大肠杆菌磷酸果糖激酶基因在极端嗜酸性氧化硫硫杆菌中的表达

构建了含大肠杆菌磷酸果糖激酶 (EC 2 .7.1 .1 1 )基因pfkA的重组质粒pSDK 1 ,利用大肠杆菌pfk缺陷株筛选含目的基因的重组质粒 ,通过接合转移的方式将其导入氧化硫硫杆菌Tt Z2中 ,接合转移频率达 2 6× 1 0 - 6 。重组质粒在Tt Z2中有较好的稳定性 ,在无选择压力条件下传代 5 0次基本保持稳定 (重组质粒保留 68%以上 )。酶活性测定、SDS PAGE及RT PCR结果表明 ,pfkA基因在氧化硫硫杆菌中得到表达 ,但其表达水平低于大肠杆菌。葡萄糖可促进含pSDK 1的氧化硫硫杆菌Tt Z2的生长 ,而对照菌株的生长则未受明显影响 。

扩增人肝型磷酸果糖激酶基因对唐氏综合征进行定量基因诊断的研究

目的 扩增位于唐氏综合征关键区域的人肝型磷酸果糖激酶基因 (PFKL基因 ) ,对唐氏综合征进行定量基因诊断。方法 采用定量PCR—微孔板杂交检测PCR产物量的方法 ,对 2 6例唐氏综合征患者及 2 78例正常人外周血DNA标本 ,扩增PFKL基因 ,扩增片段长度为 185bp ;另外 ,将人肌型磷酸果糖激酶基因 (PFKM基因 )作为内参照同时扩增 ,扩增片段长度为 36 5bp ,定量PCR产物用微孔板杂交检测。 结果 2 6例患者 (包括 1例易位型 )PFKM与PFKL扩增产物的OD值比值介于 0 4 0～ 0 6 0之间 ,平均值为 0 5 1;正常人扩增产物的OD值比值介于 0 80～ 1 2 0之间 ,平均值为 1 12 ,两者比较差异显著 (P <0 0 0 1)。对 2 78例正常人进行同样基因扩增和检测无一例假阳性 ,所得结果与染色体核型分析结果完全符合。结论 定量PCR—微孔板杂交检测PFKL基因拷贝数的方法 ,简便、快速、特异 。

定量PCR诊断Down's综合征方法比较

目的 比较两种染料进行定量PCR检测Down’s综合征时的特点。 方法 采用PCR方法同时扩增人肝型磷酸果糖激酶基因(PEKL-CH21)和人肌型磷酸果糖激酶基因(PEKM-CHI),分别用SYBRGreen Ⅰ和银染两种染料处理扩增产物,琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳-银染后在凝胶成像系统进行分析,得出扩增产物的荧光强度对比值。以吸光度理论比值为标准,分别比较两种荧光染料的敏感性、特异性。结果 SYBR Green Ⅰ和银染两种染料进行定量PCR诊断26例Down s综合征患者和20例正常人其敏感性、特异性均为100％,两种染料检测结果无差别。结论 SYBR Green Ⅰ是一种敏感、特异、实用、低毒的荧光染料。

同源基因定量PCR方法快速产前诊断Down综合征

目的 探讨同源基因定量PCR方法在预防Down综合征患儿出生及无创性产前诊断中的应用价值。方法 对178名正常对照和38例Down综合征患者同时扩增位于2 1号染色体Down综合征致病关键区域的人肝型磷酸果糖激酶基因(PFKL- CH2 1)和位于1号染色体的人肌型磷酸果糖激酶基因(PFKM- CH1) ,计算机软件(Fluor Chem V2 .0 Stand- Alone)分析PFKM- CH1及PFKL- CH2 1产物的相对比。结果 正常人比值为1.4 0±0 .36 7,Down综合征患者比值为0 .4 6±0 .2 1,经t检验差异有统计学意义。结论 这种定量PCR方法不但能检测2 1三体型,也可检测易位型Down综合征。