磷酸化ERK1/2对帕金森病模型小鼠黑质半胱氨酸蛋白酶-3表达的影响

目的研究磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶(MPTP)所致帕金森病(PD)模型小鼠黑质中半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3的调控作用。方法建立PD小鼠模型,观察小鼠行为学变化;免疫组化和免疫印迹法检测黑质酪氨酸羟化酶(TH)、caspase-3和p-ERK1/2的阳性细胞数和蛋白表达水平以及caspase-3酶活性改变,并观察给予p-ERK1/2特异性抑制剂U0126对上述变化的影响。结果与对照组相比,模型小鼠出现典型PD症状,TH蛋白水平下降约28.2%(P=0.009),p-ERK1/2、caspase-3阳性细胞及蛋白水平显著增加(P<0.01);经ERK1/2抑制剂U0126处理后,上述变化均显著减轻(P<0.01)。结论 P-ERK1/2对MPTP诱导的PD小鼠黑质caspase-3表达可能有调控作用,U0126对PD小鼠具有一定的神经保护作用。

磷酸化ERK1/2对MPTP帕金森病模型小鼠黑质NF-κB p65表达的影响

目的研究磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)所致帕金森病(PD)小鼠模型黑质NF-κB p65的表达调控作用。方法应用MPTP建立PD小鼠模型,观察小鼠行为学变化;采用免疫组织化学和免疫蛋白印迹法观察小鼠黑质抗酪氨酸羟化酶(TH)、NF-κB p65及p-ERK1/2的表达变化;并观察给予ERK特异性抑制剂U0126后对上述变化的影响。结果模型组小鼠于MPTP第3次注射后1h,黑质区p-ERK1/2阳性细胞数多于NF-κB p65阳性细胞,第5次注射后24h,NF-κB阳性细胞增多,p-ERK1/2阳性细胞减少,同时伴有TH阳性神经元丢失;给予ERK特异性抑制剂U0126后,上述变化明显减轻。结论在MPTP所致PD小鼠模型中ERK1/2信号通路可能通过调控NF-κB p65活化从而导致多巴胺能神经元变性丢失。

间接荧光染色-流式细胞术检测细胞内磷酸化Erk1/2

丝裂源活化的蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinases,MAPKs）家族参与细胞生长、增殖、分化和凋亡等重要过程。MAPK家族成员p42/44MAPK（Erk1/2）在生长因子、细胞因子、营养物质和能量刺激下活化,促进细胞增殖或抵抗凋亡;Erk1/2分子中Thr202和Tyr204位氨基酸残基的磷酸化是其活化的标志[1]。

磷酸化ERK1/2对MPTP帕金森病小鼠黑质iNOS表达的影响

目的研究磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)所致帕金森病(PD)小鼠模型黑质诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达调控作用,探讨PD中脑黑质多巴胺(DA)能神经元丢失的可能机制。方法建立PD小鼠模型,观察小鼠行为学变化;免疫组化和免疫印迹法检测黑质酪氨酸羟化酶(TH)、iNOS和p-ERK1/2的阳性细胞数和蛋白表达水平的变化,并观察给予人参皂甙Rg1(Rg1)对上述变化的影响。结果模型组小鼠出现典型PD行为学症状。在MPTP第5次注射后7d,与对照组相比黑质区TH阳性神经元数量显著丢失77%(P<0.01),中脑黑质TH蛋白印记表达水平显著降低约75%(P<0.01);Rg1预处理后,PD小鼠行为学症状减轻,与对照组相比TH上述指标分别下降约44%和41%(P<0.01)。MPTP第3次注射后1.5hp-ERK1/2核内始见,至6hiNOS有较高表达。Rg1预处理可显著阻抑p-ERK1/2和iNOS的表达(P<0.01)。Spearman相关性分析,p-ERK1/2和iNOS的表达呈显著正相关(P<0.01)。结论P-ERK1/2可能通过调控iNOS表达进而导致PD黑质DA能神经元丢失,Rg1可能阻抑此通路以保护DA能神经元。

丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞侵袭迁移及ERK1/2磷酸化水平的影响

目的研究丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞侵袭迁移以及ERK1/2磷酸化水平的影响。方法采用细胞划痕实验和高内涵细胞成像系统分析丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞迁移的影响;应用实时细胞传感电阻仪Transwell实验动态检测丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞侵袭的影响;通过纳米级超微量蛋白质分析系统检测丹参-人参组分配伍对肺癌A549细胞ERK1/2磷酸化水平的影响。结果丹参-人参组分配伍可显著增加划痕空白区域的距离(P<0.01),且呈一定的时间依赖性;显著降低细胞迁移的面积(P<0.01),且呈一定的剂量依赖性;对A549细胞侵袭有抑制作用(P<0.01),且呈一定的时间依赖性;能够显著降低肺癌A549细胞ERK1/2磷酸化水平(P<0.01)。结论丹参-人参组分配伍能显著降低肺癌A549细胞迁移侵袭的能力,其作用机制可能与降低肺癌A549细胞ERK1/2磷酸化水平有关。

MAPK途径磷酸化在胰岛素样生长因子-1促进人骨髓瘤细胞株KM3增殖中的作用

本研究探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对人骨髓瘤细胞株KM3增殖的影响以及MAPK途径磷酸化在该过程中的作用。采用流式细胞术检测不同浓度的重组人IGF-1处理后KM3细胞周期的变化,Western blot法检测细胞内MAPK信号转导途径主要分子Erk1/2磷酸化在IGF-1刺激及PD98059特异性抑制作用下的改变,TUNEL法检测特异性阻断Erk1/2磷酸化在抑制KM3细胞增殖和诱导凋亡中的作用。结果表明,IGF-1可以显著提高S期和G2/M期的KM3细胞比率和细胞内Erk1/2分子的磷酸化水平,阻断IGF-1引起的Erk1/2磷酸化可以显著抑制KM3细胞的增殖并引起其凋亡。结论:IGF-1引起的Erk1/2分子磷酸化在KM3细胞增殖过程中起着十分重要的作用。

榄香烯对胃癌SGC-7901细胞株ERK1/2通路的影响

目的 探讨榄香烯对人胃癌SGC-7901 细胞株增殖以及对细胞外信号调节激酶（ERK1/2）信号通路的影响,并探讨其可能的作用机制.方法 用不同浓度榄香烯（0.01、0.02、0.04mg/ml）处理胃癌SGC-7901细胞,然后用CCK -8法观察细胞增殖抑制作用,光镜和透射电镜观察细胞形态学改变,Western-blot 法检测磷酸化ERK1/2 的表达水平.结果 榄香烯可抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖,呈浓度和时间依赖性;光镜和透射电镜下可以观察到典型的细胞凋亡形态学改变;榄香烯作用48h后胃癌SGC-7901细胞磷酸化ERK1/2表达水平受到明显抑制,并呈浓度依赖性,各浓度组与对照组比较,差异均有统计学意义（均P＜0.01）.结论 榄香烯可以抑制胃癌SGC-7901 细胞的增殖,诱发其凋亡,作用机制可能为抑制了细胞的ERK1/2 信号通路.

丹芍化纤胶囊对肝纤维化大鼠PDGFR-β和p-ERK1/2的影响

目的:通过观察丹芍化纤胶囊对肝纤维化大鼠PDGFR-β和p-ERK1/2的影响,探索其抗肝纤维化的可能机制.方法:♂SD大鼠55只,体质量180-220g,随机分为正常组、模型组、预防组.除正常组外,其余均采用四氯化碳、高脂饮食及乙醇复合因素复制肝纤维化模型,造模同时预防组每日一次予以0.8 g/kg丹芍化纤自来水悬液灌胃,模型组、正常组予以等体积自来水灌胃,持续8 wk.造模结束后肝组织HE染色病理检查,免疫组化检测肝组织PDGFR-β、蛋白印迹检测肝组织p-ERK1/2在各组表达,生化法检测各组血清透明质酸(HA)、层黏蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PⅢP)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP),计算白球比(A/G).结果:造模8 wk后经病理学证实模型大鼠形成典型的肝纤维化,模型成功.与正常组相比,模型组肝组织PDGFR-β、p-ERK1/2及血清HA、LN、PⅢP均有显著升高,ALB、A/G显著降低(PDGFR-β:184.6±8.5 vs 89.6±5.8,P<0.05;p-ERK1/2:360.0±14.5 vx 15.4±2.1,P<0.05;HA:517.5±91.5μg/L vs 254.4±33.1μg/L,P<0.05;LN:58.4±11.3μg/L vs 37.3±9.8μg/L,P<0.05:PⅢP:36.9±5.6μg/L vs 4.7±1.5μg/L,P<0.05;ALB:27.4±4.9 g/L vs 42.1±1.6 g/L,P<0.05;A/G:0.89±0.08 vs 1.38±0.09,P<0.05);与模型组相比,预防组肝组织PDGFR-β、p-ERK1/2及血清HA、LN、PⅢP均有显著降低,ALB、A/G显著升高(PDGFR-β:91.1±6.3 vs 184.6±8.5,P<0.05;p-ERK1/2:253.8±18.2 vs 360.0±14.5,P<0.05;HA:322.9±41.4μg/L vs 517.5±91.5μg/L,P<0.05;LN:46.0±9.4μg/L vs 58.4±11.3μg/L,P<0.05;PⅢP:14.5±2.4μg/L vs 36.9±5.6μg/L,P<0.05;ALB:37.2±2.8g/L vs 27.4±4.9g/L,P<0.05;A/G:1.18±0.13 vs 0.89±0.08,P<0.05).结论:PDGFR-β及p-ERK1/2在肝纤维化形成中起重要作用,丹芍化纤胶囊具有良好的预防肝纤维化形成的作用,其降低PDGFR-β及p-ERK1/2在肝组织的表达可能是其作用机制之一.

LV-ERK1-RNAi转染人非小细胞肺癌细胞的ERK1/2、DNA甲基转移酶1表达观察

目的观察细胞外信号调节激酶1基因RNA干扰慢病毒载体(LV-ERK1-RNAi)转染后人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞NCI-H1299中细胞外信号调节激酶1(ERK1)、ERK2、DNA甲基转移酶1(DNMT1) mRNA及ERK1、磷酸化ERK1(p-ERK1)、DNMT1蛋白表达情况。方法体外培养NCI-H1299细胞,将细胞随机分为3组,KD组和NC组细胞分别转染LV-ERK1-RNAi、阴性对照病毒,CON组不作处理。转染72 h后,采用荧光显微镜观察细胞荧光率,实时荧光定量基因扩增法检测细胞中ERK1/2、DNMT1 mRNA,蛋白免疫印迹法检测细胞中ERK1、p-ERK1、DNMT1蛋白。结果空白对照组细胞无绿色荧光蛋白表达,阴性对照病毒组、LV-ERK1-RNAi组转染效率达80%以上。与NC组、CON组比较,KD组ERK1、DNMT1 mRNA及ERK1、p-ERK1、DNMT1蛋白表达下降(P均<0. 05)。结论 LV-ERK1-RNAi转染后NCI-H1299细胞ERK1、DNMT1 mRNA及ERK1、p-ERK1、DNMT1蛋白表达降低,ERK2表达正常,表明LV-ERK1-RNAi特异敲低ERK1而调控DNMT1的表达。

Nampt对ERK1/2的调控在病理性心肌肥大中的作用研究

目的研究烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt)调控细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)在病理性心肌肥大中的作用和机制。方法采用苯肾上腺素(PE)刺激原代心肌细胞24 h,在细胞水平上建立心肌细胞肥大模型;SD大鼠连续3周皮下注射ISO,或进行腹主动脉结扎(AAC)8周诱导心肌肥大或心衰模型。采用Western blot检测蛋白变化;RT-qPCR检测mRNA变化;采用质粒瞬时转染过表达Nampt;而加入干扰RNA降低其表达,或使用FK866来抑制其酶活性。结果在细胞水平成功建立心肌肥大模型,在整体动物水平成功诱导心肌肥大和心衰模型,均发现Nampt的mRNA和蛋白表达水平上调;过表达Nampt可缓解PE导致的NAD^(+)含量降低、ERK1/2磷酸化水平增加及心肌细胞肥大反应;敲低Nampt或抑制其酶活性则显示相反的效应。结论Nampt可能通过上调NAD^(+)并抑制ERK1/2磷酸化,从而发挥抗心肌肥大的作用。

晚期糖基化终末产物激活ERK1/2信号通路参与人主动脉血管平滑肌细胞增殖

目的:探究细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)磷酸化在晚期糖基化终末产物(AGEs)刺激下人主动脉血管平滑肌细胞(HAVSMCs)增殖的作用。方法:CCK8法检测不同浓度AGEs对HAVSMCs增殖及PD98059对AGEs诱导的HAVSMCs增殖的影响。流式细胞仪检测经相应处理后细胞周期转换。Western Blot检测相关蛋白表达。结果:10 mg/L AGEs显著促进了HAVSMCs的增殖和DNA合成;PD98059(40μmol/L)能显著抑制AGEs诱导的HAVSMCs增殖及其周期的演进。p-ERK1/2,PCNA受AGEs调控,表现出时间和剂量依赖性。结论:AGEs激活ERK1/2信号通路参与HAVSMCs增殖。

氟西汀和阿米替林对大鼠强迫游泳试验的行为表现及脑内信号分子ERK1／2磷酸化水平的影响

目的观察氟西汀和阿米替林对大鼠强迫游泳试验中各种行为表现及脑内信号分子细胞外调节蛋白激酶（ERK1／2）磷酸化水平的影响。方法30只雄性SD大鼠先预游15min，间隔23h后，按随机数字表法分成3组：氟西汀组、阿米替林组和对照组，每组各10只。氟西汀、阿米替林按20mg／kg腹腔注射给药．对照组腹腔注射等体积的蒸馏水，1h后进行5min的游泳测试，录像并记录出现不动行为的潜伏期和不动、游泳及攀抓行为的时间。游泳完毕后将大鼠灌流处死，对脑组织进行磷酸化ERK1／2（pERK1／2）免疫组织化学染色，观察pERK1／2阳性神经元在部分脑区的分布。结果（1）阿米替林组不动行为潜伏期明显长于对照组，攀抓行为时间明显长于对照组和氟西汀组．不动行为时间明显少于对照组；氟西汀组游泳行为时间明显长于对照组和阿米替林组；以上差异均有统计学意义（P〈0．05）。（2）氟西汀组前额皮质、扣带回及边缘前皮质脑区中pERK1／2阳性神经元数目较对照组和阿米替林组明显减少；阿米替林组腹外侧隔核中pERK1／2阳性神经元数目较对照组明显减少：两给药组下丘脑室旁核中pERK1／2阳性神经元数目较对照组均明显减少，其中阿米替林组减少幅度更大；以上差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论阿米替林和氟西汀能对大鼠强迫游泳试验的行为表现产生不同影响，二者可能都有降低负性心理应激反应的作用，脑内ERK1／2信号通路可能参与其中。

阻断PD-L1在增强奥沙利铂治疗原发性肝细胞肝癌疗效中的实验研究

目的初步探讨阻断程序性死亡-配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)在增强奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)治疗原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)疗效中的作用及其分子机制。方法 L-OHP处理人HCC细胞系HepG2后,q RT-PCR和Western blot检测PD-L1在m RNA及蛋白水平的表达变化,以及细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)磷酸化水平的改变;建立Hepa1-6细胞C57BL/6J小鼠HCC移植瘤模型,随机分为对照组、L-OHP组、PD-L1单抗组、L-OHP+PD-L1单抗组,计算处理后各组小鼠肿瘤的质量、抑制率和生存时间;体外刺激或抑制HepG2细胞系ERK1/2的磷酸化,L-OHP处理后q RT-PCR和Western blot检测PD-L1的表达变化。结果 L-OHP能显著抑制HepG2细胞系的生长,其IC50分别为20.94 mg/L;L-OHP处理HepG2细胞后,p-ERK1/2和PD-L1的表达量均高于对照组(P<0.05)。小鼠HCC移植瘤模型中,与对照组、L-OHP组和PD-L1单抗组相比较,L-OHP+PD-L1单抗组的肿瘤质量显著减小(P<0.05),肿瘤抑制率大幅提升(P<0.05),生存时间明显延长(P<0.05)。体外刺激ERK1/2的磷酸化后,PD-L1表达显著上调,而抑制HCC细胞株ERK1/2的磷酸化后,L-OHP诱导PD-L1表达升高效应明显受到抑制。结论 L-OHP能通过提高ERK1/2磷酸化水平上调HCC细胞的PD-L1表达,从而导致治疗失败,而联合PD-L1单抗可显著增强L-OHP的抗HCC作用。

BAMBI通过促进ERK1/2磷酸化抑制猪前体脂肪细胞分化

为了研究BAMBI在猪前体脂肪细胞分化过程中的作用,构建了BAMBI慢病毒干扰载体,包装并感染猪前体脂肪细胞,采用油红O染色、油红O提取比色法检测猪前体脂肪细胞分化情况,采用Real-time qPCR、Western blotting检测成脂标志基因mRNA以及蛋白水平表达的变化情况。结果表明,BAMBI慢病毒干扰载体感染前体脂肪细胞后显著降低了BAMBI的表达,shRNA2干扰效率最高,达到了60%以上,干扰BAMBI后能增加猪脂肪细胞的脂质积累,增加了成脂标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)和脂肪酸结合蛋白2(Adipocyte protein 2,ap2)的表达。此外,干扰BAMBI后ERK1/2的磷酸化水平减少了。这些结果表明,BAMBI可能通过促进ERK1/2的磷酸化抑制脂肪细胞分化。

单增李斯特菌溶血素O的PEST序列激活ERK1/2磷酸化的作用

[目的]本研究旨在构建单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌)溶血素O(Listeriolysin O,LLO)的关键结构域PEST序列(包含S44、S48和T51关键磷酸化位点)突变体,并针对其生物学功能展开研究。[方法]以李斯特菌参考菌株EGD-e为模板扩增编码LLO的hly基因,克隆至pET30a(+)原核表达载体,在此基础上利用氨基酸突变技术获得表达PEST突变体(LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A)的重组质粒,转入E.coli Rosetta感受态细胞中,诱导表达重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后进行SDS-PAGE分析。利用红细胞裂解试验检测重组蛋白的溶血活性,并通过Western blotting检测重组突变蛋白刺激Caco-2细胞后对MAPK关键信号分子ERK1/2磷酸化水平变化的影响。[结果]结果显示,本研究成功获得重组LLO及其突变体蛋白LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A。在pH5.5和7.4条件下,LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A均具有和LLO相当的溶血活性,说明PEST序列缺失或突变并不影响LLO的膜裂解活性。研究进一步发现,重组LLO及其突变蛋白刺激Caco-2细胞后均能激活ERK1/2的磷酸化。[结论]研究表明LLO的关键结构域PEST序列对于维持该蛋白的膜裂解能力及穿孔活性并非必需,且该结构域的缺失不影响李斯特菌在感染宿主时依赖LLO介导ERK1/2磷酸化的生物学过程。本研究将为进一步探索细菌感染过程中PEST序列对于LLO发挥生物学功能的潜在作用及分子机制奠定基础。

人胃癌组织内神经纤维发生可塑性改变的研究

背景与目的:前期研究发现人胃癌组织内存在着较正常组织更多的P物质免疫阳性神经纤维,这些神经与胃癌的关系尚不清楚。本文通过免疫组化技术研究人胃癌组织内P物质免疫阳性神经纤维的分布特点及其功能状态。方法:34例胃癌组织标本进行免疫组织化学染色,检测胃癌组织内磷酸化细胞外信号调节激酶(P-ERK1/2)阳性神经纤维和细胞的分布;免疫细胞化学染色检测胃癌组织和培养的胃癌细胞神经生长因子表达状况。结果:在胃癌组织内可见大量磷酸化ERK1/2免疫阳性反应的神经纤维,呈束状或串珠状走行,并可见呈巢状分布的P-ERK1/2免疫阳性反应细胞。神经纤维主要分布在P-ERK1/2免疫阳性细胞的四周并与这些细胞相毗邻。在胃癌组织有大量表达神经生长因子(NGF)的细胞,体外培养的低分化胃癌细胞系(MNK45)高表达神经生长因子(NGF)。结论:胃癌组织内有大量的呈向心性分布的神经纤维,这些神经发生了可塑性改变。这些神经纤维可能对胃癌细胞的增殖起调控作用。

溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜pMEK1/2、pERK1/2蛋白水平动态变化的影响

目的:观察溃结灵对TNBS法UC大鼠模型结肠粘膜pMEK1/2、pERK1/2蛋白水平的影响。方法:UC大鼠模型采用TNBS法,提取结肠粘膜全细胞蛋白,运用蛋白免疫印迹(Western blot)方法对pMEK1/2和pERK1/2的蛋白表达水平进行检测。结果:与正常组比较,3d时模型组pMEK1/2、pERK1/2蛋白相对含量略有升高,7d时pMEK1/2、pERK1/2均持续增高,14d时pMEK1/2、pERK1/2均明显增高。与模型组比较,3d时溃结灵组和SASP组pMEK1/2,pERK1/2蛋白相对含量均略有增高,7d时溃结灵组及SASP组pMEK1/2、pERK1/2均持续增高(P<0.05,P<0.01,P<0.05),14d时溃结灵组及SASP组均明显高于模型组(P<0.05,P<0.01)。结论:溃结灵对TNBS法UC大鼠模型结肠粘膜pMEK1/2、pERK1/2蛋白表达有上调作用,提示MEK/ERK信号通路可能是溃结灵修复UC大鼠模型肠道损伤粘膜的途径之一。

缺氧复氧诱导脐静脉内皮细胞凋亡的机制

目的探讨缺氧复氧诱导人脐静脉内皮细胞凋亡发生的机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞,随机分为5组缺氧0h(对照组)、3h、6h、12h、24h复氧组。向培养瓶内通入95%N2和5%CO2按不同时间孵育,随后通入5%CO2和95%空气复氧2h,建立内皮细胞缺氧复氧模型。采用台盼蓝染色、TUNEL技术对凋亡和死亡细胞进行定量分析,DNA电泳观察内皮细胞凋亡的形态学。Westernblot检测细胞凋亡调节蛋白Bcl2和Bax表达强度,同时检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)中磷酸化ERK1/2的表达。采用凝胶成像分析系统灰度扫描检测蛋白质表达相对量。结果缺氧复氧后内皮细胞凋亡明显,而且内皮细胞凋亡数随缺氧时间延长而增多(P<005)。Westernblot表明缺氧复氧增强内皮细胞Bax的表达,对Bcl2的表达量和磷酸化ERK1/2没有明显影响,使Bcl2/Bax比值减小。结论缺氧复氧可以诱导内皮细胞凋亡,证实缺氧复氧上调促凋亡蛋白Bax的表达,对抑制凋亡蛋白Bcl2的表达无显著影响。首次证实缺氧复氧诱导内皮细胞凋亡是取决于Bcl2/Bax比值,而不是通过MAPK磷酸化途径。