生物正交试剂磷酸吡哆醛(PLP)及其类似物的研究进展

近十年来,生物正交试剂作为一种实用工具被广泛用于生物分子的修饰。科研人员也在不断优化现有的生物正交分子结构以获得快速的反应速率、稳定的偶联产物、来提高应用的实用性和广泛性。基于亚胺连接底物醛的独特代表磷酸吡哆醛(PLP)可以通过生物模拟转氨反应间接或利用PLP分子结构中活性正交基团直接参与生物分子的修饰。本文即从生物分子修饰的应用方面介绍生物正交试剂磷酸吡哆醛(PLP)及相关类生物的研究情况。

磷酸吡哆醛丁咯地尔胶囊治疗慢性脑供血不足临床分析

为观察磷酸吡哆醛丁咯地尔胶囊治疗慢性脑供血不足（chronic cerebral circulation insufficiency,CCCI）的疗效,我院神经内科在2009年6月至2010年6月使用磷酸吡哆醛丁咯地尔胶囊治疗CCCI 50例,并设丁咯地尔片对照组比较,证明其疗效确切、显著,报告如下。1临床资料1.1一般资料选择2009年6月至2010年6月在我科门诊和住院CCCI患者。磷酸吡哆醛丁咯地尔胶囊治疗组,50例,男22例。

磷酸吡哆醛对血清ALT、AST测定的影响及相关参考值的初步建立

目的研究磷酸吡哆醛(PLP)对测量表观健康人群(未排除脂肪肝患者)丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)催化活性浓度的影响,初步建立血清ALT和AST的参考值。方法以问卷调查方式收集研究对象基本资料,并分为脂肪肝组和非脂肪肝组;将ALT、AST参考测量程序转移至生化分析仪;检测试剂含和不含PLP时的ALT、AST:ALT1(PLP+)、ALT2(PLP-)、AST1(PLP+)、AST2(PLP-);分析PLP对研究对象血清ALT和AST活性测定的影响,并建立参考值。结果总人群、非脂肪肝组男、女间ALT1、ALT2、AST1、AST2差异均有统计学意义(P均<0.05)。总人群男、女间ALT、AST激活程度差异均有统计学意义(U分别为17 985.5、19 111.0,P<0.05);非脂肪肝组男、女间ALT激活程度差异无统计学意义(U=9 616.0,P>0.05),AST激活程度差异有统计学意义(U=8 947.0,P<0.05);脂肪肝和非脂肪肝人群的ALT激活程度和AST激活程度的差异有统计学意义(U分别为8 552.0、16 502.5,P<0.01)。若排除脂肪肝人群,试剂中加入PLP,男性ALT参考值为9.6～43.6 U/L,女性为7.0～30.2 U/L;男性AST参考值为19.8～39.6 U/L,女性为17.9～34.3 U/L。结论若在纳入参考人群时严格排除脂肪肝患者,试剂中添加PLP后ALT及AST参考值与现行参考值较接近,可考虑推广加入含PLP的试剂。

离子液体中壳聚糖磷酸吡哆醛席夫碱衍生物的合成与表征

引言壳聚糖是自然界中唯一含有氨基的碱性多糖,具有多样的生物活性、极好的生物相容性、生物可降解性以及无毒性等特性,是一种新兴的生物功能材料[1-3]。磷酸吡哆醛是维生素B6参与多种代谢反应的一种活性形式。磷酸吡哆醛作为一种辅酶参与所有转氨基反应及一些氨基酸的脱羧及脱氢反应。研究表明,磷酸吡哆醛不但可以用于预防治疗高血压、心血管疾病及糖尿病等,还可用于治疗迟发性运动障碍和治疗难治性儿童期癫痫[4-5]。王涛等[6]以壳聚糖微球为载体,然后固定磷酸吡哆醛等制备得到了低密度脂蛋白亲和吸附剂。

磷酸吡哆醛的差热分析法鉴定

目的:磷酸吡哆醛进口标准品及合成品的比较与鉴定。方法:应用TG/DTA联用热分析仪分别对磷酸吡哆醛进口和国内合成品进行差热图谱扫描与分析。结果:进口及国内合成的磷酸吡哆醛的热谱特征一致,说明磷酸吡哆醛合成成功;其中的出峰温度、峰面积的差异是由于它们的纯度不同所致。结论:差热分析法用于对物质的鉴定,简便、快速。

探讨丙氨酸氨基转移酶IFCC法检测试剂中加入5＇-磷酸吡哆醛对结果的影响

目的探讨丙氨酸氨基转移酶（ALT）IFCC法检测试剂中加入5’-磷酸吡哆醛对结果的影响。方法依据IFCC公布的酶学测定参考方法（37C）的SOPL]，使用该室建立的测定系统进行丙氨酸氨基转移酶测定，比较加入5’-磷酸吡哆醛和未加5’-磷酸吡哆醛两种试剂检测结果的相关性，并探讨加入5’-磷酸吡哆醛对结果的影响。结果在参考实验室用加5’-磷酸吡哆醛和未加5’-磷酸吡哆醛的ALT试剂分别用参考方法检测22份临床标本，对检测结果进行比较，回归方程为y=0．854X＋1．3059，R2=0．9758，两种试剂的检测结果相关性良好，但两种方法的捡测结果差异有统计学显著性意义（P〈0．05）。用两种试剂分别检测14份混合血清，加入5’-磷酸吡哆醛ALT试剂的检测结果：平均值（x）=104．1536U／L；标准差（s）-1．5820；变异系数（CV）=1．5％，而未加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂的检测结果：平均值（i）=88．7231U／L；标准差0）-0．5542；变异系数（CV）-0．6％。结论加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂与未加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂有较好的相关性，但两组结果的差异有统计学意义。加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂测试结果比未加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂测试结果约高20％，加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂测试结果的变异系数比未加5’-磷酸吡哆醛ALT试剂测试结果的变异系数高。

磷酸吡哆醛在丙氨酸转氨酶测定中的应用

目的利用含磷酸吡哆醛的Bergmerger改良法的试剂测定血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)活性,并与国内不含磷酸吡哆醛的方法作比较,观察磷酸吡哆醛在ALT活性测定中的作用,并建立该方法的参考值。方法用国际临床化学家联合会(IFCC)推荐的Bergmerger改良法与国内试剂同时测定146例患者血清的ALT值,并收集126名健康体检者血清用Bergmerger改良法测定ALT活性,建立该方法的参考值。结果Bergmerger改良法与国内试剂比较其ALT活性增加近20%～50%,参考值范围为:男0～52U/L,女0～42U/L。结论磷酸吡哆醛能有效地激活ALT活性,用含磷酸吡哆醛的Bergmerger改良法测定ALT活性,更能准确地反映患者血液中ALT的实际含量,用该方法测定ALT活性必须建立其相应的参考值。

烟草磷酸吡哆醛水解酶的分离纯化与表征

采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换、Sephadex G-100凝胶过滤和SP Sephadex C-25阳离子交换柱层析等步骤,对烟草磷酸吡哆醛水解酶进行了分离纯化。结果表明:该酶被纯化了119.6倍,得率为28.49%,经凝胶过滤和SDS-PAGE测得该酶的全分子量为49.6kDa,亚基分子量约为25kDa;该酶最适温度为50℃,最适反应pH为5.5;Mg2+、Ca2+、Mn2+等对该酶有激活作用,金属离子螯合剂EDTA对酶有抑制作用,加入Mg2+后抑制作用得到解除;在最适反应条件下,测得反应底物磷酸吡哆醛(PLP)和磷酸吡哆胺(PMP)的Km值分别为0.23mmol/L和0.56mmol/L。

常规试剂加入磷酸吡哆醛测定丙氨酸转氨酶催化活性浓度的研究

目的探讨在常规试剂中加入磷酸吡哆醛(PPA)测定丙氨酸转氨酶(ALT)催化活性浓度的可行性。方法用加与不加PPA两种常规方法分别比较肝脏患者、心脏患者、透析患者及其表观健康人群血清ALT活性。同时对两种常规方法在参考范围、线性范围、干扰物、精密度、试剂稳定性方面进行比较。结果加入PPA,健康人、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌患者、透析后患者、心绞痛患者和AMI患者的ALT分别升高3.2%、13.2%、23.1%、26.3%、15.2%、35.0%、5.2%和4.0%。结论无论男性还是女性,加入PPA其ALT参考范围仍然在40U/L以内,与目前常规方法的参考范围无差别,临床检验中可以推广加PPA的常规方法。

脂质体催化其表面甘氨酸与磷酸吡哆醛形成希夫碱

利用脂质体的疏水微环境,完成了甘氨酸与磷酸吡哆醛的希夫碱反应。甘氨酸进行双烷基化修饰后,组装到脂质体中。利用肽脂质构建带正电荷的脂质体(pH=7.00),吸附带负电荷的磷酸吡哆醛,增强磷酸吡哆醛与脂质体上甘氨酸的伯胺基团作用,并通过脂质体疏水微环境促进脱水缩合过程。紫外光谱检测结果表明,单独的磷酸吡哆醛吸收峰为387 nm,吸附到脂质体后吸收峰红移到395 nm;当PLP与脂质体上甘氨酸反应转变为希夫碱后,最大吸收峰蓝移到336 nm;希夫碱结合铜离子后,最大吸收峰从336 nm再次红移,出现383 nm吸收峰。脂质体上新形成的希夫碱与乳酸脱氢酶竞争铜离子,解除铜离子对乳酸脱氢酶活性的抑制。

磷酸吡哆醛补救途径两个关键酶的研究进展

维生素B_6(VB_6)包括6个可相互转换的吡啶衍生物。其中,磷酸吡哆醛(PLP)作为140多种细胞酶的辅酶,在生物体内发挥重要作用。动物从食物中获得VB_6,通过由吡哆醛激酶和磷酸吡哆醇氧化酶构成的补救途径合成PLP。PLP依赖酶的正常功能乃至人体最佳健康状态,依赖于细胞中PLP的平衡供给。然而,就PLP的动态平衡和调节机制以及PLP合成后的转移机制而言,目前还知之甚少,是一个富有挑战性的研究领域。为此,综述PLP补救途径两个关键酶的研究进展。

常规试剂中加入磷酸吡哆醛(PPA)测定天门冬氨酸氨基转移酶(AST)催化活性浓度的可行性研究

目的探讨在常规试剂中加入PPA测定AST催化活性浓度的可行性。方法用加与不加PPA两种常规方法分别比较肝脏病人、心脏病人、透析病人及其表观健康人群血清AST活性。同时对两种常规方法在参考范围、线性范围、干扰物、精密度、试剂稳定性方面进行了比较。结果无论加与不加PPA,健康男性组和女性组相比较均有显著差别。加入PPA使健康人AST升高4.0%,与不加PPA相比没有显著差别。加入PPA,急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化和肝癌病人的AST分别升高18.1%、23.2%、18.2%和28.3%,与不加PPA有显著差别。加入PPA,透析后病人AST升高27.6%,与不加PPA相比无显著差异。加入PPA,心绞痛病人AST升高5.6%,与不加PPA相比没有显著差异;加入PPA,AMI病人AST升高37.2%,与不加PPA相比有显著差异。AST加与不加PPA的常规方法在参考范围、线性范围、干扰物、精密度、试剂稳定性方面无显著差异。结论无论男性还是女性,加入PPA其AST参考范围仍然在40U/L以内,与目前常规方法的参考范围无差别。因此,我们认为可以推广加PPA的常规方法。

磷酸吡哆醛对H22肝癌细胞DNA拓扑异构酶Ⅰ活性的影响

为建立DNA拓扑异构酶活性测定方法和探讨磷酸吡哆醛(PLP)抑制肿瘤细胞增殖的可能机制,本实验以DNA琼脂糖凝胶电泳EB荧光法测定了H22肝癌细胞DNA拓扑异构酶I(TOPOI)的活性。结果表明维生素B6的活性形式PLP能有效地抑制TOPOI松弛负超螺旋的作用,且抑制效应与PLP剂量呈正相关。从而证实PLP能明显抑制TOPOI的活性并在分子水平上调节细胞周期活动和肿瘤细胞增殖活动。

磷酸吡哆醛对血清转氨酶活性影响的探讨

为了探讨磷酸吡哆醛（P─5′─）对血清转氨酶活性的影响，参考国际临床化学联合会（IFCC）方法，在试剂中加P－5′─P，用学试剂法和双试剂法进行实验．结果表明加入适量P—5′─P，不但可提高转氨酶活性，还可以提高某些疾病检出阳性率，因此建议ALT，AST试剂中需加入P－5′－P。

新型酸性磷酸酶“Turn-on”型荧光底物

酸性磷酸酶(ACP)是前列腺癌、戈谢病、肾病等疾病的重要生物标记物,因此开发灵敏、高选择性的ACP检测方法具有重要的意义。目前,已发展出多种ACP检测方法,包括免疫法、光谱法、色谱法、电化学法等;其中,荧光检测方法因灵敏度高、选择性好、快速、准确等优点备受关注。通过席夫碱反应,利用2-氨基苯硼酸(2-APBA)二聚体和磷酸吡哆醛(PLP)合成了一种新型的ACP“Turn-on”型荧光底物APBA-PLP(ABPL)。反应后,PLP的—CHO基团和2-APBA二聚体的—NH 2基团的特征峰消失,同时ABPL的C N基团的特征峰出现;此外,^(1)H和^(1)H—^(1)H COSY核磁波谱的信号峰与ABPL的结构相对应。以上表征结果证实了ABPL的成功合成。进一步,将ABPL应用于ACP检测。我们发现向ABPL水溶液中加入ACP后,体系的荧光强度增强,机理为:2-APBA二聚体为聚集诱导发光增强(AIEE)分子,其AIEE特性源于2-APBA二聚体的高度有序堆积;当2-APBA二聚体分子上引入PLP后(即合成ABPL),分子的高度有序堆积结构被破坏;加入ACP后,PLP水解为吡哆醛并从2-APBA二聚体分子上脱落,2-APBA二聚体分子又可重新进行高度有序堆积,表现为体系的荧光增强。在0~5 U·L^(-1)活性范围内,376.5 nm处的相对荧光强度与ACP活性之间呈现出良好的线性关系(R 2=0.99)。此外,当ACP、果胶酶、木瓜蛋白酶和脂肪酶的活性分别为4、50000、80000和10000 U·L^(-1)时,四种酶对应的相对荧光强度分别为0.2、-0.006、0.03和0.05。该结果表明ABPL对ACP具有高选择性。ABPL分子易合成,对ACP具有线性和高选择性响应,为设计合成可用于ACP检测的新型高效荧光底物提供了新策略。

产磷酸吡哆醛转移酶微生物菌株的筛选

筛选产磷酸吡哆醛转移酶微生物菌株,应用微生物产生的磷酸吡哆醛转移酶转化生产磷酸吡哆醛,以焦磷酸为磷酸基团供体磷酸化吡哆醛合成磷酸吡哆醛,采用HPLC法检测反应液,紫外吸收波长388nm,出峰时间为1.75min。得到1株转化效率较高的菌株C2-300,其转化效率达到64μg/mL。

磷酸吡哆醛对培养的海马神经细胞形态学的影响(英文)

实验观察磷酸吡哆醛对培养的海马神经细胞形态学的影响 ,选用妊娠 18d Wistar大鼠胎鼠 ,采用酶消化法获得单个海马神经细胞 ,通过原代低密度细胞培养法观察磷酸吡哆醛 (PLP)对其形态学的影响。结果表明 :在浓度为 1,10μ m时 ,能明显地促进海马神经细胞轴突的伸展 ,但对树突总长度、每个轴突上的分叉数及胞体的突起数均无明显影响 ;Ifenprodil和 Picrotoxin尽管能明显拮抗 PL P介导的神经细胞营养作用 ,但对 PL P的促神经细胞伸展作用却无明显影响。总之 ,认为 PL P之所以具有促海马神经细胞轴突伸展作用 ,不是通过 PL P神经细胞的营养作用来发挥的。

磷酸吡哆醛修饰的蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的时间分辨荧光分析

在别构抑制剂AMP或底物果糖1,6-二磷酸(FruP_2)存在下,磷酸吡哆醛(PLP)分别专一性地修饰在蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶(FruP_2ase,E.C.3.1.3.11.)的催化部位或别构部位。测得了修饰在催化部位或别构部位的PLP的荧光寿命及其连续分布。通过荧光寿命分布宽度的比较,认为该酶的活性部位柔性大于别构部位的柔性。

磷酸吡哆醛对测定肝肾疾病时血清转氨酶活力的影响

目的:研究使用含与不含磷酸吡哆醛试剂对测定肝肾疾病时的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)活力的影响。方法:用Di mension RxL临床生化测定系统(含磷酸吡哆醛试剂)和Roche ModularP生化分析系统(不含磷酸吡哆醛试剂)测定健康组、急性肝炎组、肝硬化组、慢性肾炎组、尿毒症血透析前组、尿毒症血透析后组血清ALT和AST活力,最后比较两种试剂的差异。结果:健康组的ALT和AST结果差异有显著性(P<0.01);急性肝炎组、肝硬化组、慢性肾炎组、尿毒症血透析前组、尿毒症血透析后组血清ALT和AST结果差异有极显著性(P<0.01)。结论:在肝肾疾病时测定血清ALT和AST应该使用含磷酸吡哆醛的试剂才能保证结果的准确可靠。

家蚕磷酸吡哆醛激酶cDNA的克隆和酶活表征(英文)

吡哆醛激酶 (EC 2.7.1.35) 在 ATP 和 Zn2+的存在下,催化吡哆醛的磷酸化反应生成磷酸吡哆醛 (PLP)。在生物体内许多酶促反应中,PLP 是一种重要的辅酶因子。家蚕和哺乳动物一样,需依赖食物中的维生素 B6前体来合成 PLP。文章描述了利用家蚕基因组数据库序列信息及使用 PCR 方法,克隆出编码家蚕吡哆醛激酶的 cDNA (GenBank 登录号:DQ452397)。克隆到的 cDNA 含有一个 894 bp 的完整可读框,编码一条分子量为 33.1 kDa,含 298 个氨基酸残基的蛋白质。序列比对显示此蛋白质序列与人类吡哆醛激酶蛋白序列具有 48.6%的同一性,包含吡哆醛激酶家族共有的特征保守序列,但其氨基酸残基数比哺乳动物和植物克隆到的吡哆醛激酶残基数均少 10 多个残基。多序列比对结果显示,吡哆醛激酶中几个有关键功能且在哺乳动物和植物中均保守的氨基酸残基在此蛋白中被替换为其他种类氨基酸残基。采用 T7 启动子和 T7 聚合酶表达系统对克隆到的 cDNA 进行了原核表达并对表达粗提产物进行了酶活检测。实验结果显示表达得到的可溶性蛋白产物占其总蛋白量为 10%,细胞粗提物具有活力为 30 nmol/min/mg 的吡哆醛激酶活性,结果证实了克隆到的 cDNA 编码家蚕中的吡哆醛激酶。