乙酸菌糖磷酸化作用的研究

对７ 种乙酸菌（ Ａｃｅｔｉｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｒｕ ｍｉｎｉｓ， Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ， Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ ｌｉｍｏｓｕ ｍ 和分离株Ａ２ 、Ａ４ 、Ａ１０ 、Ｈ３ＨＨ） 的葡萄糖和２脱氧葡萄糖磷酸化作用进行了研究。尽管所有机体都存在磷酸化反应，但它们在依赖ＰＥＰ 和ＡＴＰ 的比例上有实质性区别。分离菌株Ａ１０ 具有最高的依赖ＰＥＰ 的葡萄糖磷酸化活力（１１６２ｎｍｏｌ·Ｌ－１·ｍｇ － １·ｍｉｎ － １） ，Ａ１０ 、Ｈ３ＨＨ和Ｅ．ｌｉｍｏｓｕｍ 都具有葡萄糖磷酸转移酶系统（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ，ＰＴＳ） 。相反，Ａ．ｒｕｍｉｎｉｓ、Ａ．ｗｏｏｄｉｉ、Ａ２ 和Ａ４ 则不具有ＰＴＳ活力。这七株菌的葡萄糖依赖ＡＴＰ 的磷酸化活力都高于依赖ＰＥＰ的磷酸化活力，但其程度有所不同。Ａ１０ 和Ｈ３ＨＨ 的葡萄糖ＰＴＳ可通过胞外葡萄糖诱导，并且其比活在对数期随培养时间延长而增加。此外，还检测到Ａ１０

氧杂蒽酮类衍生物可能成为潜在的抗生素:细菌中磷酸烯醇式丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统酶I抑制剂的虚拟筛选

磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转移酶系统（PTS）广泛存在于真细菌，但在真核生物中缺失。该系统含有两个磷酰基载体，分别是酶I（EI）和含组氨酸的磷酰基载体蛋白（HPr），以及几个PTS转运子，负责促进几种糖的共吸收和磷酸化。

蜡样芽孢杆菌0-9菌株磷酸转移酶系统对糖利用能力分析

利用蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)0-9菌株及其衍生菌株,研究蜡样芽孢杆菌磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS)对不同糖类的磷酸化和吸收利用情况,明确该菌株的PTS糖类型,并就该菌对糖的利用能力及产胞外酶的能力进行了初步分析.结果表明,葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等均是蜡样芽孢杆菌0-9菌株的PTS糖,ptsI基因在PTS系统对糖的磷酸化过程中起到至关重要的作用,该基因功能缺失会导致突变体菌株对葡萄糖的磷酸化和吸收利用能力降低1.6倍,同时也会导致其产胞外酶的能力降低.本研究结果为深入研究蜡样芽孢杆菌0-9菌株的生防机理及基于该菌的生防制剂的研发提供了新的理论依据.

齐墩果酸衍生物DKS26对非酒精性脂肪肝病小鼠的作用及分子机制

目的探讨齐墩果酸衍生物DKS26对非酒精性脂肪肝病(NAFLD)小鼠的作用及分子机制。方法40只健康5周龄C57/BL小鼠随机均分为对照(CON)组、模型(MOD)组、二甲双胍(MET)组及DKS26组,后3组小鼠用40%CCl 4油溶液皮下注射加高脂饮食喂养、建立小鼠NAFLD模型,MET组和DKS26组小鼠分别给予100 mg/(kg·d)的MET和DKS26灌胃干预、CON组和MOD组小鼠给予100 mg/(kg·d)羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液灌胃干预,1次/d,共6周;末次干预后麻醉各组小鼠,眼球取血,采用微板法检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸转移酶(AST)水平;取血后处死各组小鼠,取肝右叶组织,制作匀浆采用微板法检测各组小鼠肝组织甘油三脂(TG)含量,制作切片采用油红O染色和苏木素伊红(HE)染色观察各组小鼠肝组织中脂滴沉积情况及组织形态学特征,采用Western blot法检测各组小鼠肝组织中叉头转录因子O1(FoxO1)和磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)蛋白的表达。结果与CON组相比,MOD组小鼠血清ALT和AST水平及肝组织TG含量明显上升(P<0.01),肝细胞空泡样变明显、胞质脂质沉积过多,FoxO1与PEPCK蛋白表达上调(P<0.05);与MOD组比较,MET组和DKS26组小鼠血清ALT、AST水平及肝组织TG含量下降(P<0.01),且DKS26组小鼠血清ALT水平较MET组降低(P<0.05);病理形态学显示,MET组和DKS26组小鼠肝脏空泡变性及脂质沉积较MOD组改善,肝组织FoxO1和PEPCK蛋白表达下调(P<0.05),但组间无差异(P>0.05)。结论口服DKS26可改善NAFLD小鼠肝功能损害与肝细胞脂质沉积,其机制可能与调控FoxO1信号通路介导的下游糖脂代谢关键酶PEPCK有关。

谷氨酸棒状杆菌果糖代谢阻断工程菌的构建

谷氦酸棒状杆菌不仅可以利用葡萄糖和果糖作为碳源进行糖类代谢,也可以利用这些碳源作为底物生产葡萄糖酸、甘露醇及山梨醇等产品。为了提高底物利用率和目的产物的积累量,利用代谢工程阻断糖类代谢的磷酸烯醇式丙酮酸一糖磷酸转移酶系统(phosphoenolpyruvate carbohydrate phosphotransferase system,PTS)和失活相应磷酸激酶。是实现此目标的有效手段。本实验利用同源重组和反向筛选等技术手段,分别获得ptsF单基因缺失工程菌CG△ptsF和ptsF、ptsH、ptsI三基因缺失工程菌CG△ptsF△ptsH△ptsI。工程菌的生长情况研究表明:在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CG△ptsF和工程菌CG△ptsF△ptsH△ptsI与野生型生长情况基本一致,说明葡萄糖代谢不受3个基因影响;在以蔗糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CG△ptsF和工程菌CG△ptsF△ptsH△ptsI的生长速率分别是野生型的48.4%和29.7%,菌体浓度分别是野生型的61.6%和34.1%;在以果糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CG△ptsF菌体浓度是野生型43.2%,工程菌CG△ptsF△ptsH△ptsI生长为0,证明其完全阻断了果糖代谢,同时说明果糖的PTS系统受ptsF、ptsH和ptsI基因编码的PTS相关蛋白的联合控制。果糖代谢阻断工程菌的获得,为进一步构建以果糖原型为底物的甘露醇或山梨醇生产工程菌株提供了遗传资源,也为谷氦酸棒状杆菌的糖类代谢研究提供了理论依据。

细菌中糖转运相关sRNA 的生理调控功能

当细菌面对较高浓度的葡萄糖时,随着葡萄糖摄入,常会导致菌体内部葡糖-6-磷酸的大量累积。在磷酸糖浓度达到一定阈值时,就会形成一种毒性胁迫从而抑制菌体的代谢与生长。许多细菌则会通过一种小RNA SgrS (sugar transport-related sRNA)的转录后调控作用,来解除这种糖胁迫抑制作用。SgrS在分子伴侣Hfq的协助下,与相应靶mRNA通过碱基互补配对方式结合,对ptsG mRNA和manXYZ mRNA进行负调控以减少糖类摄入,并对yigL mRNA进行正调控以增大糖类排出,从而提高细胞对糖胁迫的耐受性。与一般sRNA不同,SgrS作为一种双功能sRNA,除具有转录后调控功能外,还能够翻译出蛋白质SgrT。SgrS广泛存在于肠杆菌中,但不同菌属中SgrS的差异极大。本文主要对SgrS在细菌中的功能、分布及其差异进行综述。

盐胁迫对黄瓜幼苗光合作用及其关键酶基因表达特性的影响

以对盐胁迫敏感性不同的两个黄瓜品种中农大22号和戴多星为材料，研究了盐胁迫下黄瓜幼苗叶片光合特性、叶绿体超微结构以及光合作用关键酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（Rubisco）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性及其编码基因表达的变化。

顺磁核磁共振技术研究蛋白质遭遇复合物的动态结构

蛋白质依靠短程相互作用识别配体蛋白进而行使生物学功能,其相互作用界面仅占据蛋白质总表面积的一部分.因此,蛋白质与配体蛋白需要形成一系列遭遇复合物系综结构来减少构象搜索空间以加快结合速度.由于遭遇复合物在溶液体系中存在时间短、丰度低,因而很难被传统结构生物学技术捕捉到.本文选用组氨酸磷酸载体蛋白(HPr)和酶II(EIIAGlc)复合物为研究体系,采用顺磁弛豫增强(Paramagnetic Relaxation Enhancement,PRE)技术对遭遇复合物的系综结构及动力学性质进行表征,并用分子动力学模拟方法对实验结果进行验证,发现HPr在溶液体系中首先与EIIAGlc在3个方向上形成遭遇复合物,进而促进特异性复合物的形成.该方法不仅能够在溶液体系中观察遭遇复合物系综结构,还有望应用于生物大分子领域,揭示蛋白质在复杂生理网络中的相互作用机制及动力学行为.

大肠杆菌ptsHI-crr基因的敲除及其对苯丙氨酸生产的影响

L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)是重要的食品和医药中间体。利用大肠杆菌发酵葡萄糖生产苯丙氨酸时,对葡萄糖转运起重要作用的磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统(PTS)对苯丙氨酸产量有很大影响。由ptsHI-crr操纵子编码的磷酸组氨酸载体蛋白(HPr),酶I(EI)和酶IIAGlc是PTS的必要组分,通过敲除ptsHI-crr得到PTS缺陷菌株,可以使葡萄糖代谢更多地流向苯丙氨酸生物合成。采用Red同源重组技术将大肠杆菌染色体上的ptsHI-crr基因替换为四环素抗性基因,得到PTS缺陷菌株。该菌株在以葡萄糖为惟一碳源的培养基中摇瓶培养,菌密度为对照菌株的2.7倍,苯丙氨酸产量为对照菌株的6.3倍。

hprK基因敲除及对其枯草芽孢杆菌核黄素发酵的影响

枯草芽孢杆菌在葡萄糖丰富的环境中,胞内糖分解代谢物浓度的提高将引起碳分解代谢物阻遏效应(CCR)及糖吸收的抑制,对核黄素等发酵过程产生不利影响。通过缺陷细胞的分解代谢物控制蛋白A(CcpA)可以解除CCR效应,但不能解除糖吸收的抑制。磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(PTS)是枯草芽孢杆菌主要的糖吸收方式,HPr蛋白和双功能的HPr激酶/HPr-Ser46-P磷酸酶(HprK/P)参与PTS系统的调控。在葡萄糖丰富的条件下,HprK/P的激酶活性受1,6-二磷酸果糖激活,催化HPr蛋白46位丝氨酸残基磷酸化,形成HPr-Ser46-P。HPr-Ser46-P抑制某些碳源透过酶基因的表达;同时HPr-Ser46-P难以被酶Ⅰ在His15磷酸化,不能在PTS系统中发挥转移磷酸基团的作用,使细胞的糖吸收受到抑制。在CcpA缺陷的背景下,敲除核黄素生产菌株B.subtilis24A1/pMX45的HprK/P编码基因hprK,构建了CcpA和HprK/P双缺陷的重组菌B.subtilisZHc/pMX45。摇瓶发酵显示,B.subtilisZHc/pMX45核黄素发酵的最适葡萄糖浓度由24A1/pMX45的8%提高到10%;核黄素产量达到4.374mg/mL,比24A1/pMX45提高了19.2%。结果表明,CcpA和HprK/P的双缺陷可有效解除高浓度葡萄糖所引起的CCR效应和糖吸收抑制,有助于提高细胞对葡萄糖的耐受力,并提高核黄素产量。

肺炎链球菌候选疫苗蛋白SPD0295的重组表达及免疫活性分析

目的评价磷酸烯醇丙酮酸依赖的磷酸酶转移系统(phosphotrans-ferase system,PTS)SPD0295蛋白作为候选疫苗的免疫活性,分析其在不同血清型肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)中的表达情况。方法以S.pn中D39血清型基因组DNA为模板扩增spd0295基因序列,IPTG诱导表达含6×His标签的SPD0295重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后获得高纯度的目的蛋白;序列比对分析不同血清型S.pn的spd0295基因保守性;SPD0295蛋白与Alum佐剂混合经腹腔注射免疫Balb/c小鼠制备多抗,ELISA法检测其抗体效价,Western blot技术分析抗体的特异性,同时分析该蛋白在7株常见肺炎链球菌中的表达水平。结果spd0295基因在7株不同血清型S.pn中与D39菌株基因序列一致性大于99%;重组蛋白SPD0295免疫小鼠后获得高滴度、高特异性的多克隆抗体;Western blot技术验证了SPD0295蛋白在7株常见肺炎链球菌株中均有表达;黏附抑制试验表明SPD0295蛋白及其抗血清均可抑制细菌的黏附效应。结论 SPD0295蛋白免疫Balb/c小鼠可获得的多克隆抗体具有良好的免疫活性,且在不同血清型S.pn菌株中均有表达,保守性强,是1个潜在的S.pn候选疫苗蛋白。

化脓性链球菌碳水化合物代谢及毒力影响研究进展

化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)是一种引起人类多种疾病的革兰阳性病原菌,在宿主体内获取营养物质是其生存和繁殖进而损伤宿主的前提,其中碳水化合物是营养物质的主要成分。化脓性链球菌具有糖酵解、非完全糖酵解及磷酸烯醇丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统(Phosphoenol pyruvate-dependent phosphotransferase pathway,PTS)等的葡萄糖、乳糖和苹果酸摄取途径,具有碳分解代谢物阻遏、分解代谢物控制蛋白A和PTS等碳代谢调节方式,并且宿主体内葡萄糖、乳糖和苹果酸浓度的变化都会使其毒力发生改变。主要对化脓性链球菌碳水化合物摄取途径、代谢调节和对毒力影响等方面进行综述,为化脓性链球菌碳水化合物摄取所影响的调控网络和代谢通路的深入研究提供依据。

大肠杆菌分解代谢产物阻遏效应研究进展

细菌在多种碳源共存的环境中优先利用一种(通常是葡萄糖)的现象被称为分解代谢产物阻遏效应。国内现有分子生物学及相关课程教材普遍对该效应的机理解释不清甚至给出错误的解释。大肠杆菌葡萄糖-乳糖分解代谢产物阻遏效应产生的根本原因不是胞内葡萄糖的存在,而是葡萄糖经PTS(Phosphoenolpyruvate:carbohydratephosphotransferase system)系统向胞内运输同时藕联磷酸化的过程。磷酸向葡萄糖的传递导致PTS关键组分EⅡAGlc去磷酸化形式的积累。该形式的EⅡAGlc可以与质膜上本底表达的乳糖透性酶LacY结合,阻止诱导物乳糖的吸收。cAMP的影响也是通过激活参与PTS系统的关键基因而加强了诱导物排斥作用。此外,去磷酸化形式的EⅡBGlc和YeeⅠ对全局性转录阻遏蛋白Mlc活性的抑制也保证了PTS系统关键组分蛋白的基因表达。文章综述了近年来有关大肠杆菌分解代谢产物阻遏效应机理的最新研究进展,并对相关教材有关这一内容的阐述提出了修改建议。

植物乳杆菌IID基因突变株的构建及对IIa类细菌素敏感性分析

采用同源重组技术,对IIa类植物乳杆菌素LB-B1敏感的植物乳杆菌WQ0815中甘露糖磷酸转移酶系统(ElltMan)中的IID组分进行突变,利用牛津杯法分析了植物乳杆菌WQ0815 IID组分突变前后对植物乳杆菌素LB-B1的敏感性变化。结果表明,突变株对植物乳杆菌素LB-B1产生抗性,说明敏感菌株中ElltMan的IID组分是植物乳杆菌素LB-B1发挥抑菌作用时的结合位点。

光合作用和玉米种子的生长特性

四种高产玉米杂交种子（FS854,CB596×LH38,B73×LH38和B73×Mo17）和四种自交系（LH38,CB59G,Mo17和B73）种植在田里,研究与叶面积生存期（LAD）有关的特征,以及LAD和种子生长特性之间的关系。根据叶绿素含量,叶片中N浓度,CO2交换速度,核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加羧酶（Rubisco）和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEP羧化酶）活性的降低,杂种B73×Mo17比其他三种杂种的LAD更短。较短的LAD不是由于成熟,因为除了CB59G×LH38外,B73×Mo17类似于其他杂种。

过表达pps基因和aroG^(fbr)基因对北京棒杆菌L-色氨酸合成的影响

【目的】通过增加北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)PD-67芳香族氨基酸合成的前体物质磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的供应,解除终产物对芳香族氨基酸合成途径中第一个酶同时也是关键酶3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶(DS)的反馈抑制并提高抗反馈抑制的DS的活力,使碳流更多地流向芳香族氨基酸合成途径,从而积累更多L-色氨酸。【方法】运用PCR技术扩增北京棒杆菌PD-67磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因pps,与表达载体连接构建重组质粒pXPS;运用重叠PCR技术定点突变大肠杆菌(Escherichia coli)受苯丙氨酸调控的DS基因aroG,使相应的编码氨基酸序列发生突变:Leu175Asp,新的基因命名为aroGfbr,与表达载体连接构建重组质粒pXA;构建pps和aroGfbr的共表达重组质粒pXAPS。将3个重组质粒分别转入菌株PD-67,构建工程菌株PD-67/pXPS、PD-67/pXA和PD-67/pXAPS。通过摇瓶发酵研究工程菌株的发酵特性。【结果】酶活分析结果表明,pps基因和aroGfbr基因在北京棒杆菌PD-67中均实现了表达。工程菌株PD-67/pXA粗酶液DS抗反馈抑制分析表明,AroGfbr已解除酪氨酸和苯丙氨酸的反馈抑制。过表达pps基因和aroGfbr基因分别使工程菌L-色氨酸产量提高12.1%和26.8%,双基因共表达可使工程菌的产酸量提高35.9%。【结论】北京棒杆菌PD-67pps基因的过表达以及大肠杆菌来源的解除反馈抑制的aroGfbr的过表达均有助于增加PD-67 L-色氨酸的合成,而双基因的共表达可以进一步提高L-色氨酸的积累量。

整合型1,2,4-丁三醇重组菌的构建及共底物发酵

1,2,4-丁三醇(BT)是重要的非天然化学品.为构建整合型BT合成菌株,实现木糖、葡萄糖共底物发酵,通过Red系统将基因kivD、xdh整合至Escherichia coli基因组的xylAB、ptsHI、ptsG、crr位点,并尝试利用廉价的乳糖替代IPTG诱导外源基因表达.结果表明,外源基因整合至xylAB后,生物量降低28%,重组菌Escherichia coli W021能够代谢木糖合成BT(0.7 g/L).添加葡萄糖为共底物后生物量提高36%,但碳分解代谢抑制作用限制了木糖的代谢,BT产量降低14%.进一步整合代谢基因至不同的磷酸转移酶系统(PTS)位点,其中整合至ptsHI基因后BT产量最高,达到2.8 g/L.优化葡萄糖、木糖浓度后,BT产量提高到3.6 g/L,进一步优化乳糖替代IPTG后BT产量为1.9 g/L.最后经发酵罐优化,BT产量提高到3.9 g/L,转化率为0.3 mol/mol.本研究构建整合型菌株在廉价乳糖诱导下共底物发酵合成BT,为后续放大研究提供了借鉴.