苹果磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因(PEPCKs)的克隆与表达分析

【目的】克隆苹果(Malus×domestica Borkh.)多个代谢途径中的关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)基因MdPCKs,研究其在不同组织器官及不同胁迫处理条件下的表达特性,为解析该基因在多个代谢途径中的功能奠定基础。【方法】利用同源比对和RT-PCR技术,克隆获得MdPCK1和MdPCK2全长cDNA序列并进行生物信息学分析;克隆MdPCKs的启动子序列,利用PlantCARE软件在线分析启动子上的顺式作用元件;采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测MdPCKs在不同组织中的表达以及在水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)、脱落酸(ABA)、模拟干旱(PEG)、高温(40℃)和低温(8℃)处理条件下的表达特性。【结果】获得2个苹果磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因(Md PCK1和MdPCK2;GenBank登录号分别为KT454964和KT454965),其开放阅读框(open reading frame,ORF)分别为2 001 bp和2 028 bp,分别编码666和675个氨基酸残基;基因结构和进化分析表明,Md PCK1和Md PCK2均由12个外显子组成,且序列结构进化高度保守;氨基酸序列和结构分析显示,二者均含有保守的PEPCK ATP domain区域;启动子分析显示,MdPCK1和MdPCK2启动子区域含有多个顺式作用元件,包括光响应元件、昼夜节律相关顺式作用元件、JA响应元件、SA响应元件、ABA响应元件、防御及逆境响应元件、低温响应元件和热激响应元件等;qRT-PCR结果显示,MdPCKs在被检测的组织中均有表达。在‘泰山嘎啦’苹果果实不同发育阶段,MdPCK1和MdPCK2具有相似的表达模式。在多种非生物胁迫处理下,MdPCK1受到100μmol·L^(-1) ABA和100 g·L^(-1) PEG胁迫诱导;MdPCK2受到150μmol·L^(-1) SA、100μmol·L^(-1) ABA、100 g·L^(-1) PEG和低温胁迫诱导。【结论】MdPCK1和MdPCK2属于植物PEPCK家族,非生物逆境胁迫可诱导MdPCK1和MdPCK2表达。

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1对胃癌细胞生物学行为的影响及相关机制

目的:探讨磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(phosphoenolpyruvate carboxykinase 1,PCK1)在胃癌中的表达、与胃癌患者预后的关系及其潜在机制。方法:利用TCGA数据库、HPA数据库及Oncomine 4.5数据库中胃癌以及癌旁组织的相关数据与图片,分析PCK1表达水平与胃癌患者临床病理学特征和总生存期的关系,采用基因功能富集分析(GSEA)预测PCK1调控胃癌潜在的信号通路。体外细胞学实验采用慢病毒转染胃癌HGC-27和AGS细胞,分别敲低与过表达PCK1,采用细胞功能学实验检测PCK1对胃癌细胞生长、增殖、迁移等影响,同时采用蛋白质免疫印迹检测相关蛋白的表达。结果:与癌旁组织相比,PCK1在胃癌组织中表达明显上调(P<0.05);ROC曲线提示PCK1对胃癌患者预后具有良好的预测效能;通过GSEA富集分析提示原发性免疫缺陷、细胞黏附分子、趋化因子信号通路、全身性红斑狼疮、产生IgA的肠道免疫网络及RIGⅠ样受体信号通路相关的基因集在PCK1基因低表达表型中差异富集;敲低PCK1后,胃癌HGC-27和AGS细胞生长、克隆形成能力、迁移能力显著下降,同时p-AKT(Ser473)、p-mTOR、p-S6和p-4EBP1表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01);过表达PCK1则与之作用相反。结论:PCK1在胃癌中呈高表达且与患者预后相关,其可能通过活化AKT-mTOR信号通路促进胃癌细胞生长、增殖与迁移。

稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因的克隆与分析

为揭示C4野生植物稗草(Echinochloa crusgalli)PEPCase的结构和功能特点,探索改善作物高光效新途径,克隆了稗草(E.crusgalli)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)的cDNA全长,测序及同源性比较分析结果证实,稗草ppc的cDNA全长为2 886 bp,编码961个氨基酸(GenBank登录号:AY251482);核苷酸序列与谷子(Setaria italica)C3型、高粱(Sorghumbicolor)C3-2型、玉米(Zea mays)C3-2型、水稻(Oryza sativa)C3型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的同源率分别达94.8%、93.2%9、3.0%和89.7%。推导的氨基酸序列中C末端第771位氨基酸是丙氨酸(A),表明是一个C3型基因。与其他植物几种不同形式PEPCase进行的多重序列比对与系统进化分析结果也证实,此基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与所有参与对比的C3型序列的同源性均远远高于与C4型的同源性。与玉米、高粱C3-2型PEPCase的同源性分别高达96.5%9、6.4%,与高粱、玉米的C3-1型PEPCase的同源性分别为84.3%、83.8%,而与谷子、玉米、甘蔗和高粱的C4型PEPCase的一致性相对较低,分别为82.2%、79.1%、77.1%和76.6%。因此进一步推论新克隆的稗草ppc基因属于C3-2型。对其编码的蛋白序列进行了结构域、活性位点和功能位点预测。

玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因高效表达载体构建及其导入小麦的研究

为获得具有C4光合特征的高光效转基因小麦材料,利用从玉米中克隆的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因(pepc,GenBank接受号为FJ415327)构建高效双元表达载体,通过基因枪介导法将其导入小麦品种(系)中,利用Real-time PCR方法分析外源基因在转基因植株中的拷贝数。PCR和双酶切鉴定表明,玉米PEPCcDNA序列已插入双元表达载体pCAMBIA3301中,命名为p3301-pepc;对获得的抗性再生植株进行PCR扩增,其中有342株扩增出目的条带;在选取的15株转基因植株中7株拷贝数为1,3株拷贝数为2,2株拷贝数为3,拷贝数为5、8和17的分别为1株。初步证明玉米pepc基因已整合到小麦基因组中,且外源基因在转基因植株中既有单拷贝插入,也有多拷贝插入,这为进一步研究该基因在小麦基因组中的功能表达提供了试验材料。

籽粒苋C_4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆和表达

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)是C4途径的关键酶之一。本研究克隆了双子叶植物籽粒苋(A.hypochondriacus L.)C4型PEPC基因的cDNA和gDNA全长序列。该基因编码区cDNA全长2895bp(GenBank登录号为HQ186302),编码964个氨基酸残基。对应的gDNA全长为6785bp,含10个外显子和9个内含子,内含子总长3890bp,其中第一内含子最长,为1662bp,具GATA-motif、G-box等15个光应答元件,9个激素应答元件,29个CAAT box,72个TATA box。该特征在本研究范围内的植物中,为籽粒苋所独有。比较多种植物表明,不同植物之间的C3/C4型PEPC基因的外显子长度具有较高的一致性,而内含子的长度变化较大。不同植物PEPC基因对核苷酸具有一定的选择性,并且外显子和内含子的GC含量呈正相关。总的趋势是单子叶植物外显子和内含子的GC含量均高于双子叶植物。利用半定量RT-PCR分析表达模式,发现籽粒苋PEPC基因主要在叶片中表达,表达量随光照时间延长而增加。

谷子磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)对逆境胁迫的响应

为解析谷子磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC,Phosphoenolpyruvate carboxylase)在非生物逆境胁迫下的响应特征。从谷子基因组中鉴定出一个SiPEPC(Seita.1G020700)基因,利用相关软件对其氨基酸序列、蛋白特征、功能、信号途径、顺势应答元件等参数特征进行分析和预测,随后分析了该基因在幼苗期逆境胁迫下的动态表达模式及在拔节期、抽穗期、灌浆期不同光照处理和干旱胁迫下的表达。结果表明,该基因位于谷子1号染色体,基因组序列长6 652 bp,编码965个氨基酸,基因无可变剪切、不含内含子;功能域分析显示,该基因含PEPC基因的特征结构域;多序列比对发现,该PEPC蛋白与其他植物PEPC蛋白非常相似,具有非常保守的序列结构。实时荧光定量PCR分析表明,SiPEPC(Seita.1G020700)在ABA、低温、PEG、高盐胁迫下表达量均有所上调,其中,在ABA处理时,表达量呈现波动,在12 h被诱导达到峰值。在低温处理时,表达量持续上升,在24 h达到峰值;在PEG和NaCl处理时表达量整体呈上升趋势,均在12 h达到峰值,在24 h其表达量均急剧下降。进一步研究表明,SiPEPC基因在拔节期和抽穗期正常光照强度下参与了对干旱胁迫的响应,推测SiPEPC(Seita.1G020700)基因参与了谷子对非生物逆境的应答,可能在干旱和其他逆境胁迫信号途径中起关键作用。

脂联素对大鼠肝细胞葡萄糖激酶与磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性影响的研究

目的:探讨脂联素对体外培养大鼠肝脏细胞葡萄糖激酶与磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性影响,及其在胰岛素抵抗中的意义。方法:以BRL肝脏细胞株为细胞模型,分别用10μg/ml、30μg/ml、50μg/ml脂联素处理细胞,用6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联比色法、乳酸脱氢酶偶联比色法检测大鼠肝脏细胞葡萄糖激酶与磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性。结果:与对照组比较,磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶在脂联素处理24h后活性明显降低,且随脂联素浓度升高作用越明显,P<0.05。葡萄糖激酶在脂联素处理24小时后,活性与对照组比较没有显著性差异,P>0.5。结论:脂联素对葡萄糖激酶无明显的调节作用,而对于磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶具有显著的抑制作用。脂联素通过对肝细胞磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶活性的调节,降低肝脏葡萄糖异生,减少肝糖输出,改善胰岛素抵抗。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的分子结构研究进展

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)广泛存在于高等植物、藻类及大多数细菌中,催化C4光合作用固定CO2的第一步反应。在过去的10年中关于PEPC分子的一级结构研究已取得显著的进展,最近,通过X-射线衍射分析阐明了大肠杆菌和玉米C4型PEPC分子的三维结构,就这些研究进展进行总结。

小檗碱对2型糖尿病中国地鼠肝脏葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶mRNA表达的影响

目的研究小檗碱对2型糖尿病中国地鼠肝脏葡萄糖激酶(GcK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6P)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)mRNA表达的影响,探讨小檗碱影响糖代谢的分子机制。方法以高脂高热量饲料喂养结合腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ)的方法制作2型糖尿病中国地鼠模型,成模后随机分成模型组、小檗碱组、二甲双胍组,各药干预9周。同时设立对照组。观察小檗碱疗效及对肝脏GcK、G6P、PEPCK mRNA表达的影响。结果与模型组相比,小檗碱增强胰岛素敏感性,降低血糖血脂,增高肝脏GcK的mRNA表达,降低肝脏G6P、PEPCK mRNA的表达。结论小檗碱降低2型糖尿病血糖的作用机制可能与提高肝脏GcK mRNA的表达和降低G6P、PEPCK mRNA的表达有关。

胰岛素、环磷酸腺苷和皮质激素对磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子的顺反式调节

目的观察体外环磷酸腺苷(cAMP)、皮质激素(DEX)和胰岛素对磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)550bp启动子片段的顺反式作用。方法将重组的pGL2-PEPCK-Luc荧光素酶表达质粒通过脂质体转染法与内对照质粒pSV-β-Galactosidase共同转染大鼠肝肿瘤细胞系CBRH7919,通过荧光素酶报告系统观察胰岛素、cAMP和DEX对PEPCK启动子的调控作用。结果cAMP和DEX对PEPCK具有明显兴奋作用,两者同时刺激具有叠加效应。生理浓度下,胰岛素对基础状态及cAMP和DEX激活的PEPCK启动子均有明显的抑制作用,并且呈剂量依赖性。结论550bp(-600-+69)PEPCK调控序列在肝细胞内具有较完善的正负反馈调节机制,可以作为糖尿病基因治疗的候选基因。

甘蓝型油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究分析

为了解甘蓝型油菜(Brassica napus)中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的表达和分布情况,文章首先分析了油菜和拟南芥中PEPC基因之间的关系,同时参照拟南芥中4条PEPC基因扩增了针对甘蓝型油菜的探针,Southern blot结果表明,甘蓝型油菜中PEPC基因肯定多于4条,而RT-PCR分析了不同时期种子中的PEPC基因的表达情况,表明PEPC基因在种子成熟过程中油脂、储藏蛋白质等贮存物质的积累有一定作用。

非酯化脂肪酸对体外培养的牛肝细胞中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶mRNA丰度及其活性的影响

采用荧光定量PCR方法、酶活性速度测定法,探讨了非酯化脂肪酸(NEFA)对体外培养的牛肝细胞中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)mRNA丰度及其活性的影响。结果显示,添加1.5 mmol/L和2.0mmol/L NEFA时,PEPCK mRNA丰度显著低于对照组(P<0.05);添加0.5～2.0 mmol/L NEFA时,PEPCK的活性显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)降低。结果表明,NEFA对体外培养的牛肝细胞中PEPCK mRNA丰度和PEPCK酶活性均具有抑制作用。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的生物信息学分析

[目的]为改造磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因、提高PEPC活性寻找线索。[方法]对GenBank上登录的PEPC的cDNA序列、氨基酸序列进行BLAST搜索,运用生物信息学方法进行信号肽分析、亚细胞定位、结构域分析以及PEPC蛋白质氨基酸序列的同源性分析和系统进化树分析。[结果]共搜寻到62个PEPC蛋白质序列,绝大多数属于C3植物,9个属于C4植物。绝大多数PEPC没有存在信号肽的可能性。62个PEPC蛋白的亚细胞定位基本一致,均具有Phosphoenolpyruvate carboxylase结构域,未发现其他结构域。通过进化树分析可分别将C3植物和C4植物的PEPC酶分成4组和3组。62个PEPC蛋白质氨基酸序列的同源性为86.70%,而其在19个C3植物和9个C4植物中则分别为89.63%和89.61%。[结论]C4植物PEPC的423位上的丙氨酸和862位上的酪氨酸高度保守,而C3植物的428位和871位的氨基酸则缺少同源性,可能与C3和C4植物PEPC的活性差异有关。

蓝藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的生物信息学分析

应用NCBI、Expasy等在线生物信息学网站对蓝藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)与其他物种进行序列同源比对,分析相同的保守序列及催化活性位点,构建分子进化树;预测跨膜结构、疏水性/亲水性、二级结构、功能域和模体等。结果显示,蓝藻PEPC与高等植物、细菌、真核藻PEPC同源性都比较低(约为33%),但是它们含有两个类似的活性部位和相同的催化活性位点;该蛋白质是非跨膜的亲水性不稳定蛋白,二级结构以a-螺旋和无规则卷曲为主,含有一个功能结构域,主要的功能是参与氨基酸的合成。

抵抗素对肝细胞葡萄糖激酶和磷酸烯醇式丙酮酸激酶活性的影响

目的:观察抵抗素(Resistin)对肝细胞糖代谢关键酶葡萄糖激酶(GK)和磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)活性的影响及剂量效应。方法:正常大鼠的肝细胞,以不加Resistin与加不同剂量的Resistin培养24h,用6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联比色法、乳酸脱氢酶偶联比色法检测不同剂量Resistin对GK和PKPCK的影响。结果:Resistin浓度为10nM/L、50nM/L时,GK活性与空白对照组无明显差异,PEPCK活性明显升高(P<0.05);当Resistin浓度上升为100nmol/L后,GK活性较空白对照组明显下降(P<0.01),而PEPCK活性升高更明显(P<0.01)。结论:抵抗素浓度升高使大鼠肝细胞GK活性下降,PEPCK活性升高,从而抑制糖酵解促进糖异生,升高血糖。上述两种酶的活性与抵抗素浓度呈现不同的剂量依赖关系。

葡萄糖-6-磷酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶mRNA在梗阻性黄疸及胆道再通大鼠中的表达及意义

目的研究梗阻性黄疸及胆道再通大鼠肝脏葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)mRNA表达的改变及意义,探讨梗阻性黄疸影响糖代谢的分子机制。方法 30只健康雄性大鼠随机分为5组:假手术组(A组)、梗阻性黄疸1周组(B组)、梗阻性黄疸2周组(C组)、梗阻性黄疸1周再通1周组(D组)、梗阻性黄疸2周再通1周组(E组)。检测各组动物血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、直接胆红素(DBIL),总胆红素(TBIL)水平;光镜观察肝脏形态学改变;采用RT-PCR方法检测大鼠肝脏葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)mRNA的表达。结果胆道梗阻后,B、C两组血清TBIL、DBIL、ALT水平较A组明显升高,尤其是C组升高的更明显;光镜下可见B组和C组肝细胞肿胀,炎性细胞浸润,汇管区可见胆管增生,C组较B组除以上改变更加严重外,还可见典型的片状肝细胞坏死;B、C两组肝组织G-6-P、PEPCK的mRNA表达显著升高。相比,D、E两组血清TBIL、DBIL、ALT水平均分别低于B、C两组,肝脏形态改变也明显趋于正常,肝组织G-6-P、PEPCK的mRNA表达亦均低于B、C两组,且D组在血清、肝组织mRNA表达及光镜下肝细胞损伤方面与E组比较均降低。结论梗阻性黄疸模型形成后,大鼠肝脏分泌的胆汁排泄不畅形成淤积。肝脏中G-6-P、PEPCK mRNA表达开始增强且随梗阻时间延长其表达增强趋势更加明显,加强了糖异生的过程,可导致血糖浓度的升高。梗阻解除后,受损肝脏形态及肝功能开始恢复,肝脏G-6-P、PEPCKmRNA表达开始降低,及早解除梗阻,恢复越快。提示肝组织G-6-P、PEPCK的mRNA表达升高可能是梗阻性黄疸时糖代谢紊乱的主要原因之一。

杜氏盐藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆和分析

为研究杜氏盐藻(Dunaliella salina)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)基因的功能,根据莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、花生(Arachis hypogaea)等真核生物PEPC基因高度保守序列,设计一对简并引物,通过RT-PCR的方法获得杜氏盐藻PEPC基因部分序列,然后采用RACE的方法分别克隆到5′端和3′端序列,拼接后得到全长cDNA,其长度为3 523bp,包含2 949 bp的完整开放阅读框,编码982个氨基酸,相对分子质量为110560.5。氨基酸序列与已知物种PEPC序列的同源性依次为:Chlamydomonas reinhardtii 69%,Chlorellavariabilis 55%,Ostreococcus tauri 50%和Ostreococcus lucimarinus CCE9901 49%,表明所克隆的序列确为杜氏盐藻PEPC cDNA序列。

橡胶树磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因HbPPC1的克隆和表达分析

根据橡胶树磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因的部分序列设计引物,运用RT-PCR和RACE方法获得其家族成员的1个全长cDNA,命名为HbPPC1,长度3025bp,包含5′-UTR34bp,3′-UTR93bp,开放阅读框2898bp,编码965个氨基酸。预测HbPPC1分子量为110.34ku,理论等电点为6.09。HbPPC1具有C3型PEPC的结构特征,其N端第9-17位残基是可逆磷酸化的不变序列-X-X-SIDAQLR,C端倒数第4位残基为谷氨酰胺（Q）,第774位残基为丙氨酸（A）。HbPPC1与5条大戟科植物的PEPC序列（其中木薯2条、蓖麻2条、麻风树1条）的同源性达到95%。系统进化分析表明,HbPPC1与这5条序列聚在同一个进化支中。HbPPC1包含2个酶活性位点和7种类型的Motifs,二级结构以由α-螺旋和无规则卷曲为主。Real-timeRT-PCR结果表明,HbPPC1在橡胶树胶乳、叶片、树皮和花中均表达,在胶乳中的表达量最高;胶乳HbPPC1的表达受乙烯利刺激影响,在乙烯利刺激4-72h后胶乳HbPPC1表达明显下调,表明HbPPC1在胶乳pH值调控中起重要作用。本研究结果为HbPPC1的功能研究提供理论依据。

海带磷酸烯醇式丙酮酸-羟激酶的研究

于1986－1990年，在大连凌水养殖四场采集海带，对磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶在海带不同部位、不同发育时期及不同外界条件下活性的变化予以研究。结果表明，该酶是海带体内唯一重要的催化CO2暗固定的酶；此酶活性由海带基部、中部至顶端逐渐减弱；酶活性在用正常水温预处理藻体时最高；正常盐度时酶的活性高于非正常盐度的酶活性；增加NH4+浓度可提高酶的活性。

不同亚型缺血性脑卒中与磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子232基因多态性的研究

目的研究磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK1)启动子232基因多态性与不同亚型缺血性脑卒中的关系。方法 165例缺血性脑卒中患者,采用CISS分型法分为动脉粥样硬化血栓形成亚组(AT)、急性穿支小动脉闭塞亚组(APSAO)和心源性栓塞亚组(CE),并选取健康成人90例作为对照组,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法,进行PCK1启动子-232基因多态性分析,比较各组间基因型分布及等位基因频率。结果 (1)PCK1启动子232突变纯合子GG基因型及突变G等位基因频率,在AT、APSAO亚组显著高于对照组(P<0.05),而CE组突变基因型频率及突变等位基因频率与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)收缩压、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高血压史、糖尿病史、PCK1启动子232基因多态性(P=0.005)是CIS的危险因素。结论 PCK1启动子232基因多态性可能与CIS中AT、APSAO亚型相关。