植物海藻糖-6-磷酸合成酶基因研究进展

海藻糖-6-磷酸代谢通路是植物响应非生物胁迫生理调控网络中的重要组成部分,海藻糖-6-磷酸合成酶基因TPS(Trehalose-6-phosphate synthase)是植物合成海藻糖的关键基因。为了更加充分地理解TPS基因在植物应答非生物胁迫、调节开花时间等方面的作用,本文首先对植物TPS基因家族成员的系统进化关系及序列结构信息进行了研究,重点论述了TPS基因在植物响应干旱、盐害、高温、低温胁迫中的调控功能及分子作用机制,最后对TPS基因参与植物开花调控的研究进展进行了综述。本文深入总结了目前植物TPS基因响应非生物胁迫及开花调控的研究进展,并对今后TPS同源基因的研究方向和应用价值进行了展望。

甜瓜果实蔗糖磷酸合成酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

根据在GenBank中登录的番茄、马铃薯等蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法从甜瓜花后25d的果实总RNA中扩增出目标cDNA片段,克隆到pMD18-T载体中。序列分析表明,该片段与番茄蔗糖磷酸合成酶氨基酸序列同源性为98.9%,GenBank中登记号为DQ355797。通过Northernblot检测其在甜瓜果实不同发育时期的表达变化,结果表明该基因在甜瓜果实花后25d开始表达,随着果实的成熟,表达量升高。

甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因启动子遗传转化烟草的研究

蔗糖磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthase,SPS)是调节甘蔗蔗糖合成的关键酶之一.根据课题组已经构建的甘蔗SPS5侧翼序列驱动GUS表达的载体,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法,转化模式植物烟草,获得26棵抗性植株.抗性植株的PCR结果表明,获得3株转基因植株.GUS染色分析说明,SPS的5侧翼序列可以驱动GUS基因表达,SPS的5侧翼序列具有启动子活性.

甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因中间缺失突变体的构建

根据NCBI中EU278617序列设计引物,利用甘蔗SPSG2菌液为模板,扩增SPS8-11并克隆到T载体后测序.通过排除野生型DNA的定点突变PCR方法获得SPS8-11中第8内含子缺失TGCATG的突变体pMD-SPS8-11-A,酶切后测序鉴定.成功构建了甘蔗SPS8-11中间缺失突变体pMD-SPS8-11-A.

香蕉海藻糖-6-磷酸合成酶基因MaTPS2克隆及表达特性分析

在获得MaTPS2基因全长序列的基础上,采用同源序列比对、聚类分析、实时定量PCR等技术初步探讨香蕉MaTPS2基因的功能。从香蕉A基因组中获得一条3 277bp MaTPS2全长序列,包含一个完整的开放阅读框1 344bp,编码蛋白含447个氨基酸。其氨基酸理化性质分析表明,MaTPS2蛋白属于不稳定疏水性蛋白,具有一个结构域GT1-TPS。通过与已知植物的TPS氨基酸同源序列比对,同源性达77.95%。系统发育树进化关系分析表明,MaTPS2编码的氨基酸序列与银杏TPS氨基酸序列(AAX16014.1)邻近,说明二者的亲缘关系较近。器官特异性分析表明,MaTPS2在香蕉植株的根、球茎、假茎、叶、花各器官中均有表达,其中在球茎、假茎和叶中表达量较多,在果实中表达量较低。在ABA、干旱、盐害和枯萎病菌胁迫处理下,MaTPS2表达量升高,在ACC胁迫处理下,MaTPS2表达量显著下降,而低温胁迫条件下,MaTPS2表达不响应。由此推导,MaTPS2可能参与调控香蕉抗旱、抗病机制。植物生长调节剂ACC和ABA胁迫处理说明MaTPS2的表达可能受激素蛋白间接调控。

卷叶贝母1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因的克隆与表达分析

【目的】MEP途径是合成生物碱、萜类物质前体的重要途径之一,1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS)是MEP途径中的第1个限速酶。为了解卷叶贝母DXS的结构和功能特点,本研究利用分子生物学手段对其进行分析,以期为贝母生物碱合成途径研究打下基础。【方法】采用PCR技术克隆卷叶贝母FcDXS基因开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)序列,运用生物信息学方法对其进行序列分析,预测其潜在的功能。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测FcDXS基因在野生状态(根、茎、叶、鳞茎)和组培诱导物(愈伤组织)中的表达情况。【结果】获得了2151 bp FcDXS基因ORF片段,编码716个氨基酸,并与NCBI公布的砂仁等植物DXS蛋白相似性达80%以上;在Fc DXS蛋白的二级、三级结构预测中,得出Fc DXS蛋白主要由α螺旋构成; qRTPCR检测结果表明FcDXS基因在野生状态下鳞茎表达量最高,激素诱导状态的愈伤组织表达量则是野生鳞茎的5倍。【结论】Fc DXS蛋白质特征区及同源性等生物信息学分析表明该蛋白的结构域较保守,结合荧光定量分析结果证明,Fc DXS是一个有生物学功能且受激素诱导表达的蛋白质。本研究为后续利用基因工程手段提高卷叶贝母生物碱含量奠定了理论基础。

茶树海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因家族鉴定与表达分析

【目的】海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是植物体内海藻糖生物合成通路中的关键酶。对茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]TPS基因家族进行鉴定和分析,并研究其在逆境胁迫下的表达模式,为开展TPS基因功能验证提供基础。【方法】利用生物信息学方法鉴定茶树CsTPS基因家族成员,分析其编码的蛋白理化特性、保守基序与结构域、染色体定位、系统进化关系和启动子顺式作用元件等生物学信息,利用转录组数据结合RT-qPCR技术分析CsTPS家族成员在干旱、盐和低温胁迫下的表达模式。【结果】在茶树基因组中鉴定到16个TPS基因家族成员,系统发育分析将它们划分为Class I和Class II两个亚族。同一亚族成员具有相似的motif组成和基因结构。共线性与进化分析表明,CsTPS基因在茶树基因组内发生了基因复制事件,且它们在进化过程中经历了纯化选择作用。RT-qPCR结果显示,6个候选基因CsTPS3、CsTPS5、CsTPS6、CsTPS9、CsTPS11和CsTPS14均被PEG、NaCl和低温胁迫诱导,且表达模式与转录组结果一致。【结论】从茶树全基因组中系统鉴定出16个TPS家族成员。茶树CsTPS3、CsTPS5、CsTPS6、CsTPS9、CsTPS11和CsTPS14基因对干旱、盐和低温胁迫均有响应,但其敏感性水平各不相同。

甘蔗蔗糖磷酸合成酶SPS Ⅲ基因表达分析

为探讨蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,简称SPS)对甘蔗糖分代谢的重要影响,以4个甘蔗品种桂糖28号(GT28)、果蔗Badila、新台糖20号(ROC20)、新台糖22号的+1、0叶(最高可见肥厚带的第1张完全展开叶为+1叶,自下而上位于+1叶之上的为0叶)、幼嫩叶鞘、幼茎等部位为材料,采用半定量RT-PCR技术分析甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因(简称SPSⅢ)在工艺成熟期不同部位中的表达情况。结果表明,在工艺成熟期间,SPSⅢ在4个甘蔗基因型的+1、0叶、幼嫩叶鞘和幼茎中均有表达,表达量因基因型及测定部位与时期不同而不同;在工艺成熟初期,以GT28的4个部位较其他3个品种的低,而在果蔗Badila的4个部位中表达较稳定,在ROC20中以嫩叶鞘表达最高,而在ROC22中以幼茎表达最高,在工艺成熟中期,SPSⅢ在4个甘蔗基因型中的+1、0叶、幼嫩叶鞘和幼茎中的表达较初期没有明显差异;在工艺成熟后期,SPSⅢ在4个甘蔗基因型中的+1、0叶、幼嫩叶鞘和幼茎中的表达较前2个时期迅速提高,均达到了较高的表达水平。

黑莓果实发育过程中蔗糖磷酸合成酶基因的表达分析

【目的】蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase,SPS)是调控植物蔗糖代谢合成的关键酶,在植物光合产物的积累与分配方面有重要作用。本研究旨在探讨黑莓3个SPS基因的系统发育关系、编码的蛋白特性、在不同发育时期、不同组织中的时空表达特性,并分析其与黑莓发育的关系。【方法】以黑莓栽培品种‘宝森’(‘Boysenberry’)为试材,从中克隆和鉴定了3个SPS基因家族成员,利用生物信息学和荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)等方法对3个黑莓SPS基因RuSPS1、RuSPS2和RuSPS3的氨基酸序列、保守作用元件、编码的蛋白特性、蛋白结构及进化关系进行分析,并对这3个基因在黑莓中的时空表达情况与酶活性进行了相关性分析。【结果】多重氨基酸序列比对显示,黑莓SPS蛋白具有植物SPS家族特有的2个保守蛋白结构域及2个相对保守的蛋白磷酸位点;系统进化分析表明,RuSPS基因分为A、B两个亚族,其中RuSPS1和RuSPS3为A亚族成员,RuSPS2为B亚族成员;保守作用元件分析表明,除RuSPS2含基本的蛋白保守元件外,RuSPS1和RuSPS3都存在不同程度的片段缺失;序列分析和比较揭示了黑莓SPS基因与其他家族的不同特征。qRT-PCR分析显示,3个RuSPS基因在黑莓各个组织器官中均有表达,其中RuSPS1在叶片和果实中表达量较高,在花中的表达量较低;RuSPS2在发育成熟的果实中有大量的表达,在其他器官中表达量较低;RuSPS3在各器官中的表达均较高,说明SPS基因表达具有明显的组织特异性,3个RuSPS基因都随着果实发育进程在果实和叶片中表现了表达增加的趋势。果实和叶片中SPS酶活性的变化与RuSPS基因表达水平一致。相关分析表明,叶片中SPS活性与RuSPS2显著正相关(P<0.05),果实中SPS活性与RuSPS1显著负相关(P<0.05)。【结论】3个RuSPS基因与黑莓果实发育过程中的蔗糖合成与代谢关系密切,均参与了黑莓的生长发育调控,其中叶片中SPS活性的变化一定程度上是由RuSPS2调控,果实中SPS活性的变化则是由RuSPS1调控。

蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因克隆与表达研究进展

蔗糖是植物中重要的代谢产物,它直接或间接参与多种生理生化反应,研究其含量的变化规律对提高植物生物学产量和增强植物抗逆性具有重要的指导意义。蔗糖磷酸合成酶(SPS)是蔗糖代谢的关键酶之一,它催化蔗糖代谢中的限速反应,SPS基因在分子水平编码调控SPS。研究SPS基因克隆与表达规律是从分子水平揭示蔗糖代谢的基础。本文综述了近年来SPS基因克隆和表达研究进展,并展望了SPS基因的研究前景和应用前景。

香蕉海藻糖合成酶基因(MaTPS5)生物学及表达特性分析

通过研究香蕉Ma TPS5基因的生物学功能,探讨海藻糖合成酶基因在香蕉植株抗逆反应中的作用。利用随机克隆测序法从香蕉根系转录组中获得海藻糖合成酶基因,命名为Ma TPS5。生物信息学分析表明,Ma TPS5全长c DNA序列3 081 bp,完整开放阅读框2 559 bp,编码852个氨基酸;Ma TPS5蛋白属于不稳定、疏水性蛋白,等电点p I6.52,有两个结构域GT1-TPS和TPP,定位于细胞质中,含2个跨膜区域,不存在信号肽;与已知植物TPS氨基酸序列同源性达到77.31%;进化分析表明,香蕉Ma TPS5氨基酸序列与野蕉TPS氨基酸序列聚为一类,说明二者亲缘关系较近,具有共同的祖先。组织特异性表达研究表明Ma TPS5在球茎、叶、花中表达量较高,在根中表达量最低。q RT-PCR分析表明,Ma TPS5响应激素ACC和盐的处理,表达量在24 h均达到极显著水平。在Foc TR4病原菌处理后,表达量升高,并在3个时段保持一致。结果表明,Ma TPS5可能依赖乙烯信号传导途径诱导自身表达,合成海藻糖,参与香蕉抗逆反应。

环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激因子信号通路与非感染性炎性疾病的相关性研究进展

作为胞质中的DNA感受器,环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶(cGAS)能够识别细胞质内的异常DNA,激活干扰素基因刺激因子(STING),影响机体的免疫反应。近年研究发现在非感染性炎性疾病中该通路可通过促进Ⅰ型干扰素和干扰素刺激基因的表达发挥作用。本文就cGAS-STING通路在多个系统的非感染性炎性疾病中的激活与调控及其对疾病的发生发展的影响进行综述,为其在非感染性炎性疾病相关的应用研究提供借鉴。

环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激蛋白信号通路与细胞自噬和凋亡及慢性阻塞性肺疾病的相关性研究

细胞自噬和凋亡与肺纤维化、肺动脉高压、肺癌、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等疾病密切相关。肺上皮细胞中Ⅰ型干扰素(IFN)的高表达可能是引起细胞自噬和凋亡从而导致COPD发生发展的重要因素。本文就环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激蛋白信号通路调控Ⅰ型IFN的表达并诱导细胞自噬和凋亡及其与COPD的关系进行综述。

1例新生儿期发病氨甲酰磷酸合成酶1缺乏症的诊断方法

目的总结新生儿期发病的氨甲酰磷酸合成酶1缺乏症(CPS1D)的诊断方法。方法对1例新生儿期发病的CPS1D患儿的临床资料作回顾性分析。结果患儿女,出生第3天表现为发热、反应低下、嗜睡及血氨水平升高。患儿CPS1基因存在复合杂合突变,分别为第19号外显子chr2:211473230位置c.2238C>T(p.R780C),可导致第780位氨基酸由精氨酸突变为半胱氨酸;第3号外显子chr2:211441171位置c.338A>T(P.D113V),可导致第113位氨基酸由天冬氨酸突变为缬氨酸。患儿母亲存在CPS1基因第19号外显子chr2:211473230位置c.2238C>T(p.R780C)变异,患儿父亲存在第3号外显子chr2:211441171位置c.338A>T(P.D113V)变异。根据临床表现、实验室检查及基因检测结果,患儿明确诊断为CPS1D。结论新生儿期发病的CPS1D患儿主要临床表现为反应低下、意识障碍、血氨水平升高,患儿存在CPS1基因第19号外显子chr2:211473230位置c.2238C>T(p.R780C)、c.338A>T(P.D113V)复合杂合突变,患儿CPS1基因复合杂合突变分别遗传自患儿父、母。血、尿氨基酸实验室检查联合基因检测可明确CPS1D诊断。

植物萜类合成关键基因DXS研究进展

萜类物质是自然界中广泛存在的一类天然化合物,对植物、动物和人类都有重要价值。1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)对萜类物质合成调控起关键作用,是2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途径的第一个酶,也是该途径的一个限速酶,亚细胞定位于类囊体中,具有质体转运肽序列和3个功能结构域:TPP结合结构域、转酮醇酶结构域和嘧啶结合结构域,可用高效液相色谱法测定其活性。目前已从178种植物中克隆分离到DXS基因,按蛋白同源性可分为3类:DXS1、DXS2和DXS3。DXS基因表达具有组织特异性、昼夜节律性,与花朵、果实发育程度和品种有关。转外源或内源DXS基因的植株过表达或抑制表达都会引起植物光合色素(如叶绿素和类胡萝卜素)、内源激素(如脱落酸和赤霉素)和单萜等萜类物质含量的改变。重点综述了DXS蛋白的特性、基因的类型、基因表达、调控和遗传转化方面的研究进展,以期为植物育种和代谢调节提供理论和实践参考。

枇杷果实蔗糖磷酸合酶基因cDNA片段的克隆及表达分析

根据GenBank中已登录的多种植物的蔗糖磷酸合成酶基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法,从枇杷果实中扩增出该基因的cDNA片段并测序,分别为386 bp和383 bp。序列分析表明,枇杷果实蔗糖磷酸合成酶基因与桃果实蔗糖磷酸合成酶基因相似性达91%。半定量RT-PCR分析表明,该基因在枇杷果实生长发育过程中的表达量逐渐增加。所得基因片段已在GenBank中注册,386 bp和383 bp登记号分别为HM122759和HM146926。

PRPS1基因p.C60Y新突变导致CMTX5综合征型聋的临床表型及分子病因学研究

目的研究一个中国汉族X连锁Charcot-Marie-Tooth病5型(CMTX5)综合征型听力损失家系的临床表型和分子病因。方法分析一个中国汉族CMTX5综合征型听力损失家系的调查资料、临床检查结果和遗传学特征,提取家系成员的外周血DNA,应用高通量测序筛选出候选致病基因,然后利用Sanger测序进行验证,确定病因,逆转录荧光定量PCR检测PRPS1基因mRNA在先证者外周血的表达水平。结果该家系共2代4人,先证者(Ⅱ-2,6岁)为先天性感音神经性听力损失及运动神经障碍的CMTX5典型临床表型,但视力正常。全基因组测序发现一个尚未报道过的PRPS1基因错义突变p.C60Y(c.179G>A),通过Sanger测序验证为新发突变,在各种物种中高度保守,而且符合X连锁遗传模式。结合既往PRPS1基因型-表型关联情况,确定该突变为该家族综合征型聋的致病原因。PRPS1基因p.C60Y突变型在先证者外周全血中的mRNA表达水平与野生型无显著差异。结论PRPS1基因p.C60Y突变为该X-连锁隐性遗传CMTX5综合征型听力损失家系的致病突变。

薤白EPSPs基因在不同组织表达的半定量分析

5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸合成酶(EPSPs)是植物芳香族氨基酸合成途径的重要酶,是优良除草剂草甘膦作用的靶酶.根据已克隆的抗草甘膦植物薤白EPSPs基因cDNA序列的3′端非保守区域设计引物,采用RT-PCR半定量技术,研究了该基因在薤白不同组织中的表达情况.利用18S rRNA为表达的内参基因,建立一个针对EPSPs特异、稳定的RT-PCR半定量检测体系.对EPSPs基因表达的检测表明,薤白幼叶中基因表达水平最高,总表达水平高低依次为:幼叶,根,茎,壮叶.相对18S rRNA表达量为:幼叶0.631,根0.246,茎0.218,壮叶0.120.

烟草NtGGPPS 3基因的亚细胞定位和组织表达分析

为研究烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS 3在烟草萜类物质合成中的功能,构建NtGGPPS 3与GFP融合蛋白的植物表达载体,并通过基因枪法瞬时转化烟草悬浮细胞BY2,研究该基因的亚细胞定位情况,并对该基因在烟草不同生育期不同器官中的表达量进行分析。结果表明:NtGGPPS 3定位在烟草的叶绿体和质膜上;NtGGPPS 3基因在普通烟草主要生育期各组织中均表达,在叶片中表达量较高,在打顶期的茎中表达量明显上升。表明,该基因可能参与叶绿素、类胡萝卜素和质体醌等与光合作用相关萜类化合物的合成,也可能参与激素和防御相关的萜类物质合成。

香蕉MaTPS1基因序列及其表达特性分析

通过随机克隆测序法,从香蕉根系cDNA文库中获得海藻糖合成酶基因,命名为MaTPS1。MaTPS1扩增获得cDNA序列,全长3 946bp,开放阅读框2 562bp,编码853个氨基酸。生物学信息分析表明,MaTPS1蛋白属于不稳定蛋白,等电点4.72,具有TPS和TPP结构域。序列预测分析表明,MaTPS1蛋白定位于细胞质中,不存在信号肽,为跨膜疏水蛋白。与已知植物TPS氨基酸同源序列比对结果显示,一致性达74.81%,其中与2种马来西亚野生蕉、玉米、野茶树、中果咖啡的TPS编码氨基酸序列一致性分别为100%、79.91%、71.33%、63.93%和65.13%。器官特异性分析表明,MaTPS1在香蕉的根、球茎、假茎、叶、花和果实中都有表达,其中在根、球茎、假茎和花中表达量较高。qRT-PCR分析表明,ABA、ACC、干旱、低温、盐害和枯萎病胁迫处理后,MaTPS1表达量在盐胁下增加,于24h时达到最高,而在其他胁迫下较正常条件下降低。研究认为,MaTPS1可能参与调控香蕉抗盐胁迫机制,从而提高香蕉耐盐性。