次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶缺乏的分子基础

次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)是一种嘌呤补救酶。HPRT催化次黄嘌呤与鸟嘌呤,使之向各自的单核苷酸转化。HPRT部分缺乏,尿酸产生过多而致痛风;HPRT活性完全缺乏则引起Lesch—Nyhan综合征。编码HPRT的基因位于Xq26^-27,由9个外显子和8个内含子组成,全长57kb。此基因可转录产生1.6kb的mRNA,编码的蛋白质含654个核苷酸。随着分子生物学技术的日益发展,有可能对HPRT活性缺乏个体进行HPRT基因研究,以确定此酶的遗传基础。

聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶在大鼠失血性休克后血管低反应性发生中的作用

目的研究聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶（PARP）在大鼠失血性休克后血管低反应性发生中的作用。方法将SD大鼠随机分为休克组、PARP抑制剂3-氨基苯甲酰胺（3-AB）预处理＋休克组和假手术对照组，采用股动脉放血复制失血性休克模型。在体观察给予3μg／kg去甲肾上腺素（NE）升高血压的幅度；离体测定肠系膜上动脉血管环对NE的反应性；硝酸还原酶法测定血浆和肠系膜上动脉血管环组织匀浆中一氧化氮（NO）的含量。结果休克模型完成后即刻静脉给NE，休克组血压升高幅度显著低于假手术对照组（P〈0．01）；回输血1h后再次静脉给NE，休克组血压显著低于3-AB预处理＋休克组和假手术对照组（P〈0.05和P〈0.01）。假手术对照组最大收缩张力[（0.3671士0.2213）g／mm]〉3-AB预处理＋休克组[（0.2864±0.1532）g／mm]〉休克组[（0.1856士0.1113）g／mm，P〈0.05或P〈0.01]；与休克组比较，3-AB预处理＋休克组量-效曲线左移，在NE终浓度为10^-7、10^-6和10^-5mol／L时其收缩力显著增加（P均〈0.05）。3组间血浆NO含量差异均无统计学意义，3-AB预处理＋休克组血浆和肠系膜上动脉组织匀浆中NO含量虽较休克组稍有降低，但两组间比较差异无统计学意义。结论PARP参与了大鼠失血性休克后血管低反应性的发生。

西红花苷通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3-聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶通路保护大鼠心肌缺血再灌注损伤

目的探讨西红花苷通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)-聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶(PARP)通路对心肌缺血再灌注(MIR)大鼠的保护作用。方法将72只大鼠随机分为假手术组、模型组、西红花苷低、中、高剂量[20、40、80 mg/(kg·d),灌胃]组、西红花苷+PPARγ抑制剂T0070907组[西红花苷80 mg/(kg·d)+T00709071.5 mg/(kg·d)]。结扎冠状动脉前降支法构建MIR大鼠模型。建模成功后,测定大鼠血流动力学参数左心室舒张压(LVDP)、左心室舒张末压(LVEDP)、左心室内压最大上升和下降速率(±dp/dt_(max));试剂盒检测大鼠血清和心肌组织中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、丙二醛水平;苏木精-伊红(HE)染色法检测大鼠心肌组织病理学变化;原位末端标记(TUNEL)法检测大鼠心肌细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹(Western-blot)法检测大鼠心肌组织中PPARγ-caspase-3-PARP通路蛋白表达。结果假手术组大鼠心肌纤维排列整齐,间质无炎症细胞浸润;模型组大鼠心肌纤维排列紊乱,间质伴有大量炎症细胞浸润;与模型组比较,西红花苷低、中、高剂量组大鼠心肌组织病变得到改善,西红花苷中、高剂量组心肌纤维排列较整齐,存在少量炎症细胞浸润;与西红花苷高剂量组比较,西红花苷+T0070907组大鼠心肌组织病变严重。模型组大鼠血流动力学参数LVDP、+dp/dt_(max)、-dp/dt_(max)、PPARγ、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)表达较假手术组降低,LVEDP、血清和心肌组织中LDH[血清LDH(2762.74±317.69)比(1105.68±286.45)U/L,q=18.605,P<0.001;心肌组织LDH(4852.34±244.82)比(2456.84±315.63)U/mg,q=29.820,P<0.001]、CK-MB、丙二醛水平,心肌细胞凋亡数目、Bcl-2相关X基因(Bax)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved caspase-3)、活化的PARP(Cleaved PARP)蛋白表达较假手术组升高(P<0.05);与模型组比较,西红花苷低、中、高剂量组LVDP、+dp/dt_(max)、-dp/dt_(max)及PPARγ、Bcl-2蛋白表达升高,LVEDP、LDH、CK-MB、丙二醛水平、心肌细胞凋亡数目及Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved PARP蛋白表达降低,且随着西红花苷剂量的增加,呈一定的剂量依赖性变化(P<0.05);T0070907可逆转西红花苷对心肌缺血再灌注大鼠的保护作用。结论西红花苷可能通过激活PPARγ-caspase-3-PARP通路预防MIR大鼠心肌损伤。

miR-34c-5p/PAICS轴调节肺腺癌细胞生物学行为研究

目的分析miR-34c-5p靶向结合磷酸核糖基氨基咪唑羧化酶(phosphoribosylaminoimidazole carboxylase,PAICS)促进肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)增殖、迁移和侵袭的能力。方法生物信息学分析miR-34c-5p和PAICS在LUAD组织中的表达情况及与临床特征之间的关系。实验将A549、Calu-3细胞分为miR-NC组、miR-34c-5p组、miR-34c-5p+PAICS组。实时荧光逆转录定量聚合酶链反应(real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)测定miR-34c-5p表达水平。细胞计数试剂盒(cell counting kit 8,CCK-8)检测各组细胞增殖能力。Transwell实验检测各组细胞迁移和侵袭能力。裸鼠成瘤实验检测瘤体重量、体积。Western blot测定各组细胞PAICS蛋白表达水平。数据库预测miR-34c-5p靶基因,双荧光酶素报告实验进行验证。结果miR-34c-5p在LUAD组织中低表达,PAICS在LUAD组织中高表达,且均与临床不良表型有关。miR-34c-5p组中miR-34c-5p表达高于miR-NC组(P<0.05)。与miR-NC组相比,miR-34c-5p组细胞增殖、迁移和侵袭能力明显降低(P均<0.05)。与miR-NC组相比,miR-34c-5p组瘤体重量变轻,体积减小(P均<0.05)。生物信息学和双荧光酶素报告实验均表明PAICS是miR-34c-5p作用靶点。与miR-NC组相比,miR-34c-5p组PAICS mRNA和PAICS蛋白表达水平明显下降(P均<0.05)。miR-34c-5p抑制PAICS的表达,促进LUAD细胞增殖、迁移、侵袭的能力。结论miR-34c-5p通过靶向结合PAICS促进LUAD细胞增殖、迁移和侵袭,从而促进LUAD的发展进程。

b型流行性感冒嗜血杆菌结合疫苗(磷酸多核糖基核糖醇-白喉毒素突变体197)的安全性和免疫原性研究

目的评价b型流行性感冒嗜血杆菌结合疫苗(Haemophilus Influenzae Typeb Conjugate Vaccine,Hib)[磷酸多核糖基核糖醇-白喉毒素突变体197(Polyribosylribitol Phosphate-Cross Reacting Material197,PRP-CRM197)]在中国儿童使用的安全性、免疫原性和加强免疫后的抗体应答。方法研究分三个阶段:第一阶段为I期安全性研究,先入组20名16～20月龄的幼儿,接种1剂Hib PRP-CRM197;15d后入组20名2～4月龄的婴儿,按间隔1个月的程序接种3剂Hib PRP-CRM197。每剂接种后收集30d内的安全性数据。第二个阶段为Ⅲ期基础免疫,入组916名2～4月龄受试者,随机分配到试验组(611人)和对照组(305人),分别接种3剂Hib PRP-CRM197或Hib PRP-T(Tetanus Toxoid,TT;破伤风类毒素)对照疫苗,每剂间隔1个月。第三个阶段为Ⅲ期加强免疫,对基础免疫完成3剂疫苗接种的受试者,于1周岁后加强免疫1剂。在Ⅲ期临床研究中,收集安全性和免疫原性的数据。抗-PRP抗体测定采用酶联免疫吸附试验。结果Ⅰ期安全性研究发现,Hib PRP-CRM197在两个年龄组(婴儿和幼儿)都有良好的耐受性。基础免疫和加强免疫的Ⅲ期临床研究表明,Hib PRP-CRM197的安全性和HibPRP-T相似。在完成基础免疫后1个月,实验组和对照组的所有受试者均达到了短期血清保护性抗-PRP抗体水平[≥0.15微克/毫升(g/ml)],且分别有99%和97%的受试者达到了长期血清保护性抗-PRP抗体水平(≥1.0g/ml)。在完成加强免疫后,所有受试者均达到了短期和长期的血清保护性抗体水平。与HibPRP-T组相比,接种HibPRP-CRM197始终产生更高的抗体几何平均浓度。结论 Hib PRP-CRM197疫苗在基础免疫和加强免疫后,都显示了良好的耐受性和快速的抗-PRP抗体应答。Hib PRP-CRM197的免疫原性不劣于HibPRP-T,且安全性也相似。Hib PRP-CRM197可用于中国儿童抗Hib感染的常规免疫接种。临床试验注册国家食品药品监督管理局《药物临床批件》2008L03160。

二苯乙烯苷对氧化诱导内皮细胞凋亡及Caspase-3和PARP表达的影响

为研究二苯乙烯苷对过氧化氢(H2O2)诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响并初步探讨二苯乙烯苷抗凋亡的可能机制,采用不同浓度H2O2和二苯乙烯苷处理内皮细胞24 h,以MTT法检测细胞生长活力、Hoechst33258染色观察细胞形态、流式细胞仪检测凋亡率等方法筛选造模内皮细胞凋亡的H2O2浓度和二苯乙烯苷最佳的抗内皮细胞凋亡作用浓度.RT-PCR、Western-blot分别检测Caspase-3、PARP mRNA及蛋白质的表达.结果发现,与空白对照组相比,300μmol/L H2O2作用后,内皮细胞增殖明显受到抑制,Hoechst33258染色可见大量凋亡细胞,细胞凋亡率显著增加,流式细胞仪检测出明显的凋亡峰,Caspase-3和多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶(PARP)的表达量显著增加.经二苯乙烯苷处理后,随着二苯乙烯苷浓度增加,细胞的增殖率随之增加,凋亡细胞数减少,凋亡率逐渐降低,与H2O2组比较,10μmol/L的二苯乙烯苷能够显著提高细胞增殖率,降低细胞凋亡率,并显著减少Caspase-3和PARP表达.以上结果表明,二苯乙烯苷能够抑制由H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡,增加细胞生长活性,降低细胞凋亡率,其作用机制可能与下调Caspase-3和多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶(PARP)的表达有关.

b型流行性感冒嗜血杆菌结合疫苗(磷酸多核糖基核糖醇-白喉毒素突变体197)在13～59月龄儿童中的安全性和免疫原性研究

目的评价b型流行性感冒嗜血杆菌结合疫苗(Haemophilus Influenzae Typeb Conjugate Vaccine,Hib)[磷酸多核糖基核糖醇-白喉毒素突变体197(Polyribosylribitol Phosphate-Cross Reacting Material197,PRP-CRM197)]在13～59月龄儿童中使用的安全性和免疫原性。方法选择728名13～59月龄儿童,按1:1的比例随机分配到试验组(365人)和对照组(363人),分别肌内注射接种1剂PRP-CRM197或Hib[PRP-T(Tetanus Toxoid,TT;破伤风类毒素)],观察接种后7d内的局部和全身反应,收集接种后30d内的不良事件和用药情况。在接种疫苗前和接种疫苗后30d采集静脉血,用酶联免疫吸附试验检测抗-PRP抗体(Antibody to PRP,Anti-PRP)。结果分别有99%和100%接种PRP-CRM197和PRP-T的受试者,达到了短期[≥0.15微克/毫升(g/ml)]和长期(≥1.0g/ml)血清保护性Anti-PRP水平。两种疫苗的安全性相似。结论 Hib(PRP-CRM197)的耐受性良好,免疫原性不劣于Hib(PRP-T),为99%的受试者提供了血清保护性Anti-PRP。Hib(PRP-CRM197)可在13～59月龄儿童中进行免疫。临床试验注册国家食品药品监督管理局《药物临床批件》2008L03160。

通过提高胞内辅酶水平促进L-苯甘氨酸的合成

NAD(H)是全细胞转化合成L-苯甘氨酸中必需的辅酶,其在胞内的质量摩尔浓度对L-苯甘氨酸的合成至关重要。作者通过共表达烟酸转磷酸核糖激酶和NAD+合酶的编码基因pnc B和nad E,以期提高胞内辅酶水平,从而提高全细胞转化效率。结果表明,pnc B和nad E的共表达使胞内NAD(H)含量提高了2.35倍,同时添加20 mg/L的烟酸使胞内NAD+含量进一步提高了2.42倍,最终,全细胞催化活性和转化产量分别提高了94%和36.6%,说明在辅酶依赖型全细胞转化中,胞内辅酶水平的提高可以有效提高转化效率。

代谢工程改造大肠杆菌合成L-组氨酸

该研究主要通过多种代谢工程策略对大肠杆菌进行改造从而增强菌株L-组氨酸的合成。首先,用人工的开放阅读框(hisL′-λattB′-trpE)替换大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21(DE3)L-组氨酸操纵子的前导区,同时表达来源于E.coli的ATP转磷酸核糖基酶突变体基因hisGE271K后,菌株L-组氨酸产量达到872.50 mg/L;其次,通过比较来自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum,C.glutamicum)ATCC130132、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens,S.marcescens)ZJZ626和E.coli BL21(DE3)的11种hisG在不同抑制物浓度下的酶活力以及过表达11种hisG基因时L-组氨酸的产量,筛选出最优hisG基因,L-组氨酸产量提高至1480.42 mg/L;然后,通过CRISPR/Cas9技术将最优hisG整合至基因组;进一步比较不同来源的Prs对菌株L-组氨酸产量的影响,从中筛选出较优Prs进行基因组整合,结果显示,摇瓶发酵72 h后,菌株L-组氨酸产量提高至3898.06 mg/L,96 h时产量提高至5574.63 mg/L。该研究为将来L-组氨酸的工业化生产奠定了良好的基础。

PARP-2在大鼠心肌肥大中的作用

目的:在细胞和整体水平研究多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶2(PARP-2)在心肌肥大过程中表达的变化规律以及PARP-2对心肌肥大的调控作用。方法:健康雄性SD大鼠采用腹主动脉缩窄法(AAC)建立心肌肥大动物模型,采用real-time PCR和Western blot检测PARP-2的mRNA和蛋白表达变化;使用PARP-2特异性的siRNA干扰序列来处理细胞后,通过检测心肌细胞表面积及ANF、BNP和β-MHC的mRNA表达变化来作为评判心肌细胞肥大状况。结果:AAC大鼠心脏组织中PARP-2的蛋白和mRNA表达均显著上调;在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大模型中,AngⅡ能时间和剂量依赖性地上调PARP-2的mRNA和蛋白表达;用siRNA干扰序列沉默PARP-2能够逆转AngⅡ所诱导心肌细胞的肥大。结论:在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大的体外模型和腹主动脉缩窄诱导的心肌肥大动物的体内模型中,PARP-2的mRNA和蛋白水平均显著上调;特异性沉默PARP-2能够抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。

PARP-1体外活性测定方法的建立及其应用

建立PARP-1的体外活性测定方法并对84个具有潜在PARP抑制活性的化合物进行筛选。从Sf9昆虫细胞中提取酶液,以NAD+为底物,DNA为激活剂,建立PARP-1的活性测定方法;以高通量技术参数评价此方法,用已知PARP抑制剂进行验证,并以此方法进行PARP抑制剂的筛选。结果显示,确定的酶促反应体系为:12.5 nmol/L NAD+,15μg/m L DNA,6.25×10-4U PARP-1。评价Z'因子为0.76,S/B值为3.58。基于此模型筛出47个化合物在浓度7.4μmol/L时对PARP-1的抑制率达到60%以上。表明所建立的PARP-1活性测定方法,适用于PARP-1抑制剂的高通量筛选。

p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1在乳腺癌组织中的表达及临床意义

研究p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1在乳腺癌组织中的表达及临床意义。选择2015年3月至2017年8月在包头市肿瘤医院进行手术切除的60例乳腺癌组织为观察组,对照组为癌旁组织40例。采用免疫组化方法检测60例乳腺癌组织及40例癌旁组织中p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1的表达情况。p-mTOR在观察组和对照组阳性率分别为71.7%和42.5%;p-4EBP1在观察组和对照组阳性率分别为26.7%和10.0%;p-S6K1在观察组和对照组阳性率分别为45.0%和12.5%;p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1在乳腺癌组织中的表达水平均高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。试验结果表明,p-mTOR、p-4EBP1及p-S6K1在乳腺癌组织中过度表达可能是乳腺癌发生发展的重要机制之一。

Hib荚膜多糖在疫苗制备周期中的结构稳定性

目的 评价b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)荚膜多糖的基本结构聚核糖基核糖醇磷酸酯(polyribosylribitol phosphate,PRP)在Hib结合疫苗制备过程中的稳定性。方法 采用核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR)技术对制备的Hib精制多糖、多糖衍生物、多糖蛋白结合物进行结构解析。结果 制备的Hib精制多糖、多糖衍生物、多糖蛋白结合物的各项检测结果均符合《中国药典》三部(2020版)相关标准要求,且NMR谱图均未发生明显变化。结论 Hib结合疫苗主要抗原荚膜多糖的基本结构PRP在疫苗制备周期中未发生变化。

高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定b型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖及游离多糖的含量

目的:建立高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法(HPAEC-PAD)测定b型流感嗜血杆菌(Hib)结合疫苗的多糖及游离多糖含量。方法:将疫苗中的有效抗原成分—Hib多糖,其结构为多聚磷酸核糖基核糖醇(polyribosylribitol phosphate,PRP),用6 mol·L^(-1)盐酸进行水解,得到其核糖醇(ribitol)单体;使用Carbo Pac~?MA1阴离子交换柱(4 mm×250 mm),以580 mmol·L^(-1)氢氧化钠溶液为流动相,流速为0.4 m L·min^(-1),柱温35℃,进样体积100μL,脉冲安培检测器收集信号,核糖醇的含量以峰面积计算得到,再根据核糖醇占PRP干重的质量分数(41.3%),计算出Hib结合疫苗中PRP及游离多糖(Free PRP)的含量,并评估该方法的重复性和再现性。结果:核糖醇质量浓度在0.075~1.05μg·mL^(-1)范围内,与峰面积响应值呈良好的线性关系(r=0.999 9),最低检测限为2.5 ng·mL^(-1);标准品供试溶液连续进样6次,峰面积及保留时间的RSD均小于5%;核糖醇加标回收率在80%~120%之间;对来自5个企业的4个不同批次的Hib结合疫苗的PRP及Free PRP含量进行测定,结果均符合规定。结论:本方法在测定Hib结合疫苗的PRP及Free PRP含量时,样品前处理简单,分离效果好,且灵敏度高,结果稳定,可靠,对控制该疫苗的质量具有重要意义。

PARP-1与中枢神经系统疾病的关系

聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶1[poly（ADP-ribose）pdymerase-1，PARP-1]是-种广泛存在于真核生物细胞核中的蛋白酶，在中枢神经系统的疾病发生中扮演着重要的角色。在外界损伤刺激下，PARP-1易被受损的DNA激活，进而通过不同途径影响神经细胞的生理功能，引起细胞炎性反应，甚至导致细胞死亡，触发中枢神经系统疾病的发生。抑制PARP-1在治疗慢性和急性的中枢神经系统疾病的作用也越来越受到重视。

b型流行性感冒嗜血杆菌疫苗的现状及展望

b型流行性感冒嗜血杆菌(Haemophilus Influenzae Type B,Hib)感染,是全球性的公共卫生问题,主要引起儿童肺炎和脑膜炎,严重危害儿童的健康。Hib疫苗的诞生为Hib感染性疾病的预防开辟了一条新的道路。现对Hib结合疫苗的多聚核糖基核糖醇磷酸盐糖链、载体蛋白的种类和特点、不同Hib结合疫苗的免疫原性和安全性,以及联合疫苗的发展作了综述,以期为预防接种和临床操作提供参考。