稗草磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因的克隆与分析

为揭示C4野生植物稗草(Echinochloa crusgalli)PEPCase的结构和功能特点,探索改善作物高光效新途径,克隆了稗草(E.crusgalli)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)的cDNA全长,测序及同源性比较分析结果证实,稗草ppc的cDNA全长为2 886 bp,编码961个氨基酸(GenBank登录号:AY251482);核苷酸序列与谷子(Setaria italica)C3型、高粱(Sorghumbicolor)C3-2型、玉米(Zea mays)C3-2型、水稻(Oryza sativa)C3型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的同源率分别达94.8%、93.2%9、3.0%和89.7%。推导的氨基酸序列中C末端第771位氨基酸是丙氨酸(A),表明是一个C3型基因。与其他植物几种不同形式PEPCase进行的多重序列比对与系统进化分析结果也证实,此基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与所有参与对比的C3型序列的同源性均远远高于与C4型的同源性。与玉米、高粱C3-2型PEPCase的同源性分别高达96.5%9、6.4%,与高粱、玉米的C3-1型PEPCase的同源性分别为84.3%、83.8%,而与谷子、玉米、甘蔗和高粱的C4型PEPCase的一致性相对较低,分别为82.2%、79.1%、77.1%和76.6%。因此进一步推论新克隆的稗草ppc基因属于C3-2型。对其编码的蛋白序列进行了结构域、活性位点和功能位点预测。

小麦导入磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因的初步研究

[目的]将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因导入普通小麦临优145。[方法]利用根癌农杆菌遗传转化系统,以普通小麦临优145为材料,将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因,导入小麦胚性愈伤组织中,用含潮霉素(hyg)的筛选培养基连续筛选,并从分子水平上检测该基因。[结果]获得了hyg抗性植株,经GUS组织化学染色检测表明,抗性苗叶片被染成了深蓝色;PCR检测出目标条带。[结论]初步证明磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)基因已经导入受体材料中。

玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因高效表达载体构建及其导入小麦的研究

为获得具有C4光合特征的高光效转基因小麦材料,利用从玉米中克隆的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因(pepc,GenBank接受号为FJ415327)构建高效双元表达载体,通过基因枪介导法将其导入小麦品种(系)中,利用Real-time PCR方法分析外源基因在转基因植株中的拷贝数。PCR和双酶切鉴定表明,玉米PEPCcDNA序列已插入双元表达载体pCAMBIA3301中,命名为p3301-pepc;对获得的抗性再生植株进行PCR扩增,其中有342株扩增出目的条带;在选取的15株转基因植株中7株拷贝数为1,3株拷贝数为2,2株拷贝数为3,拷贝数为5、8和17的分别为1株。初步证明玉米pepc基因已整合到小麦基因组中,且外源基因在转基因植株中既有单拷贝插入,也有多拷贝插入,这为进一步研究该基因在小麦基因组中的功能表达提供了试验材料。

籽粒苋C_4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆和表达

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)是C4途径的关键酶之一。本研究克隆了双子叶植物籽粒苋(A.hypochondriacus L.)C4型PEPC基因的cDNA和gDNA全长序列。该基因编码区cDNA全长2895bp(GenBank登录号为HQ186302),编码964个氨基酸残基。对应的gDNA全长为6785bp,含10个外显子和9个内含子,内含子总长3890bp,其中第一内含子最长,为1662bp,具GATA-motif、G-box等15个光应答元件,9个激素应答元件,29个CAAT box,72个TATA box。该特征在本研究范围内的植物中,为籽粒苋所独有。比较多种植物表明,不同植物之间的C3/C4型PEPC基因的外显子长度具有较高的一致性,而内含子的长度变化较大。不同植物PEPC基因对核苷酸具有一定的选择性,并且外显子和内含子的GC含量呈正相关。总的趋势是单子叶植物外显子和内含子的GC含量均高于双子叶植物。利用半定量RT-PCR分析表达模式,发现籽粒苋PEPC基因主要在叶片中表达,表达量随光照时间延长而增加。

谷子磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)对逆境胁迫的响应

为解析谷子磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC,Phosphoenolpyruvate carboxylase)在非生物逆境胁迫下的响应特征。从谷子基因组中鉴定出一个SiPEPC(Seita.1G020700)基因,利用相关软件对其氨基酸序列、蛋白特征、功能、信号途径、顺势应答元件等参数特征进行分析和预测,随后分析了该基因在幼苗期逆境胁迫下的动态表达模式及在拔节期、抽穗期、灌浆期不同光照处理和干旱胁迫下的表达。结果表明,该基因位于谷子1号染色体,基因组序列长6 652 bp,编码965个氨基酸,基因无可变剪切、不含内含子;功能域分析显示,该基因含PEPC基因的特征结构域;多序列比对发现,该PEPC蛋白与其他植物PEPC蛋白非常相似,具有非常保守的序列结构。实时荧光定量PCR分析表明,SiPEPC(Seita.1G020700)在ABA、低温、PEG、高盐胁迫下表达量均有所上调,其中,在ABA处理时,表达量呈现波动,在12 h被诱导达到峰值。在低温处理时,表达量持续上升,在24 h达到峰值;在PEG和NaCl处理时表达量整体呈上升趋势,均在12 h达到峰值,在24 h其表达量均急剧下降。进一步研究表明,SiPEPC基因在拔节期和抽穗期正常光照强度下参与了对干旱胁迫的响应,推测SiPEPC(Seita.1G020700)基因参与了谷子对非生物逆境的应答,可能在干旱和其他逆境胁迫信号途径中起关键作用。

杜氏盐藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆和分析

为研究杜氏盐藻(Dunaliella salina)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)基因的功能,根据莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、花生(Arachis hypogaea)等真核生物PEPC基因高度保守序列,设计一对简并引物,通过RT-PCR的方法获得杜氏盐藻PEPC基因部分序列,然后采用RACE的方法分别克隆到5′端和3′端序列,拼接后得到全长cDNA,其长度为3 523bp,包含2 949 bp的完整开放阅读框,编码982个氨基酸,相对分子质量为110560.5。氨基酸序列与已知物种PEPC序列的同源性依次为:Chlamydomonas reinhardtii 69%,Chlorellavariabilis 55%,Ostreococcus tauri 50%和Ostreococcus lucimarinus CCE9901 49%,表明所克隆的序列确为杜氏盐藻PEPC cDNA序列。

甘蔗C_4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因植物表达载体构建

根据用于转化的甘蔗 C4Ppc基因的特点 ,分别构建了无启动子、35 S启动子、2 x35 S启动子的植物表达载体 p BIpepc、p L Apepc、p CBIpepc;用盐冻融法将其导入农杆菌 LBA4 40 4 ,可用于烟草、水稻、大豆、甘薯等 C3 作物遗传转化。

甘蔗C_4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因转化烟草研究初报

将全长6.8 kb含所有内含子及部分5’侧端和3’末端的甘蔗C4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因插入植物目的基因载体pBI121,经农杆菌介导转化获得转基因烟草,PCR检测和dot southern分析证实外源基因已整合进入烟草基因组中。甘蔗C4Ppc基因导入烟草后其叶片PEPC活性有所提高,但提高较小。因此,有必要继续进行克隆目的基因的5’侧端和3’末端获得其完整序列后用于C3作物的遗传转化研究。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆与原核表达

以筛选得到的鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)基因组DNA为模板,PCR扩增了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因,构建了克隆载体pET-28a-PEPC。将测序结果正确的重组子转化到大肠杆菌BL21中,获得重组菌BL21-pET-28a-PEPC。经IPTG诱导,该重组菌实现了PEPC的高效表达,并且生长速度明显快于对照菌大肠杆菌BL21,可作为宿主用于构建碳固定工程菌。

香格里拉水韭磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)的克隆及其表达载体构建

以中国特有植物香格里拉水韭(Isoetes shangrilaensis X.Liu)为材料,通过转录组测序数据分析筛选出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(IsPEPC),根据该基因序列,从香格里拉水韭cDNA中克隆获得磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)的编码基因IsPEPC,并将此基因插入pCAMBIA-2300-N-eGFP及pMD质粒载体上,再采用农杆菌介导的花序浸染法将2个重组载体分开转入野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)中。结果显示:IsPEPC基因蛋白编码序列长度为2928 bp,编码975个氨基酸;同源性检索分析结果表明,该蛋白与其近源物种江南卷柏(Selaginella moellendorffii Hieron.)的PEPC基因蛋白序列同源性为79.8%。对转基因的T1代拟南芥通过抗性筛选并在gDNA水平上阳性鉴定,初步鉴定得到pC2300-N-eGFP-IsPEPC转基因株系26个和pMD-IsPEPC转基因株系32个。

玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及其表达载体构建

为了克隆磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)的编码基因以用于表达载体的构建,本研究根据已公开的序列信息设计特异性引物,以玉米自交系ZD410的叶片DNA为模板,通过PCR技术成功克隆了pepc基因的全长序列。生物信息学分析发现,该基因完整ORF长度为2 913 bp,编码蛋白质分子质量约为108.179 ku,等电点(PI)为5.73;对其氨基酸序列进行同源性检索分析显示,该蛋白质与其他C4植物的PEPC蛋白具有极高的同源性;利用Gateway技术构建含pepc目的基因的表达载体,并通过农杆菌介导的花序浸染法将该基因导入野生型拟南芥。

茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子基因CsPPT的克隆与表达分析

以白叶1号为试验材料,通过RT-PCR和RACE技术克隆获得茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子基因Cs PPT(Gen Bank登录号:KJ652972)。Cs PPT完整ORF长度为1 227 bp,编码408个氨基酸,蛋白分子量为44.7k Da,理论等电点为10.16;无信号肽位点,属于非分泌型蛋白;建立了茶树Cs PPT蛋白的系统发育树;磷酸化修饰预测该蛋白质多肽链中共有26个磷酸化位点;TMHMM预测表明Cs PPT蛋白为跨膜蛋白;亚细胞定位发现,Cs PPT蛋白定位于叶绿体上,推测Cs PPT蛋白可能定位于叶绿体膜上。荧光定量PCR结果表明Cs PPT基因在茶树花中表达量最高,其次为芽、叶和嫩茎,根中最低。

不同亚型缺血性脑卒中与磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶启动子232基因多态性的研究

目的研究磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK1)启动子232基因多态性与不同亚型缺血性脑卒中的关系。方法 165例缺血性脑卒中患者,采用CISS分型法分为动脉粥样硬化血栓形成亚组(AT)、急性穿支小动脉闭塞亚组(APSAO)和心源性栓塞亚组(CE),并选取健康成人90例作为对照组,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法,进行PCK1启动子-232基因多态性分析,比较各组间基因型分布及等位基因频率。结果 (1)PCK1启动子232突变纯合子GG基因型及突变G等位基因频率,在AT、APSAO亚组显著高于对照组(P<0.05),而CE组突变基因型频率及突变等位基因频率与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)收缩压、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高血压史、糖尿病史、PCK1启动子232基因多态性(P=0.005)是CIS的危险因素。结论 PCK1启动子232基因多态性可能与CIS中AT、APSAO亚型相关。

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因启动子-232多态性与动脉硬化性脑梗死关系的研究

目的 探讨磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因（PCK1）启动子-232位点基因多态性与动脉硬化性脑梗死的关系。方法 选择2012年5月-2013年2月在广州医科大学附属第一医院（以下简称“我院”）神经内科住院的动脉硬化性脑梗死患者128例为脑梗死组,同时选择在我院体检中心体检的70名健康成人为对照组。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法,进行PCK1启动子-232基因多态性分析;测定血糖、血脂;颈动脉超声多普勒检查颈总动脉内膜中层厚度（IMT）及颈动脉斑块。结果 脑梗死组GC、GG基因型餐后2 h血糖及低密度脂蛋白胆固醇水平均高于CC基因型,差异有统计学意义（P〈0.05）。脑梗死组GC、GG基因型及G等位基因频率明显高于对照组（P〈0.05）。脑梗死组GG＋GC基因型及G等位基因在易损斑块和非易损斑块中的分布情况比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。两组不同基因型之间左、右侧颈总动脉IMT比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 PCK1启动子-232基因多态性与广东地区汉族人群动脉硬化性脑梗死的关系密切,G等位基因可能是脑梗死的易感因素。

大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的克隆和表达

为了更好地研究磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的结构和功能,采用PCR(聚合酶链式反应)、双酶切和细胞转化等基因工程方法对磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因进行克隆并使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表达分析,扩增出一个新的大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因,将其基因克隆到原核表达载体pET-30a上,并导入到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中。通过IPTG诱导成功表达出大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。所提出的方法能够高效表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,为进一步大规模表达纯化和应用提供参考。

碱蓬PEPCase基因的克隆与分析

采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术首次获得碱蓬(Suaeda glauca)中含PEPCase基因完整编码区的cDNA序列,长度为3 038 bp。获得的序列采用生物信息学方法和系统进化方法进行分析。结果表明,获得的cDNA序列包含2 898 bp的完整开放阅读框,编码的966个氨基酸序列含有两个PEPCase活性位点以及6种其他的活性位点;预测蛋白质的相对分子质量为109 785.3,等电点为5.51,属于不稳定的亲水性蛋白;含量相对较多的氨基酸是Leu、Glu、Arg、Asp、Ser,不含Pyl和Sec;不包含跨膜结构和信号肽序列,推断为非分泌性蛋白;二级结构以α螺旋为主,三级结构为紧密球状结构;分析结果还表明获得的碱蓬PEPCase基因应该属于C3型。通过对碱蓬PEPCase基因的克隆及序列分析从而为后期碱蓬PEPCase蛋白表达的研究及获得高油量的转基因碱蓬植株奠定了基础。

农杆菌介导的PEPCase基因导入小麦的初步研究

利用根癌农杆菌遗传转化系统，以普通小麦扬麦158为材料，将玉米泛生素基因启动子（Ubi）驱动下的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEP Case）基因，以及潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）导入预培养10～12d小麦胚性愈伤组织中。经过在含100-150mg·L^-1潮霉素（hyg）的筛选培养基上连续筛选，获得了hyg抗性植株。经GUS组织化学染色检测和PCR鉴定，其中的9棵含有Ecppc基因，PCR阳性植株比例为3．03％。初步鉴定已成功地建立了小麦遗传转化系统，为进一步探讨PEP Case基因在植物中的转化和表达奠定了基础。

高粱C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的分子克隆及其转基因水稻的培育

应用PCR的方法从C4植物高粱的基因组中分离出C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(Ppc基因)。通过分步克隆的方法,将此基因插入pCAMBIA1301质粒载体上,构成重组的表达载体p1301-PEPC,并利用农杆菌介导的转化系统将其转入农垦58和中花10两个粳稻品种。经PCR分析、PEPCase活性检测、Western杂交、Northern杂交和Southern杂交等多种方法鉴定表明,C4型Ppc基因已转化进受体水稻植株的核基因组,并能高水平表达。生理学检测显示,转基因水稻植株的CO_2朴偿点和光呼吸速率显著降低,光饱和光合速率和羧化效率提高,显示出C4植物的光合特征。

铁皮石斛磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及表达分析

目的克隆铁皮石斛Dendrobium officinale磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(pepc)基因,并对其在F型和H型铁皮石斛中的表达进行分析,为研究铁皮石斛pepc基因的结构、功能提供依据。方法基于GenBank上已知的pepc基因的同源序列设计引物,应用RT-PCR和RACE等方法,克隆铁皮石斛pepc基因全长。采用荧光定量PCR方法研究pepc基因在2种铁皮石斛中的表达。结果成功克隆了铁皮石斛pepc基因,登录号为JF423930,该基因全长为3 560 bp,其中cds序列为2 895 bp,与兰科植物的同源性为80%左右,与其他科属植物的同源性达到70%以上,编码964个氨基酸。pepc基因在F型铁皮石斛中的表达量为H型的5.55倍。结论成功克隆了铁皮石斛pepc基因,且F型铁皮石斛pepc基因的表达量高于H型。

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的功能及其在基因工程中的应用

植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC,EC 4.1.1.31)是广泛存在的一种细胞质酶,催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和HCO3-生成草酰乙酸(OAA),后者可转化生成三羧酸循环的多种中间产物。PEPC在植物细胞中参与植物的光合碳同化等重要代谢途径,并且在不同组织中具有多种生理功能。PEPC同时也参与调控植物种子的营养物质合成与代谢过程,控制糖类物质流向脂肪酸合成或蛋白质合成途径。以下介绍了植物PEPC的种类、蛋白质结构特点及其在植物组织中的调控方式,并重点论述了PEPC在生物基因工程中的应用方面的进展,随着对其功能机制和应用研究的深入,将有助于植物PEPC在高产优质农作物育种、能源植物和工业微生物等的开发利用等方面得到更好的发展与应用。