Microbulbifer sp.A4B-17菌株的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶与烯醇化酶研究

对羟基苯甲酸(4-Hydroxybenzoate,4HBA)应用广泛,在工业领域上被当作前体合成各种芳香族化合物,其中包括液晶材料、农药等;在食品和化妆品等领域上被当作防腐剂。微泡菌属(Microbulbifer sp.)A4B-17是一种能将葡萄糖合成4HBA的海洋细菌,为了提高4HBA的合成效率对合成莽草酸途径前体的2个关键酶:GM004356编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)和GM0031333编码的烯醇化酶(Enolase)进行研究。通过构建蛋白系统进化树发现,PEPCK与Microbulbifer sp.GL-2的PEPCK相似度为95.15%,Enolase与Microbulbifer variabilis的Enolase相似度为98.13%。利用低温表达载体在大肠杆菌中对2个酶进行高效表达,提取和纯化后,采用BCA法蛋白定量计算后得到纯化后的PEPCK和Enolase分别占各自粗酶液的1.304%和1.123%。酶活采用PK/LDH(丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶)偶联检测法检测NADPH的减少量。根据米氏常数双倒数法求得PEPCK和Enolase的Km值分别为0.041 mmol/L和0.056 mmol/L,PEPCK反应的最适温度为30℃,最适pH值为7,Enolase的最适温度为30℃,最适pH值为7。以上结果为高效生产4HBA提供了理论依据。

两种方法测定二氧化碳的应用评价

目的比较磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PECE）与碳酸酐酶（CA）测定血浆中的二氧化碳的优缺点。方法以混合血浆为标样，用PECE及CA分别测定高、中、低值二氧化碳；同时随机取临床标本50份作对比实验。结果精密度显示PECE天内二氧化碳CV为1．56％～1．92％，天间CV为2．85％～3．78％；CA天内二氧化碳CV为3．89％～5．58％．天间CV为4．23％～6．75％：PECE回收率在96．7％～102．6％，而CA在89．4％～91．9％；PECE线性试验结果相关系数为0．9973；CA线性试验结果相关系数为0．9829。PECE与CA对比测定结果相关系数为0．9918。结论PECE操作简便、精确：快速、重复性、回收率、线性及相关性好等特点，用血量少，适用于全自动生化分析仪。

检验前环境因素对2种酶法检测血清CO_(2)影响的比较

目的比较环境因素对循环酶法(CEM法)和磷酸烯醇式丙酮酸羟化酶法(PEPC法)定量检测血清二氧化碳(CO_(2))浓度的影响。方法1周内需检测血清CO_(2)浓度的血清标本共计58份,统计其开盖后在全自动生化流水线分段时长。随机收集其中1 d门诊和住院患者来源需检测血清CO_(2)浓度的血清标本共计10份,开盖室温静置,以模拟标本在流水线上的待检状态。在不同时间点(1、3、6 h)使用两种方法依次检测,分别计算各时间点血清CO_(2)浓度与初始(0 h)结果的偏倚。结果标本开盖等待检测总时长平均110 min。标本室温放置3 h之内,CEM法检测血清CO_(2)浓度偏倚-5.71%~3.28%,而PEPC法测量偏倚较大为-11.7%~17.86%;室温放置6 h,CEM法测量偏倚仍远小于PEPC法。结论相比PEPC法,对于采用全自动生化流水线的大标本量实验室,CEM法更适用于检测血清CO_(2)浓度。