白念珠菌磷酸甘油酸激酶1的原核表达及免疫原性分析

目的构建白念珠菌基因磷酸甘油酸激酶1(PGK-1)基因的原核表达质粒并诱导其表达,对其免疫原性进行分析。方法 PCR法获取白念珠菌SC5314的PGK-1基因,插入原核表达载体pET30a中,以重组质粒转染感受态细胞E.coli BL21,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE检测蛋白的表达情况,并用Western blot法验证。用纯化获取的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA对蛋白的免疫原性进行评价。结果成功构建原核表达质粒pET-30a-pgk-1,诱导后表达的重组蛋白相对分子质量(M r)约为54 810。ELISA检测抗体效价约为1∶1 024。结论成功获得白念珠菌PGK-1重组蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性。

下调磷酸甘油酸激酶1增强胶质瘤U251细胞的放射敏感性

目的研究磷酸甘油酸激酶1(PGK1)对胶质瘤U251细胞放射敏感性的影响。方法建立放射抵抗的U251(RR-U251)细胞;LipofectamineTM2000方法将抑制PGK1表达的shRNA-PGK1质粒或对照shRNANC转染至U251细胞;荧光定量PCR及Western Blot检测PGK1的表达;MTT检测细胞相对存活率,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell小室实验检测细胞侵袭能力。结果与正常U251细胞相比,RR-U251细胞中PGK1的表达明显增高;放射处理后,RR-U251细胞的相对存活率升高,迁移能力及侵袭能力增强。转染shRNA-PGK1的细胞接受放射处理后,与对照组相比,细胞的相对存活率降低,迁移能力以及侵袭能力减弱。结论下调U251细胞中PGK1的表达可增加其放射敏感性,提示PGK1可能成为增强放射敏感性的调控靶点。

用双水相萃取分离纯化磷酸甘油酸激酶和磷酸甘油醛脱氢酶

用聚乙二醇（ＰＥＧ）／羟丙基淀粉（ＲｅｐｐａｌＰＥＳ）双水相体系两步法从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶（ＰＧＫ）和磷酸甘油醛脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）。ＰＧＫ在上相收率及ＧＡＰＤＨ在下相收率均在８０％以上。放大采用离心倾析机（ｄｅｃａｎｔｅｒ）连续处理匀浆液，用离心萃取器（ｓｅｐａｒａｔｏｒ）完成双水相体系的萃取两相分离。整个工艺具有处理量大、接触时间短。

用快速琼脂糖层析纯化磷酸甘油酸激酶及磷酸甘油醛脱氢酶

研究了用快速琼脂糖离子交换层析(DEAE-Fast Flow Sepharose)结合PEG 4000/Reppal PES双水相体系从黄豆中分离纯化磷酸甘油酸激酶(PGK)及磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。控制床层高度(10～20cm),径向放大具有压降低的优点,设计多点进料取代传统的中心管进料,解决了径向流场不均匀的问题。GAPDH的总收率及纯化倍数分别为58％和144,PGK的总收率及纯化倍数分别为41％和44。工艺成本为2.92美元/ku GPADH,具有一定的实用价值。

体外蒿甲醚伍用血红素对血吸虫磷酸甘油酸激酶和丙酮酸激酶的影响

目的 观察体外蒿甲醚与血红素伍用对日本血吸虫磷酸甘油酸激酶（PGK）和丙酮酸激酶（PK）的影响。方法 以 4～5周龄的血吸虫,置于含蒿甲醚和/或血红素的培素液内培养24h后,测定虫体的PGK和PK酶活力。结果体外,蒿甲醚（50μmol/L）或血红素（50μmol/L）对血吸虫的PGK和PK酶活力无影响,但两者伍用可引起两种酶的活力明显下降。结论 蒿甲醚对血吸虫PGK和PK的影响具有血红素依赖性。

PGK1基因变异致磷酸甘油酸激酶1缺乏症1例临床与遗传学分析

目的探讨PGK 1基因变异致Ⅸ型糖原累积病(磷酸甘油酸激酶1缺乏症)的临床特点及诊疗方法。方法回顾分析1例磷酸甘油酸激酶1缺乏患儿临床资料,分析其临床特点及实验室检查结果,采用二代测序分析基因变异筛查结果。结果患儿男性,3岁11个月首次就诊。患儿每次均以抽搐起病,起病后病情迅速加重,出现反复抽搐发作,每次病程中均有溶血性贫血,第三次住院期间出现严重的横纹肌溶解症,且发病后有明显的智力、运动发育落后,基因检测显示患儿PGK 1基因错义变异(c.150C>G),该变异导致第50号氨基酸由Cys变为Trp,来自于母亲,其母为杂合子,符合X连锁隐性遗传方式,既往文献及数据库未见报道。根据ACMG指南,此变异判定为可能致病性(基因检测时,尚未出现横纹肌溶解症),后期结合临床表现及基因检测结果,确诊为PGK 1缺乏。结论磷酸甘油酸激酶缺乏症是一类罕见的X连锁隐性遗传病,由PGK 1基因变异所致,该变异未见报道,扩充了Ⅸ型糖原累积病基因变异数据库。

磷酸甘油酸激酶1和前列腺癌临床特征的相关性及在预后预测中的作用

目的:探讨磷酸甘油酸激酶1在前列腺癌中的表达水平,并分析其与前列腺癌临床特征的相关性以及在预后预测中的作用。方法:收集2013年1月~2014年12月于南方医科大学中西医结合医院住院部行手术治疗的30例良性前列腺增生患者和132例前列腺癌患者标本,用Western blot和免疫组化法分析磷酸甘油酸激酶1在前列腺细胞以及标本中的蛋白表达,并分析磷酸甘油酸激酶1的表达水平与前列腺癌临床特征的相关性以及对前列腺癌预后预测的作用。结果:磷酸甘油酸激酶1在前列腺癌组织和细胞中的表达明显上升,且其表达水平与前列腺癌的Gleason评分、TNM分期、局部浸润、骨转移和血清前列腺特异性抗原(PSA)水平具有显著相关性;Cox分析表明骨转移、血清PSA和PGK1表达是影响前列腺癌患者生存的独立危险因素。生存曲线分析表明高表达的PGK1与前列腺癌的预后不良明显相关。结论:磷酸甘油酸激酶1是影响前列腺癌患者生存的独立危险因素,并能够作为前列腺癌的预后预测标志物。

日本血吸虫磷酸甘油酸激酶基因T/A克隆及序列分析

目的获取日本血吸虫磷酸甘油酸激酶(SjPGK)编码基因片段,分析其核苷酸序列,为日本血吸虫病疫苗研制提供候选抗原分子。方法根据曼氏血吸虫磷酸甘油酸激酶(SmPGK)cDNA序列设计1对引物,采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法,从日本血吸虫成虫总RNA中扩增SjPGK基因片段。利用T/A克隆法,将其克隆入pMD18T载体,经双酶切分析和PCR鉴定,将阳性克隆进行脱氧核糖核酸序列测定;运用Blast程序,将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果RTPCR特异性扩增出1条长约830bp大小的条带;经酶切和PCR鉴定表明所构建的质粒pMD18TSjPGK中含有所扩增的基因序列;脱氧核糖核酸序列测定和分析,SjPGK基因片段长为830bp,与SmPGK的核苷酸同源性为85%,分值为672;氨基酸同源性为94%,分值为473。结论成功克隆SjPGK编码基因片段,为进一步实验提供了条件。

磷酸甘油酸激酶1通过调控β-catenin表达促进胶质瘤细胞侵袭性生长

目的探讨磷酸甘油酸激酶1(PGK1)对β-catenin的调控作用及对胶质细胞瘤侵袭性的影响。方法以siRNA及过表达载体干扰胶质瘤U87细胞中PGK1表达水平,并经Western Blot及qRT-PCR方法验证;通过荧光双染检测PGK1与β-catenin的共定位表达情况,观察PGK1对β-catenin表达的调控作用,并检测不同PGK1与β-catenin表达情况下,U87细胞的生长增殖、侵袭能力及迁移能力的变化。在不同PGK1表达水平的U87细胞中,经Western Blot检测不同磷酸化位点的β-catenin表达水平。结果PGK1 siRNA过表达载体转染后,U87细胞生长活性、侵袭和迁移细胞数随之出现相应下降或升高。PGK1可影响β-catenin的表达,荧光双染结果提示二者共定位区域有同向变化。PGK1可影响β-catenin磷酸化活性形式的表达。使用β-catenin抑制剂(XAV 939)处理胶质瘤细胞后,对上游PGK1表达无影响,但细胞生长活性降低,侵袭和迁移细胞数减少。结论PGK1可影响胶质瘤细胞中β-catenin的表达,二者可促进胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭生长,其机制或许与PGK1所致β-catenin磷酸化有关。

华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶基因的分子表达、蛋白纯化与定性

目的选取一个华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶基因进行克隆表达、纯化,并鉴定该重组蛋白的分子特性及潜在的诊断应用价值。方法根据Genbank中华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶基因顺序(L47982)设计引物,从华支睾吸虫成虫cDNA扩增特异性片段,与pTrcHis表达载体连接,重组质粒在大肠埃希菌DH5α中表达,使用亲合层析柱纯化重组蛋白。分别使用SDS-PAGE、Western blot及ELISA鉴定重组蛋白的一般分子特性和抗原活性,以免疫组化染色法探讨该抗原在成虫组织内的分布。结果重组质粒在大肠埃希菌中成功表达,亲合层析获得高纯度的磷酸甘油酸激酶融合蛋白(rCsPGK),分子量约4.7×104。Western blot显示该重组抗原与华支睾吸虫感染阳性血清有较好的结合反应。ELISA结果显示,rCsPGK用于检测特异性抗体在数值上可区分阴阳性血清,受检阳性与混合阴性血清A值之比(P/N)为1.22～1.86,明显低于使用全虫粗抗原的P/N值(4.24～8.21)。免疫组化显示,针对rCsPGK的抗体与成虫体壁的上皮组织、卵黄腺及卵巢内虫卵有明显的染色反应。结论该研究用pTrcHis原核表达系统成功克隆和表达了华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶融合蛋白。使用亲合层析能获得高纯度、具有潜在诊断应用价值的rCsPGK抗原,但用于检测特异性抗体的敏感性低于全虫粗抗原。免疫组化表明,华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶可能主要分布在成虫体壁的上皮组织、卵黄腺及卵巢内虫卵等组织内。

鸡滑液支原体磷酸甘油酸激酶的克隆表达及酶学活性测定

磷酸甘油酸激酶(PGK)是生物进行糖酵解的关键酶,目前未见关于鸡滑液支原体(MS)PGK的相关研究报道。本实验采用Overlap PCR方法对MS的pgk基因进行点突变扩增,然后连接至pET-28a(+)表达载体并在大肠杆菌BL21中表达,纯化获得重组MSPGK(rMSPGK)蛋白,然后对纯化后的rMSPGK蛋白的酶学活性进行测定,包括温度、pH及不同底物对酶活的影响,并计算其酶比活力、米氏常数及最大反应速率。结果显示:最终获得了纯化的rMSPGK蛋白,其相对分子质量约为45 kDa;酶学活性测定显示,rMSPGK蛋白的酶比活力为100.70 IU/mg,最适酶促温度为37℃,最适pH为7.5;双倒数法求得rMSPGK蛋白相对于3-PGA的最大反应速率Vmax为370.37μmol/(L?min),米氏常数Km值为3.88 mmol/L;相对于ATP的最大反应速率Vmax为357.14μmol/(L?min),Km值为0.25 mmol/L。综上,本实验成功地表达了MS的PGK蛋白,并获得了酶活力较高的rMSPGK蛋白,为进一步研究鸡滑液支原体代谢和致病机制奠定了基础。

食管鳞癌肿瘤相关抗原磷酸甘油酸激酶1的鉴定

目的:鉴定新的食管鳞癌肿瘤相关抗原.方法:食管癌EC0156细胞总蛋白先经亚组分预分离,有效富集胞质、胞膜和胞核等组分蛋白;胞质组分蛋白经SDS-PAGE分离后分别与食管癌患者血清或健康志愿者血清共孵育,分离血清结合蛋白条带;胶内酶解阳性蛋白条带,肽段经色谱分离后用SynaptTM HDMS质谱鉴定.候选蛋白进一步Western blot经免疫组化验证.结果:总蛋白经亚组分分离后,不同组分蛋白均得到有效富集.食管癌患者血清能与EC0156细胞胞质蛋白结合,即选择性识别肿瘤相关抗原.其中,43kDa蛋白条带与食管癌血清(41.4%,12/29)和对照(3.6%,1/28)结合阳性率具有明显差异.从该蛋白条带中共鉴定到磷酸甘油酸激酶、β-actin、蛋白酶体26s亚基、S-腺苷高半胱氨酸水解酶和磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶5个高可信度蛋白.磷酸甘油酸激酶(PGK1)定位于胞质和胞核,在食管癌组织中高表达(69.23%,18/26).结论:改良血清蛋白质组分析策略(mSERPA)可有效分离鉴定肿瘤相关抗原.PGK1是食管癌候选肿瘤相关抗原,在食管癌发生发展中可能发挥重要作用.

下调磷酸甘油酸激酶1对胶质瘤U373细胞的放疗增敏作用及其机制的研究

目的研究下调磷酸甘油酸激酶1(PGK1)对U373细胞的放疗增敏作用;探讨PGK1参与的放疗增敏的可能机制。方法建立放射抵抗U373(RR-U373)细胞;采用Lipofectamine^(TM) 2000将shRNA-PGK1转染至U373细胞;对照组为0 Gy,处理组为5 Gy放射治疗。应用MTT法、划痕实验、Matrigel侵袭实验分别检测放疗前后各组细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力; Western-Blot法检测各组细胞PGK1、CIN(chronophin)和丝切蛋白1(cofilin 1,CFL1)蛋白表达量。结果在U373细胞和RR-U373细胞中,相对于对照组,下调PGK1的细胞在放疗前后的增殖、迁移及侵袭能力均减弱;下调PGK1表达后,CIN、CFL1蛋白表达水平降低。结论下调U373细胞中PGK1的表达对胶质瘤U373细胞有放疗增敏作用。PGK1可能通过调节CIN、CFL1蛋白表达影响胶质瘤细胞对放射的敏感性。

术前血清磷酸甘油酸激酶1、髓样相关蛋白8/14水平与前列腺癌根治术患者预后和生存情况相关性研究

目的:探讨术前血清磷酸甘油酸激酶1(PGK-1)、髓样相关蛋白8/14(MRP8/14)水平与前列腺癌根治术患者预后以及术后生存情况的相关性。方法:选择80例前列腺癌根治术患者以及同期健康体检的100例健康者作为研究对象,所有研究对象均检测空腹血清中PGK-1和MRP8/14水平,其中前列腺癌患者于术前和术后1个月时检测。分析血清PGK-1和MRP8/14水平与前列腺癌根治术患者预后和总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)的相关性。结果:前列腺癌组术前血清PGK-1和MRP8/14水平均显著高于健康组,术后1个月时血清PGK-1和MRP8/14水平均显著低于术前(均P<0.05)。复发患者术前血清PGK-1和MRP8/14水平均显著高于未复发患者(均P<0.05)。Log-Rank检验发现,血清PGK-1和MRP8/14低水平前列腺癌根治术患者PFS显著长于高水平患者(均P<0.01),血清PGK-1和MRP8/14低水平前列腺癌根治术患者OS也显著长于高水平患者(均P<0.01)。结论:术前血清PGK-1和MRP8/14水平均可能作为评估前列腺癌根治术患者预后和生存期的重要指标,高水平患者通常手术治疗预后较差。

热带假丝酵母磷酸甘油酸激酶基因启动子功能鉴定

热带假丝酵母是重要的工业生产菌株,但表达系统还不完善导致代谢工程育种手段受到限制。探索新的表达元件对热带假丝酵母的基因工程育种十分重要。本文通过多重序列比对从热带假丝酵母ATCC 20336基因组中扩增得到一个具有较高活性的磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子,以酵母增强型绿色荧光蛋白(yeGFP3)作为报告基因,整合到热带假丝酵母基因组上并对其表达活性进行研究。通过分离300、550、750 bp和846 bp4个长度的启动子片段分别表达yeGFP3,转化XZX宿主菌获得P-1、P-2、P-3和P-4共4个转化子。荧光显微镜结果表明,随着启动子长度的截短,荧光逐渐减弱,前3个转化子的相对荧光强度分别为P-4的4.98%、9.84%和48.4%。同时分析了4个转化子的yeGFP3转录水平,转录水平分别为P-4的5.6%、13.8%和60%。初步判断PGK1启动子至少存在2个上游激活序列(UAS)。

磷酸甘油酸激酶1与乳腺浸润癌患者预后的相关性及潜在机制探索

目的探讨磷酸甘油酸激酶1(PGK1)对乳腺浸润癌患者预后影响及潜在相关机制。方法下载TCGA数据库中乳腺浸润癌患者的RNA表达谱及临床数据,按PGK1表达水平分为高表达组(n=526)和低表达组(n=525),比较2组生存时间、肿瘤不同分期患者的PGK1表达水平;将患者所测各RNA表达水平逐一与PGK1表达水平进行Pearson相关性检测,选取相关性最高的前50个基因;对筛选出的50个基因进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。结果 PGK1高表达组患者的中位生存时间低于PGK1低表达组(P<0.05);临床分期Ⅰ期患者PGK1表达水平低于Ⅱ~Ⅳ期,Ⅳ期患者PGK1表达水平高于Ⅰ~Ⅲ期(P<0.05);T4期患者PGK1表达水平均高于其他3期(P<0.05);M1期患者PGK1表达水平高于M0期(P<0.05)。在检测的20 154个基因中,有11 872个基因与PGK1存在相关性(P<0.05),其中细胞死亡诱导DFFA样效应因子c和水通道蛋白7与PGK1表达水平的相关系数最高(r=0.8220、0.8216,P<0.05)。GO富集分析可见,主要涉及的生物学过程包括代谢过程、对刺激的反应、生物调;主要涉及的细胞组分为膜、细胞外空间、囊泡;主要涉及的分子功能为蛋白质结合、离子结合、转运活动。KEGG通路富集分析可见主要涉及的信号通路为PPAR信号通路、调节脂肪细胞中的脂肪分解、AMPK信号通路。结论 PGK1高表达与乳腺浸润癌患者远期生存率降低及肿瘤分级更高相关,这可能与其通过调控物质代谢水平从而为肿瘤细胞提供更多能量,促进肿瘤细胞生长有关。

特拉唑嗪:通过调节磷酸甘油酸酯激酶1防治帕金森病

特拉唑嗪(terazosin,TZ)作为哌唑嗪的衍生物,是长效选择性α1肾上腺受体阻滞剂,因其水溶性好,生物利用度高,半衰期长,在临床上广泛运用于高血压和良性前列腺增生的治疗。近期研究发现,TZ在特定剂量范围时能激活细胞内的磷酸甘油酸酯激酶1(Phosphoglycerate kinase1,Pgk1)保护神经细胞、防治帕金森病,该作用可能与其通过激活Pgk1改善细胞能量代谢、提高细胞内三磷酸腺苷浓度和激活热休克蛋白90相关。这提示特拉唑嗪类药物新的临床应用前景。本文将就TZ新发现的药理机制和潜在的临床运用前景等方面的研究进展进行回顾和总结,并探讨未来可能的研究方向。

子痫前期发生的危险因素及磷酸甘油酸酯激酶1和重度子痫前期的相关性分析

目的:子痫前期发生的危险因素及磷酸甘油酸酯激酶1(PGK1)和重度子痫前期的相关性分析。方法:选择2021年1月—2023年1月在青岛大学附属山东省妇幼保健院规律产检的72例子痫前期孕妇作为观察组,将观察组中35例重度子痫前期患者纳入重度组(孕20周后舒张压≥110 mmHg或收缩压≥160 mmHg或尿蛋白≥2.0 g/24 h,1 mmHg=0.133 kPa),将剩余37例患者纳入轻度组;另选择40例健康孕妇纳入对照组进行回顾性研究。检测三组的PGK1及糖脂代谢情况,采用多因素logistic回归分析子痫前期发生的危险因素,应用Pearson相关系数分析PGK1表达与重度子痫前期发生的相关性。结果:观察组抵抗素、总胆固醇(TC)、空腹血糖(FPG)、空腹胰岛素(FINS)、内脂素、糖化血红蛋白(HbA1c)、甘油三酯(TG)及PGK1表达水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);重度组抵抗素、TC、FPG、FINS、内脂素、HbA1c、TG及PGK1表达水平显著高于轻度组,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素logistic回归分析结果显示,抵抗素、TC、FPG、FINS、内脂素、HbA1c、TG及PGK1表达升高是子痫前期发生的危险因素(P<0.05)。Pearson相关系数结果显示,孕妇PGK1与重度子痫前期的发生呈正相关(r=0.654,P<0.001)。结论:孕妇发生子痫前期时糖代谢紊乱,PGK1表达异常,随着病情严重程度的增加PGK1呈增高趋势,PGK1表达与重度子痫前期的发生密切相关。

磷酸甘油酸激酶1对肝癌细胞侵袭转移及肝癌预后的影响

目的探讨磷酸甘油酸激酶（PGK）1在肝癌患者组织中的表达水平与其预后的关系及其对肝癌细胞侵袭、转移能力的影响。方法通过慢病毒载体介导PGK1在肝癌细胞中过表达，以及下调PGK1的表达，构建不同PGK1表达水平的肝癌细胞株。采用Transwell小室侵袭、划痕和克隆形成实验，检测PGK1对肝癌细胞侵袭、转移和增殖能力的影响。免疫组织化学染色法检测116例肝细胞肝癌根治性手术患者的肝癌组织中PGK1的表达水平，应用Kaplan—Meier法和Log-rank检验分析PGK1表达水平与肝癌患者术后预后的关系。PGK1蛋白表达差异比较采用f检验分析。结果PGK1在高转移潜能HCCLM3、MHCC97H肝癌细胞株中的表达水平显著高于低转移潜能的Hep3B、Huh7肝癌细胞。下调PGK1表达可明显抑制MHCC97H肝癌细胞的运动（31．2％±2．4％与12．0％±1．3％，t=21．57，P〈0．01）、侵袭[（58士11）个与（21±8）个，t=4．687，P〈0．05）]和克隆形成能力[（168．6±15．1）个与（118．4±8．1）个，t=6．250，P〈0．05]；而过表达PGK1后，肝癌细胞HeD3B的运动（62．8％±4．4％与83．6％±6．1％，t=20．56，P〈0．01）、侵袭[（80±12）个与（121±15）个，t=4．603，P〈0．05）]和克隆形成能力[（52．3±8．6）个与（84．7±9．0）个，t=27．18，P〈0．01]增强。PGK1高表达组的肝癌患者术后中位无瘤生存期和平均生存时间显著短于低表达组[（22．00±8．51）个月与尚未达到，P〈0．05；（46．00士16．87）个月与尚未达到，P〈0．01]。结论PGK1参与调节肝癌细胞转移和侵袭等生物学行为，具有促进肝癌细胞运动、侵袭能力的作用。PGK1是肝癌患者术后预后和复发的重要预测指标。