紫苏磷脂酸磷酸水解酶基因(PfPAH1)的鉴定及功能分析

本文基于紫苏基因组数据筛选获得两条PfPAH1基因序列,分别命名为PfPAH1-1和PfPAH1-2。应用生物信息学工具分析PfPAH1s蛋白理化性质、功能结构域及系统进化。定量PCR(qRT-PCR)检测PfPAH1s在紫苏根、茎、叶、花及不同发育时期种子的表达谱。进一步克隆到高表达的PfPAH1-1基因的编码序列并进行烟草瞬时转化以鉴定其功能。结果表明,PfPAH1-1和PfPAH1-2基因的开放阅读框(ORF)长度均为2715 bp,编码904个氨基酸残基,含有Lipin_N、Lipin_mid和属于HAD_like超家族的LNS2三个保守结构域。系统进化分析显示紫苏PfPAH1-1蛋白与唇形科植物一串红的SsPAH1亲缘关系最近,其次是葡萄和芥菜。PfPAH1-2蛋白则与唇形科的芝麻SiPAH1亲缘关系最近,其次为油橄榄,紫苏和芝麻均为油料作物,推测PfPAH1-2和SiPAH1可能具有相似功能。qRT-PCR分析表明PfPAH1-1和PfPAH1-2基因均在开花后40 d种子中表达量最高,预示着其可能参与油脂合成积累。烟草瞬时转化揭示过表达PfPAH1-1基因烟草叶片总脂肪酸及中性脂含量均高于野生型烟草,然而磷脂含量降低。

怀地黄液泡质子泵焦磷酸水解酶基因的克隆与生物信息学分析

为了克隆地黄功能基因,根据NCBI GenBank核酸数据库中5种已知植物生长素诱导的器官膨大基因(ARGOS)碱基序列的保守区,利用CLUSTAL 2.1和DNAMAN 4.0软件设计简并引物,采用RT-PCR技术扩增出一个cDNA片段,测序表明,获得基因cDNA片段序列长度为495bp。经过NCBI数据库BLAST分析,发现它与莲花、蓖麻、烟草、苜蓿、葡萄、碧桃、灰绿藜7种植物的液泡膜质子泵焦磷酸水解酶基因同源性很高,在83%～86%,因此获得的基因是地黄液泡膜质子泵焦磷酸水解酶基因。

人磷脂磷酸水解酶3基因真核表达载体的构建及其对卵巢癌细胞生长的抑制作用

目的:构建人磷脂磷酸水解酶3(hLPP3)基因的真核表达载体pLenExpress-hLPP3并转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞,初步观察重组表达载体对卵巢癌细胞的转染效率、目的基因表达情况及对卵巢癌细胞生长的影响。方法:采用RT-PCR法从正常胎盘组织中提取hLPP3基因,先克隆入克隆载体pGEM-T easy质粒得到pGEM-T-hLPP3,再用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切,切下的hLPP3基因亚克隆入真核表达载体pLenExpress,得到pLenEx-press-hLPP3重组质粒,采用脂质体转染法转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞。实验分为3组:A组为实验组(转染表达hLPP3基因重组质粒)、B组为空质粒对照(转染空表达质粒)、C组为无转染对照。荧光显微镜观察细胞转染效率,实时荧光定量PCR法检测hLPP3 mRNA的表达,化学法测定转染前后细胞上清液中溶血磷脂酸(LPA)含量的变化,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况。结果:重组表达质粒经限制性酶切鉴定得到与hLPP3基因长度一致(936bp)的酶切产物,测序分析证实,目的基因序列与GenBank上登录的hLPP3基因(BC009196)序列完全一致。荧光显微镜下见A、B2组SKOV3细胞内有大量绿色荧光信号,转染率分别为67%和69%,C组细胞中无荧光信号。实时荧光定量PCR测定显示A组细胞中hLPP3 mRNA的相对表达量较B、C组明显增加(A、B、C组分别为0.5109±0.0584、0.1499±0.0255、0.1433±0.0181,P<0.05)。A组卵巢癌细胞上清液中的LPA含量较B、C组明显下降[A、B、C组分别为(2.37±0.76)μmol/L、(6.71±2.03)μmol/L、(6.84±1.49)μmol/L,P<0.05];流式细胞仪检测显示A组卵巢癌细胞凋亡率明显增加[A、B、C组分别为(30.50±2.12)%、(1.26±0.43)%、(0.10±0.03)%,P<0.05],细胞周期无明显变化。结论:成功构建了表达目的基因hLPP3的重组真核表达载体pLenEx-press-hLPP3,并能高效转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞,使细胞中hLPP3基因表达水平明显升高。增强hLPP3基因表达可以降低细胞外LPA水平,诱导细胞凋亡,抑制卵巢癌细胞的生长。

磷脂磷酸水解酶家族与卵巢癌

溶血磷脂酸(LPA)与卵巢肿瘤的发生、发展、浸润、转移等密切相关。磷脂磷酸水解酶(LPP)可以通过多种途径限制溶血磷脂酸信号系统,终止受体介导的溶血磷脂酸及相关复合物所引起的传递功能。磷脂磷酸水解酶通过影响溶血磷脂酸的代谢,或干扰溶血磷脂酸信号传导系统,显示出高度的降低胞外溶血磷脂酸的倾向性,有望成为治疗卵巢癌的新靶点。

磷酸水解酶对大肠杆菌工程菌合成番茄红素的影响

实验以大肠杆菌DH1为宿主菌,在已有生产番茄红素大肠杆菌工程初始菌株lyc001的基础上,增加合成番茄红素途径中的关键基因crtEIB拷贝数;表征结果表明,相较于初始菌lyc001,番茄红素产量提高了34%,并将此菌命名为lyc011.利用CRISPR干扰(CRISPR interference,CRISPRi)原理以及Golden-Gate组装方法成功构建了可以靶向得到的57个磷酸水解酶基因的双single guide RNA (sgRNA)的质粒.将dCas9质粒和sgRNA表达质粒导入lyc011菌株中,通过下调这57个磷酸水解酶基因表达量,最终通过发酵表征成功筛选到了15个对番茄红素产量提高具有正向调节结果的磷酸水解酶基因,分别为:yjjG,aphA,nagD,yqaB,yidA,pphA,bacA,glpQ,pgpB,spoT,cpdB,nudJ,dgt,phoQ.

弓形虫核苷三磷酸水解酶-Ⅱ真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建弓形虫核苷三磷酸水解酶-Ⅱ(NTPase-Ⅱ)基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-NTPase-Ⅱ并在COS-7细胞中进行瞬时表达。方法以pBAD-HisB-NTPase-Ⅱ质粒为模板,PCR扩增NTPase-Ⅱ目的基因,将其克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体中,双酶切及测序鉴定重组质粒。阳离子脂质体法转染COS-7细胞并经SDS-PAGE和Western Blot检测目的蛋白的表达。结果经鉴定,弓形虫pcDNA3.1(+)-NTPase-Ⅱ核酸疫苗质粒构建成功。以脂质体法转染COS-7细胞后,转染细胞可成功地表达弓形虫NTPase-Ⅱ蛋白。结论证实了弓形虫NTPase-Ⅱ蛋白能在真核细胞中表达,为该基因的核酸疫苗研究提供了实验依据。

抑制细胞分裂素核苷酸磷酸水解酶显著增强水稻产量

细胞分裂素(cytokinin)在水稻整个生命周期中对生长发育起到重要调控作用,特别是通过调控穗发育影响水稻产量.活性的细胞分裂素N^(6)-(2-异戊烯基)腺嘌呤(iP,N^(6)-(Δ^(2)-isopentenyl)adenine)和反式玉米素(trans-zeatin,tZ)对水稻的细胞分裂、组织分化、穗发育起到重要的调控作用[1~3].当前主流观点认为,植物体内的细胞分裂素合成主要分为两种途径,即一步法合成和两步法合成.一步法是指细胞分裂素核苷酸直接通过LOG蛋白介导的脱核糖磷酸。

杂氮冠醚化Schiff碱钴(Ⅱ)配合物模拟磷酸二酯水解酶的研究

含杂氮冠醚的Schiff碱过渡金属配合物作为模拟水解酶被用于催化BNPP水解 ,讨论了两种杂氮冠醚化单Schiff碱钴 (Ⅱ )配合物催化BNPP水解的动力学和机理 ,分析了反应体系的特征光谱变化。提出了配合物催化BNPP水解的动力学数学模型 ,结果表明 ,在反应过程中形成中间物种的假设是合理的 ;随着缓冲溶液pH的增大 ,两种配合物催化BNPP水解速率提高 ;两种配合物在催化BNPP水解中表现出好的催化活性。

鳙肌原纤维三聚磷酸盐水解酶(TPPase)的活性

采用离子色谱方法检测添加的三聚磷酸盐(STPP)在新鲜碎鳙肉和鳙肌原纤维蛋白中(Mf)所发生的水解。研究结果表明,添加到新鲜碎鳙肉中的STPP能被水解成焦磷酸盐(PP)和单磷酸盐(Pi),所生成的PP继续水解,最终产物为Pi。鳙肌原纤维蛋白具有三聚磷酸盐水解酶(TPPase)活性,能将STPP水解成PP和Pi。鳙肌原纤维蛋白TPPase水解STPP的最适温度为25℃,最适pH为5.5。低浓度的Mg2+能够激活鳙肌原纤维蛋白TPPase,但Mg2+超过5mmol.L-1时却起到了抑制作用。鳙肌原纤维蛋白TPPase活性受到KCl的影响,在0.3mol.L-1KCl条件下活性最高。EDTA-Na2能够抑制鳙肌原纤维蛋白TPPase活性。

聚腺苷二磷酸核糖糖苷水解酶调节癫痫大鼠海马组织凋亡诱导因子及炎症因子的研究

目的:探讨聚腺苷二磷酸核糖糖苷水解酶(PARG)对癫痫大鼠海马神经元损伤的影响及其分子机制,探讨PARG抑制剂单宁酸对凋亡诱导因子(AIF)、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的调节作用。方法:应用Nissl染色方法检测海藻氨酸致痫大鼠海马神经元在单宁酸干预前后的变化;应用Western blot-ting检测单宁酸干预前后致痫大鼠海马组织聚腺苷二磷酸核糖、AIF、IL-1β和TNF-α表达的变化。结果:单宁酸干预明显减少癫痫大鼠损伤海马神经元数目(P<0.05);增加致痫大鼠海马组织聚腺苷二磷酸核糖水平(P<0.05);增加致痫大鼠海马组织线粒体蛋白中AIF含量,降低核蛋白中AIF含量(P<0.05);可显著降低致痫大鼠海马组织IL-1β和TNF-α蛋白表达(P<0.05)。结论:PARG抑制剂单宁酸可减轻癫痫大鼠海马神经元损伤,阻断线粒体AIF的核转位,抑制海马组织IL-1β和TNF-α的表达。

福氏痢疾杆菌组氨酸合成中双功能焦磷酸水解酶和磷酸核糖环化水解酶双功能蛋白的初步研究

福志贺氏菌属是一类革兰氏阴性杆菌,是引起人类细菌性痢疾的主要致病源。以福志贺氏痢疾杆菌2a型301株全基因组为模板、以pET22b-(+)为载体、克隆了一个关键基因:组氨酸合成途径中双功能焦磷酸水解酶和磷酸核糖环化水解酶蛋白(简称:sf2088)。以BL21(DE3)为表达菌株,优化表达条件,获得了可溶表达的蛋白。经过亲和层析和分子筛层析获得目标蛋白。采用分析超速离心和动态光散射实验,对纯化后的蛋白进行稳定聚集状态的条件搜索,结果发现锌离子对稳定其聚合状态很重要。通过正交实验,获得蛋白保持稳定聚集态的条件。这对该酶的进一步研究奠定了基础。

鳙中焦磷酸盐水解酶的初步研究

采用离子色谱方法检测添加的焦磷酸四钠(TSPP)在新鲜碎鳙鱼肉中所发生的水解过程,并研究了焦磷酸盐水解酶(PPase)粗酶的特性。研究结果表明,添加到新鲜碎鳙鱼肉中的TSPP能被水解为单磷酸(Pi);鳙鱼肉中存在PPase,并且是水溶性蛋白。PPase粗酶水解TSPP的最适温度为50℃,最适pH为8.0。Mg2+、Mn2+和Co2+均可以激活PPase,但是Mg2+激活酶能力最强。Mg2+浓度为1mol.L-1时,PPase活性达到了0.023μmol.min-1.mg-1,显著高于其他两种金属离子的激活作用。葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)能够强烈抑制PPase活性;EDTA-Na2在浓度小于1mol.L-1能激活酶,但浓度大于1mol.L-1时却能够强烈抑制PPase活性。

大肠癌中聚(腺苷二磷酸核糖)水解酶对聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶的调节作用及意义

目的初步探讨大肠癌中聚(腺苷二磷酸核糖)水解酶[Poly(ADP-ribose)glycohydrolase,PARG]与聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶[Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]的关系。方法应用S-P免疫组化检测人大肠癌组织中PARG、PARP的表达;以PARG抑制剂丹宁酸(Gallotannin,GLTN)为处理因素,采用流式细胞计数检测小鼠结肠腺癌CT26细胞中PARG、PARP表达变化。结果PARG和PARP在人大肠癌组织中的表达呈正相关(r=0.300 01,P<0.05);流式细胞计数显示,用GLTN处理后,小鼠结肠腺癌CT26细胞中PARG、PARP的阳性细胞率分别较对照组降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论大肠癌中PARG和PARP的表达有相关性,PARG抑制剂可以抑制PARG及PARP表达,PARG可能对PARP具有调节作用。

非诺贝特通过上调三磷酸鸟苷环化水解酶Ⅰ促进eNOS复偶联

目的探讨非诺贝特发挥降脂外血管内皮保护作用的机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HU-VECs),非诺贝特预处理HUVECs 2 h,再与脂多糖(LPS)共孵育24 h。采用Western blot检测三磷酸鸟苷环化水解酶Ⅰ(GTPCH-Ⅰ)的表达水平,高效液相色谱法检测四氢生物蝶呤(BH4)的表达水平,ELISA检测细胞上清一氧化氮(NO)浓度,利用Confocal方法检测细胞活性氧(ROS)产生水平。结果非诺贝特预处理后,较单纯LPS刺激组,细胞内BH4表达水平及细胞上清NO产生增多,伴有细胞内ROS产生减少(P均<0.05);此外,单独给予非诺贝特处理内皮细胞后,可见浓度依赖性上调细胞GTPCH-Ⅰ的表达,非诺贝特(10μmol/L)上调GTPCH-Ⅰ的表达在12 h达到高峰。结论非诺贝特通过上调内皮细胞GTPCH-Ⅰ的表达而增加BH4的水平,进而促进内皮型一氧化氮合酶的复偶联,改善血管内皮功能。

人三磷酸鸟苷酸环化水解酶Ⅰ基因的克隆与表达

目的 研究人三磷酸鸟苷酸环化水解酶Ⅰ (GCHⅠ )基因在多巴胺代谢过程中的作用。 方法 从人胚胎肝脏中提取总RNA ,以RT PCR法扩增GCHⅠcDNA ,克隆于PGEM T easy载体中 ,测序正确后再构建真核表达载体 ,转染猴肾成纤维细胞系COS7,原位杂交检测其表达。 结果 RT PCR扩增出 90 4bp的cDNA ,并成功构建真核表达载体pCI neo GCHⅠ ,原位杂交证实其在COS7表达阳性率为 70 %～ 80 %。 结论 GCHⅠ有望用于帕金森病的基因治疗。

多(二磷酸腺苷-核糖)水解酶抑制剂单宁酸对糖尿病大鼠肾脏病变的影响及其机制

目的:研究多(二磷酸腺苷-核糖)水解酶(PARG)抑制剂单宁酸(GLTN)对糖尿病大鼠肾脏病变的影响并探讨其可能的机制。方法:将实验动物随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病组(DM组)、糖尿病3-氨基苯甲酰胺(3-AB)处理组(CDT组)、糖尿病GLTN低剂量(20mg·kg-1·d-1)处理组(LDT组)和糖尿病GLTN高剂量(30mg·kg-1·d-1)处理组(HDT组),12周后检查各组动物血糖、血肌酐、尿素氮、尿蛋白排泄率水平及肾脏病变情况,免疫组织化学法检测各组大鼠肾组织PARP阳性信号表达。结果:与DM组比较,LDT和HDT组血糖水平明显降低(P<0.01),血肌酐、尿素氮水平和尿蛋白排泄率也明显降低(P<0.01,P<0.05,P<0.01),LDT和HDT组糖尿病大鼠的肾脏病变程度减轻,肾组织PARP蛋白表达降低(P<0.05)。但LDT和HDT组之间上述肾功能参数比较差异无显著性(P>0.05)。结论:GLTN可降低糖尿病大鼠的血糖水平,抑制肾组织PARP表达,改善肾脏功能和形态异常。

I型三磷酸鸟苷环化水解酶在2型糖尿病大鼠主动脉表达的改变

目的:探讨血管内皮功能异常状态下,I型三磷酸鸟苷环化水解酶(GTPCH I)mRNA在2型糖尿病及硫辛酸干预大鼠主动脉中的表达。方法:选择雄性Wistar大鼠35只,随机选择10只作为正常对照组(NC组),25只采用高脂饲料喂养8周后,小剂量链脲佐菌素注射诱导建立2型糖尿病大鼠模型(成模21只),其中10只给予硫辛酸50 mg/kg腹腔注射,作为硫辛酸干预组(LA组),其余11只作为2型糖尿病组(T2DM组)。所有大鼠饲养16周后均处死测定其主动脉舒张功能,并用半定量RT-PCR检测主动脉GTPCH ImRNA表达。结果:T2DM组和LA组主动脉的内皮依赖性血管舒张(EDVR)明显减弱,而LA组较T2DM组有明显改善(P<0.05)。主动脉GTPCH I mRNA的表达在T2DM组下降70.28%,LA组下降26.88%,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:T2DM大鼠离体主动脉EDVR减弱时,主动脉GTPCH I mRNA表达显著下降。硫辛酸可改善EDVR,此作用可能与改善GTPCH I mRNA表达有关。

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因真核表达载体的构建

目的:构建编码弓形虫RH株三磷酸核苷水解酶(NTPase-Ⅱ)重组真核表达载体PVAX1-NTPase-Ⅱ。方法:采用PCR从弓形虫基因组DNA中扩增NTPase-Ⅱ基因,克隆入pGEM-T Easy载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR、酶切和测序鉴定;采用亚克隆将NTPase-Ⅱ基因克隆至真核表达载体PVAX1,筛选阳性重组质粒PVAX1-NTPase-Ⅱ,进行PCR、酶切和测序鉴定。结果:NTPase-Ⅱ的重组真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,大小为1 887 bp,与预期大小一致;重组真核表达载体的核苷酸序列,与GenBank中的相应序列100%同源。结论:成功构建重组真核表达载体PVAX1-NTPase-Ⅱ,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因克隆、表达与鉴定

目的对刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶基因(NTPase)进行克隆、表达和鉴定。方法采用PCR扩增刚地弓形虫RH株的NTPase基因,克隆入pGEM-TEasy载体,经酶切与测序鉴定后亚克隆至表达质粒pBAD-HisB,并转入大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中进行诱导表达。用镍-次氮基三乙酸亲和层析柱纯化重组质粒pBAD-HisB-NTPase表达产生的含组氨酸的重组蛋白,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析蛋白表达产物。结果PCR扩增得到特异的刚地弓形虫NTPase-Ⅱ基因序列,经测序鉴定无基因突变。SDS-PAGE结果表明NTPase-Ⅱ基因在E.coliBL21(DE3)中获得高效表达,其融合蛋白相对分子质量(Mr)约70000,与理论值相近。Western blotting分析结果显示,纯化的重组蛋白可被弓形虫感染的鼠血清及鼠抗重组蛋白血清识别。结论所克隆表达的弓形虫NTPase-Ⅱ重组蛋白具有良好的抗原性。