者年龄、性别及肿瘤组织分化程度、淋巴结转移均无明显相关性;P-ERK、TβRⅡ与P-Smad2蛋白表达亦无明显相关性。结论食管癌组织中存在P-ERK、TβRⅡ和Smad2蛋白表达异常;此可能与食管癌的发病有关。

磷酸化ERK1/2对MPTP帕金森病模型小鼠黑质NF-κB p65表达的影响

目的研究磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)所致帕金森病(PD)小鼠模型黑质NF-κB p65的表达调控作用。方法应用MPTP建立PD小鼠模型,观察小鼠行为学变化;采用免疫组织化学和免疫蛋白印迹法观察小鼠黑质抗酪氨酸羟化酶(TH)、NF-κB p65及p-ERK1/2的表达变化;并观察给予ERK特异性抑制剂U0126后对上述变化的影响。结果模型组小鼠于MPTP第3次注射后1h,黑质区p-ERK1/2阳性细胞数多于NF-κB p65阳性细胞,第5次注射后24h,NF-κB阳性细胞增多,p-ERK1/2阳性细胞减少,同时伴有TH阳性神经元丢失;给予ERK特异性抑制剂U0126后,上述变化明显减轻。结论在MPTP所致PD小鼠模型中ERK1/2信号通路可能通过调控NF-κB p65活化从而导致多巴胺能神经元变性丢失。

磷酸化JAK和磷酸化ERK及CyclinD1蛋白表达与舌鳞状细胞癌的关系

目的:探讨磷酸化JAK和磷酸化ERK及CyclinD1蛋白在舌鳞状细胞癌(SCC)发生、发展中的作用及其表达的相互关系。方法:应用免疫组织化学技术,检测舌鳞状细胞癌30例,正常口腔舌黏膜组织20例,轻度上皮异常增生10例,中-重度上皮异常增生20例组织中磷酸化JAK和ERK及CyclinD1蛋白的表达情况。结果:与正常口腔舌黏膜相比,pJAK在舌鳞状细胞癌组织和上皮异常增生组织中阳性率明显增高(χ2=37.54,P<0.01),且舌SCC中pJAK的阳性率又明显高于上皮异常增生(χ2=12.28,P<0.05)。中-低分化鳞状细胞癌中pJAK的染色强度较高分化鳞状细胞癌显著升高(χ2=6.83,P<0.05)。pERK在正常口腔舌黏膜上皮、SCC组织和上皮异常增生组织中的阳性率差异无显著性。在SCC中,pJAK和CyclinD1的阳性强度呈正相关(rs=0.619,P<0.05)。pERK和CyclinD1的阳性强度无相关性(rs=0.231,P>0.05)。结论:SCC的发生与发展可能与pJAK信号传导途径诱导CyclinD1过度表达,从而促使该肿瘤细胞维持高增殖状态有关。ERK信号途径在舌鳞状细胞癌中可能不是主要的致瘤途径。

RGDS肽对离体大鼠血小板聚集和ERK1/2磷酸化的影响

目的观察外源性精-甘-天-丝冬氨酸(RGDS)肽对离体大鼠血小板聚集及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)磷酸化的影响,探讨RGDS肽对血小板聚集的作用与ERK1/2磷酸化表达改变的关系。方法用比浊法测定血小板最大聚集率;Western-blot测定血小板ERK1/2磷酸化表达。结果RGDS肽抑制血小板聚集后伴随ERK1/2磷酸化表达减少。结论ERK1/2通路参与血小板聚集;抑制ERK1/2磷酸化表达可能是外源性RGDS肽抗血栓的机制之一。

小鼠E-W核神经元中磷酸化ERK1/2在异氟醚麻醉-苏醒过程中的表达变化

为了观察小鼠脑内E-W核神经元中磷酸化的ERK1/2(pERK1/2)在异氟醚吸入麻醉-苏醒过程中的表达变化,为探讨E-W核在麻醉效应产生机制中的作用提供形态学证据。我们将36只8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为6组。第1组为清醒对照组(Con);第2、3组为异氟醚麻醉组(Iso-1、Iso-2:分别吸入1.0MAC异氟醚5min和1h);4～6组为异氟醚麻醉苏醒组(W-1、W-2:吸入1.0MAC异氟醚5min后停药2min、30min;W-3:吸入1.0MAC异氟醚1h后停药30min)。用免疫组织化学方法(ABC法)观察各时间点E-W核内pERK1/2阳性细胞并计数;用荧光双重标记法进一步明确pERK1/2阳性神经元的性质。结果显示:正常清醒小鼠E-W核内pERK1/2阳性细胞数量很少(2.2±1.5);异氟醚麻醉过程中pERK1/2表达显著增高(阳性细胞计数,Iso-1∶40.9±8.1;Iso-2∶40.2±9.6,与清醒对照相比,P<0.001);苏醒30min时pERK1/2表达降至正常对照组水平(W-2∶2.1±2.2;W-3∶0.75±1.2)。pERK1/2阳性神经元部分呈促肾上腺皮质激素释放激素(CRF)阳性,部分是乙酰胆碱(ChAT)阳性。上述结果提示,异氟醚麻醉过程中小鼠脑内E-W核神经元被激活,ERK1/2信号通路可能通过兴奋CRF能和Ach能神经元对瞳孔反射及麻醉应激效应进行调控。

间接荧光染色-流式细胞术检测细胞内磷酸化Erk1/2

丝裂源活化的蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinases,MAPKs）家族参与细胞生长、增殖、分化和凋亡等重要过程。MAPK家族成员p42/44MAPK（Erk1/2）在生长因子、细胞因子、营养物质和能量刺激下活化,促进细胞增殖或抵抗凋亡;Erk1/2分子中Thr202和Tyr204位氨基酸残基的磷酸化是其活化的标志[1]。

高密度脂蛋白对ERK1/2表达及其磷酸化的影响

丝裂素活化蛋白激酶是信号从细胞表面转导到细胞内部的重要传递者 ,通过磷酸化活化转录因子而调控特定基因的表达。本实验观察了人高密度脂蛋白对U937细胞信号转导分子ERK1 2表达水平及其磷酸化的影响。人单核—巨噬细胞株U937用含 10 %胎牛血清的RPMI 16 4 0培养基 ,在 5 %CO2 、37℃培养箱中培养。待细胞长至 5× 10 5时 ,换无血清的RPMI 16 4 0培养基 5mL。高密度脂蛋白制备方法 ,取新鲜抗凝血浆 ,用超速离心机进行密度梯度离心 ,收集密度 1.0 6 3～ 1.2 10g cm3组分 ,PBS透析后冷藏备用。SDS PAGE采用 12 %的分离胶 ,浓缩胶的电流为 10mA ,分离胶的电流为 15mA ,每孔加约 5 0 μg的样本。在转膜前 ,每一批样本用考马斯亮蓝R2 5 0染色以检测提取细胞蛋白情况。转膜采用 10 0mA的电流 ,时间为 2h ,膜为聚偏氟乙烯膜 ,用前用甲醇浸泡 10min左右 ,封闭液为Pierce公司产品 ,漂洗液为PBS +5 0 %的吐温 ,一抗稀释度为 1∶2 0 0 ,二抗稀释度为 1∶10 0 0 ,温育时间均为室温 1h ,显色液为Pierce公司产品。其余步骤按常规操作。Westernblot实验结果显示 ,高密度脂蛋白刺激ERK1 2表达 ,并诱导ERK1 2磷酸化水平增加。ERK1 2磷酸化诱导过氧化体增殖物激活型受体γ的磷酸化 。

ERK磷酸化在预测结直肠癌患者预后的价值

目的:通过探索研究ERK磷酸化在预测结直肠癌患者预后的分子标志物中的临床价值。方法:选择佳木斯大学附属第一医院2015-09~2017-01我院普外科收治的临床诊断为结直肠癌的患者。分别采用免疫组化积分法判定癌组织和癌旁正常黏膜组织ERK蛋白磷酸化情况,术后间断随访出院患者的生存质量状态。以术后3个月、6个月、12个月为随访分界点。结果:(1)正常结直肠粘膜组织几乎无ERK磷酸化;(2)高ERK磷酸化状态的结直肠患者生存时间短于低ERK磷酸化患者。结论:P-ERK1/2在结直肠癌组织中表达明显高于癌旁组,表明P-ERK1/2可能与结直肠癌发生、发展有一定相关性。

Ras和磷酸化ERK信号通路参与三氧化二砷逆转耐药作用机制的研究

目的:体外实验研究三氧化二砷(As2O3)对人胃癌阿霉素耐药细胞株(SGC7901/ADM)的逆转耐药机制。方法:MTT法检测磷酸化ERK(p-ERK)激动剂G-CSF作用前后As2O3的逆转耐药倍数;免疫细胞化学法测定As2O3及G-CSF作用前后SGC7901/ADM细胞内Ras和p-ERK的变化;流式细胞仪测定G-CSF和As2O3干预后SGC7901/ADM的细胞周期和凋亡率。结果:SGC7901/ADM对ADM耐药,As2O3可逆转耐药,其中0.5μmol/L As2O3作用48 h后逆转耐药倍数约为6.29。G-CSF干预后,逆转耐药倍数降至4.72;SGC7901/ADM中Ras表达高于亲本细胞株SGC7901/S,而p-ERK无明显差异,As2O3可下调Ras及p-ERK的表达。G-CSF干预后,As2O3下调Ras及p-ERK表达的能力较干预前显著降低。0.1μmol/L和0.5μmol/L As2O3组的G0～G1期细胞比例和凋亡率均显著高于各个对照组;G-CSF干预后同一剂量的As2O3组G0～G1期细胞及凋亡率较干预前均显著降低。结论:As2O3可逆转人胃癌耐药细胞株SGC7901/ADM对ADM的耐药作用,其机制与下调Ras/p-ERK信号传导通路中Ras、磷酸化ERK的表达有关。

磷酸化ERK1/2对MPTP帕金森病小鼠黑质iNOS表达的影响

目的研究磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)所致帕金森病(PD)小鼠模型黑质诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达调控作用,探讨PD中脑黑质多巴胺(DA)能神经元丢失的可能机制。方法建立PD小鼠模型,观察小鼠行为学变化;免疫组化和免疫印迹法检测黑质酪氨酸羟化酶(TH)、iNOS和p-ERK1/2的阳性细胞数和蛋白表达水平的变化,并观察给予人参皂甙Rg1(Rg1)对上述变化的影响。结果模型组小鼠出现典型PD行为学症状。在MPTP第5次注射后7d,与对照组相比黑质区TH阳性神经元数量显著丢失77%(P<0.01),中脑黑质TH蛋白印记表达水平显著降低约75%(P<0.01);Rg1预处理后,PD小鼠行为学症状减轻,与对照组相比TH上述指标分别下降约44%和41%(P<0.01)。MPTP第3次注射后1.5hp-ERK1/2核内始见,至6hiNOS有较高表达。Rg1预处理可显著阻抑p-ERK1/2和iNOS的表达(P<0.01)。Spearman相关性分析,p-ERK1/2和iNOS的表达呈显著正相关(P<0.01)。结论P-ERK1/2可能通过调控iNOS表达进而导致PD黑质DA能神经元丢失,Rg1可能阻抑此通路以保护DA能神经元。