蜡样芽孢杆菌0-9菌株磷酸转移酶系统对糖利用能力分析

利用蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)0-9菌株及其衍生菌株,研究蜡样芽孢杆菌磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS)对不同糖类的磷酸化和吸收利用情况,明确该菌株的PTS糖类型,并就该菌对糖的利用能力及产胞外酶的能力进行了初步分析.结果表明,葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖等均是蜡样芽孢杆菌0-9菌株的PTS糖,ptsI基因在PTS系统对糖的磷酸化过程中起到至关重要的作用,该基因功能缺失会导致突变体菌株对葡萄糖的磷酸化和吸收利用能力降低1.6倍,同时也会导致其产胞外酶的能力降低.本研究结果为深入研究蜡样芽孢杆菌0-9菌株的生防机理及基于该菌的生防制剂的研发提供了新的理论依据.

谷氨酸棒状杆菌果糖代谢阻断工程菌的构建

谷氦酸棒状杆菌不仅可以利用葡萄糖和果糖作为碳源进行糖类代谢,也可以利用这些碳源作为底物生产葡萄糖酸、甘露醇及山梨醇等产品。为了提高底物利用率和目的产物的积累量,利用代谢工程阻断糖类代谢的磷酸烯醇式丙酮酸一糖磷酸转移酶系统(phosphoenolpyruvate carbohydrate phosphotransferase system,PTS)和失活相应磷酸激酶。是实现此目标的有效手段。本实验利用同源重组和反向筛选等技术手段,分别获得ptsF单基因缺失工程菌CG△ptsF和ptsF、ptsH、ptsI三基因缺失工程菌CG△ptsF△ptsH△ptsI。工程菌的生长情况研究表明:在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CG△ptsF和工程菌CG△ptsF△ptsH△ptsI与野生型生长情况基本一致,说明葡萄糖代谢不受3个基因影响;在以蔗糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CG△ptsF和工程菌CG△ptsF△ptsH△ptsI的生长速率分别是野生型的48.4%和29.7%,菌体浓度分别是野生型的61.6%和34.1%;在以果糖为唯一碳源的培养基上,工程菌CG△ptsF菌体浓度是野生型43.2%,工程菌CG△ptsF△ptsH△ptsI生长为0,证明其完全阻断了果糖代谢,同时说明果糖的PTS系统受ptsF、ptsH和ptsI基因编码的PTS相关蛋白的联合控制。果糖代谢阻断工程菌的获得,为进一步构建以果糖原型为底物的甘露醇或山梨醇生产工程菌株提供了遗传资源,也为谷氦酸棒状杆菌的糖类代谢研究提供了理论依据。

大肠杆菌ptsHI-crr基因的敲除及其对苯丙氨酸生产的影响

L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)是重要的食品和医药中间体。利用大肠杆菌发酵葡萄糖生产苯丙氨酸时,对葡萄糖转运起重要作用的磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统(PTS)对苯丙氨酸产量有很大影响。由ptsHI-crr操纵子编码的磷酸组氨酸载体蛋白(HPr),酶I(EI)和酶IIAGlc是PTS的必要组分,通过敲除ptsHI-crr得到PTS缺陷菌株,可以使葡萄糖代谢更多地流向苯丙氨酸生物合成。采用Red同源重组技术将大肠杆菌染色体上的ptsHI-crr基因替换为四环素抗性基因,得到PTS缺陷菌株。该菌株在以葡萄糖为惟一碳源的培养基中摇瓶培养,菌密度为对照菌株的2.7倍,苯丙氨酸产量为对照菌株的6.3倍。

盐胁迫对黄瓜幼苗光合作用及其关键酶基因表达特性的影响

以对盐胁迫敏感性不同的两个黄瓜品种中农大22号和戴多星为材料，研究了盐胁迫下黄瓜幼苗叶片光合特性、叶绿体超微结构以及光合作用关键酶1，5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（Rubisco）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性及其编码基因表达的变化。

大肠杆菌分解代谢产物阻遏效应研究进展

细菌在多种碳源共存的环境中优先利用一种(通常是葡萄糖)的现象被称为分解代谢产物阻遏效应。国内现有分子生物学及相关课程教材普遍对该效应的机理解释不清甚至给出错误的解释。大肠杆菌葡萄糖-乳糖分解代谢产物阻遏效应产生的根本原因不是胞内葡萄糖的存在,而是葡萄糖经PTS(Phosphoenolpyruvate:carbohydratephosphotransferase system)系统向胞内运输同时藕联磷酸化的过程。磷酸向葡萄糖的传递导致PTS关键组分EⅡAGlc去磷酸化形式的积累。该形式的EⅡAGlc可以与质膜上本底表达的乳糖透性酶LacY结合,阻止诱导物乳糖的吸收。cAMP的影响也是通过激活参与PTS系统的关键基因而加强了诱导物排斥作用。此外,去磷酸化形式的EⅡBGlc和YeeⅠ对全局性转录阻遏蛋白Mlc活性的抑制也保证了PTS系统关键组分蛋白的基因表达。文章综述了近年来有关大肠杆菌分解代谢产物阻遏效应机理的最新研究进展,并对相关教材有关这一内容的阐述提出了修改建议。

过表达pps基因和aroG^(fbr)基因对北京棒杆菌L-色氨酸合成的影响

【目的】通过增加北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)PD-67芳香族氨基酸合成的前体物质磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的供应,解除终产物对芳香族氨基酸合成途径中第一个酶同时也是关键酶3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合酶(DS)的反馈抑制并提高抗反馈抑制的DS的活力,使碳流更多地流向芳香族氨基酸合成途径,从而积累更多L-色氨酸。【方法】运用PCR技术扩增北京棒杆菌PD-67磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因pps,与表达载体连接构建重组质粒pXPS;运用重叠PCR技术定点突变大肠杆菌(Escherichia coli)受苯丙氨酸调控的DS基因aroG,使相应的编码氨基酸序列发生突变:Leu175Asp,新的基因命名为aroGfbr,与表达载体连接构建重组质粒pXA;构建pps和aroGfbr的共表达重组质粒pXAPS。将3个重组质粒分别转入菌株PD-67,构建工程菌株PD-67/pXPS、PD-67/pXA和PD-67/pXAPS。通过摇瓶发酵研究工程菌株的发酵特性。【结果】酶活分析结果表明,pps基因和aroGfbr基因在北京棒杆菌PD-67中均实现了表达。工程菌株PD-67/pXA粗酶液DS抗反馈抑制分析表明,AroGfbr已解除酪氨酸和苯丙氨酸的反馈抑制。过表达pps基因和aroGfbr基因分别使工程菌L-色氨酸产量提高12.1%和26.8%,双基因共表达可使工程菌的产酸量提高35.9%。【结论】北京棒杆菌PD-67pps基因的过表达以及大肠杆菌来源的解除反馈抑制的aroGfbr的过表达均有助于增加PD-67 L-色氨酸的合成,而双基因的共表达可以进一步提高L-色氨酸的积累量。