微小RNA-6791-5p靶向磷酸呋喃酸性簇分选蛋白2抑制结直肠癌增殖、迁移和侵袭

目的探讨微小RNA(miR)-6791-5p对人结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响及其分子机制。方法采集培养人结直肠癌细胞系RKO、SW480、DLD1、HCT116以及人正常结肠上皮细胞NCM460。通过反转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-6791-5p在各细胞系中的表达水平(表达倍数为0.52±0.04、0.83±0.06、0.60±0.12、0.68±0.07),并构建miR-6791-5p模拟物(miR-6791-5p mimic)及其阴性对照Negative control,并将其转染至RKO细胞。使用RT-qPCR检测miR-6791-5p和PACS2 mRNA的表达水平(表达倍数为0.468±0.032)。利用蛋白质印迹法(Western blot)检测PACS2蛋白的表达水平[RKO:(51.590±6.018)%]。使用两样本t检验进行统计分析,结果以均数±标准差(±s)表示,以P<0.05为差异有统计学意义。结果miR-6791-5p在人结直肠癌细胞系表达水平显著低于人结肠上皮细胞,其中RKO和DLD1下调最明显(RKO组低于460组:0.52±0.04比1.00、DLD1组低于460组0.60±0.12比1.00),差异有统计学意义(RKO:t=17.811,P<0.0001;DLD1:t=5.372,P<0.01)。RKO转染后,mimic组miR-6791-5p表达水平高于mimic NC组(3.28±0.44比1.00),差异有统计学意义(RKO:t=8.764,P<0.01)。细胞计数试剂(CCK-8)检测表明mimic组24、48、72、96 h细胞吸光度值显著低于mimic NC组(24 h吸光度值为0.185±0.004比0.250±0.030,48 h吸光度值为0.275±0.040比0.376±0.020,72 h吸光度值为0.497±0.120比0.657±0.010,96 h吸光度值为0.691±0.004比0.905±0.019),差异有统计学意义(RKO:t=10.821,P<0.01)。平板克隆实验表明mimic组集落形成数低于mimic NC组(115.70±12.51比176.00±19.18),差异有统计学意义(RKO:t=4.581,P<0.05)。划痕愈合实验显示miR-6791-5p mimic组划痕愈合率低于NC组[(14.960±0.848)%比(36.480±1.340)%],差异有统计学意义(t=23.491,P<0.0001)。Transwell迁徙和侵袭实验显示穿透微孔膜的细胞数mimic组低于mimic NC组(迁移数目miR-6791-5p mimic组比NC组42.330±3.512比125.700±7.760,侵袭数目分别为54.33±4.16比159.30±7.76),差异有统计学意义(Transwell迁移t=16.931,P<0.01)、(Transwell侵袭t=20.641,P<0.01)。在线靶预测软件(miRWalk、mirtarbase、targetscan)预测miR-6791-5p可能的靶基因,并通过qRT-PCR及Western blot验证,mimic组PACS2的mRNA及蛋白表达水平低于mimic NC组[比例为(51.590±6.018)%比1.00],差异有统计学意义[mRNA(RKO:t=27.951,P<0.0001);Western blot(RKO:t=13.931,P<0.001)]。结论miR-6791-5p在结直肠癌细胞中低表达,过表达miR-6791-5p能抑制结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭能力,并且明显下调PACS2的mRNA和蛋白表达水平,说明miR-6791-5p可能通过PACS2调控结直肠癌增殖、迁移及侵袭能力。

磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分选蛋白-2在代谢综合征及糖尿病肾病中的研究进展

磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分选蛋白-2(phosphofurin acidic cluster sorting protein-2,PACS-2)是一种具有膜转运及维持线粒体相关内质网膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane,MAM)结构与功能的多功能蛋白。近年研究发现PACS-2不仅参与调节细胞凋亡等细胞生理与病理活动,同时参与MAM结构调节及胰岛素功能调节,与代谢综合征及糖尿病肾病等多种疾病发病机制相关,并有望成为相关疾病的药物新治疗靶点。本文就国内外有关PACS-2分子特征、表达定位、生物学功能及其在代谢综合征与糖尿病肾病研究中的最新进展进行阐述。

磷酸弗林酸性簇分选蛋白2对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大的影响及其机制

目的探究磷酸弗林酸性簇分选蛋白2(PACS-2)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌肥大的影响及其机制。方法剪取并消化出生1~2 d的SD大鼠乳鼠的心脏组织,采用差速贴壁法获取乳鼠心肌细胞(NRCMs),原代培养24 h。以浓度为1.5μmol/L的AngⅡ处理NRCMs 0、3、6、12、24 h,采用Western blot方法检测细胞中FUN14域蛋白1(FUNDC1)、PACS-2、三磷酸肌醇受体蛋白(IP3R)的表达水平,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测细胞中心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA的表达水平。将NRCMs分为A~C组,A组使用无血清培养基培养,B、C组分别转染si-NC和si-PACS-2,采用Western blot方法检测各组细胞中PACS-2蛋白的表达水平。将NRCMs分为D~G组,D组使用无血清培养基培养,E组以浓度0.15μmol/L的AngⅡ培养,F、G组分别转染si-NC、si-PACS-2后再以浓度0.15μmol/L的AngⅡ培养,采用TRITC-鬼笔环肽染色技术检测各组心肌细胞表面积,RT-qPCR检测各组细胞ANP、BNP、β-MHC mRNA的表达水平,以Fluo-4,AM探针检测各组细胞胞质Ca^(2+)的水平。将NRCMs分为H~K组,H组使用无血清培养基培养,I、J组分别转染si-NC、si-PACS-2,K组转染si-PACS-2并且以浓度1μmol/L的钙调蛋白(CaM)拮抗剂处理后,采用RT-qPCR方法检测各组细胞ANP、BNP、β-MHC mRNA的表达水平。结果以浓度1.5μmol/L的AngⅡ处理NRCMs 0、3、6、12、24 h,NRCMs中ANP、BNP、β-MHC mRNA的表达水平呈时间依赖性上调(F=25.73~58.30,P<0.05),并且处理第24小时时相较于第0小时时均显著上调(t=5.35~37.50,P<0.05)。以浓度1.5μmol/L的AngⅡ处理NRCMs 0、3、6、12、24 h,NRCMs中IP3R、PACS-2以及FUNDC1蛋白的表达水平均呈时间依赖性下调(F=5.37~9.07,P<0.05),并且处理第24小时时相较于第0小时时显著下调(t=6.55~7.42,P<0.05)。与B组相比,C组NRCMs中PACS-2蛋白的表达水平显著下调(t=5.92,P<0.05)。与F组相比,G组NRCMs中心肌细胞表面积增大,ANP、BNP、β-MHC mRNA的表达水平及胞质Ca^(2+)水平均上调(t=3.50~26.60,P<0.05)。与J组相比,K组NRCMs中ANP、BNP、β-MHC mRNA表达水平均显著下调(t=3.27~5.13,P<0.05)。结论敲低PACS-2可增加NRCMs中胞质Ca^(^(2+))水平,并且可能以Ca^(^(2+))-CaM依赖的方式加重AngⅡ诱导的心肌肥大的发生。