大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因的克隆与表达

通过PCR克隆了大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因manA,分别构建了含manA基因的原核和真核生物表达载体。在大肠杆菌中经IPTG诱导表达的GST-PMI融合蛋白,经亲和层析纯化和PreScission蛋白酶酶切,SDS-PAGE分析证实PMI蛋白为42 ku。对转manA基因的拟南芥进行PCR分析表明,manA基因已稳定整合到拟南芥基因组中。氯酚红显色反应证实,整合到拟南芥基因组中的manA基因能表达具有6-磷酸甘露糖异构酶活性的PMI蛋白。这些结果说明,克隆的manA基因可在细菌和高等植物中高效表达。

新型筛选标记磷酸甘露糖异构酶基因在转基因植物中的应用

广泛应用于植物遗传转化的抗生素和除草剂选择标记对环境生态和人类健康可能具有潜在风险,因此生物安全筛选标记已成为当前植物转基因研究的热点。磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)是一种新型生物安全选择标记基因,全面介绍了其作用原理、生物安全性、在植物转化中的应用与检测等,深入分析了其在植物转化中作为筛选标记存在的问题与不足,并就其发展前景进行了展望,以期为在转基因植物中的广泛应用奠定基础。

蜡状芽孢杆菌CZ磷酸甘露糖异构酶基因的克隆表达及酶学性质研究

将蜡状芽孢杆菌CZ中的磷酸甘露糖异构酶基因(pmi)进行克隆,并在大肠杆菌中进行异源表达。将PCR扩增得到的pmi基因与p ET-22b(+)表达载体进行连接,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建重组菌株BL21-p ET22b(+)-pmi,并成功表达了重组磷酸甘露糖异构酶。结果显示:克隆得到pmi基因序列全长为948 bp,编码315个氨基酸。通过镍柱His Trap HP亲和层析法纯化得到具有活性的重组酶,其蛋白分子大小约为40.8 ku。酶学性质结果显示:该酶的最适反应温度为35℃,在30~40℃酶活力相对稳定;最适p H为7.0,在弱碱性条件下保存12 h后仍存有50%以上酶活力;不同低浓度的金属离子Ni^(2+)、Ca^(2+)、Zn^(2+)、Cu^(2+)和Mg^(2+)均对该酶表现出不同程度的激活作用,其中Mn^(2+)对该酶激活作用最显著,当其浓度为1 mmol/L时,激活作用最大,而Co^(2+)对其有明显的抑制作用。

利用酵母磷酸甘露糖异构酶基因作为拟南芥遗传转化的筛选标记

利用PCR反应克隆来自酿酒酵母的磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因pmi,通过农杆菌介导的花序侵染法将PMI的基因导入受体拟南芥中,将转化后的拟南芥种子放在质量浓度为1g/L的甘露糖MS培养基上进行筛选培养,共得到抗性拟南芥植株4株。PCR反应证明酵母PMI的基因pmi已经整合到拟南芥基因组中,RT-PCR检测证明该基因的内含子能够在拟南芥中被正确剪切,同时通过GUS化学组织染色方法证明了伴随转化的GUS基因gus在拟南芥中得以表达,以上研究结果说明酵母PMI/甘露糖系统可以作为拟南芥遗传转化的筛选标记。

磷酸甘露糖异构酶-先天性糖基化障碍研究进展

磷酸甘露糖异构酶-先天性糖基化障碍(MPI-CDG)是一种可治的先天性遗传代谢病,由编码MPI的基因致病性变异导致,主要表现为腹泻、肝大、低血糖和凝血功能障碍,甘露糖有较好的治疗效果,但目前国内报道的病例数量极少,现就MPI-CDG的发病机制、临床表现、基因型、诊断、治疗和管理进展进行综述,以提高临床医师对此病的认识。

藻类磷酸甘露糖异构酶基因的序列结构特点及系统进化分析

磷酸甘露糖异构酶基因(phosphomannose isomerase,PMI)编码磷酸甘露糖异构酶(PMI),可逆催化甘露糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸之间的相互转化,在GDP-D-甘露糖的合成中起重要的作用,后者是生物体合成糖蛋白和糖脂必需的前体物质。本文根据在Genbank中已经登录的部分藻类PMI基因序列,与部分细菌、真菌、植物和动物的PMI基因序列做比较,研究其进化趋势和规律及其基因结构,为以后在大型藻类中研究该基因奠定基础。系统进化分析表明,藻类的PMI基因有2个进化方向,绿藻类的PMI基因与高等植物的进化趋势一致;而杂色藻类(硅藻和褐藻)则单独形成一个进化分支。多序列比对表明,磷酸甘露糖异构酶蛋白有3个保守区,其中有4个氨基酸残基位点是金属离子结合位点,分别为2个Glu和2个His。对部分藻类的PMI基因进行结构分析表明:在比较低等的藻类中,PMI基因没有内含子插入,而较高等的藻类中则有不同数目和长度的内含子插入。对部分藻类PMI基因的生物信息学分析结果显示,PMI基因编码的蛋白为酸性蛋白,分子量在40到60kDa之间;二级结构中均以α-螺旋和无规则卷曲为主;三级结构与二级结构相吻合。

金龟子绿僵菌甘露糖6-磷酸异构酶基因cDNA序列的克隆及分析

通过绿僵菌属甘露糖6-磷酸异构酶基因保守核苷酸区域设计简并性引物,采用RT-PCR及RACE-PCR技术成功克隆了金龟子绿僵菌mpi基因cDNA序列。该基因cDNA序列全长为1 513 bp,开放阅读框长度为1 328 bp,共编码441氨基酸。BLAST分析发现该基因演绎的氨基酸序列与其它真菌同源性较高,蛋白结构分析表明MPI蛋白是较保守的蛋白磷酸酶结构特征,主要由α螺旋和不规则卷曲构成。

金黄色葡萄球菌N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-异构酶基因的克隆与表达

目的对金黄色葡萄球菌N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-异构酶基因(APE)进行克隆、鉴定与表达,为新型抗菌药物的设计提供参考依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增APE基因,将扩增产物酶切后与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建表达APE的重组质粒,将重组质粒先转化大肠杆菌TG1内并提取质粒,经PCR、双酶切鉴定后再转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),对转化菌株进行诱导后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果构建了表达载体pET-32a(+)-APE,在37℃经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导时获得表达,表达的蛋白质相对分子质量为45.2×10~3。结论 APE基因成功克隆到表达质粒内并获得了表达。

一种源于枯草芽孢杆菌的新型甘露糖-6-磷酸异构酶的基因克隆与表达

通过PCR克隆了一种来自枯草芽孢杆菌str. 168菌株的甘露糖-6-磷酸异构酶编码基因(BSMPI-2),利用p ET-28a载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株。经IPTG诱导实现了BSMPI-2蛋白的表达,经过亲和层析纯化和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证,证实目的蛋白分子量约3. 54×10~4,BSMPI-2以L-核糖为底物时的最适反应条件为pH 8. 0、60℃、外源添加0. 5 mmol/L Co^(2+),该酶催化2 h可将29%的L-核糖异构为L-核酮糖。

水稻遗传转化甘露糖安全筛选体系的建立

根据genebank中公布的pmi基因序列设计引物,通过PCR扩增从大肠杆菌中分离出6-磷酸甘露糖异构酶基因。将该基因替换植物表达载体pCAMBIA1300中的潮霉素抗性基因hpt,构建了以pmi为选择标记基因的植物表达载体pPMI。对水稻进行了基因枪转化和农杆菌转化,研究了筛选培养基中甘露糖浓度对抗性愈伤组织频率的影响。部分抗性愈伤组织已获得再生植株,PCR检测初步证明外源基因已转入植物细胞。

PMI/甘露糖筛选体系在植物转基因中的应用

介绍了一种可在植物转基因中应用的新型筛选方法———磷酸甘露糖异构酶(PMI)法,与传统筛选体系不同,它以甘露糖为筛选剂对转化细胞进行正筛选。PMI能将甘露糖- 6 -磷酸转化成果糖- 6 -磷酸,使转化细胞以甘露糖为唯一或主要碳源而正常生长;非转化细胞由于不能利用甘露糖而停止生长。该筛选体系受基因型、培养基中其他糖和磷酸根离子浓度及培养条件等因素的影响。目前已应用于多种模式植物和经济作物的转基因筛选,在木本植物甜橙上也首获成功。其检测方法多样,除了常规转基因检测方法外,还可对酶活性进行检测,其中氯酚红法简单可靠,且无需昂贵试剂。安全评估结果表明PMI基因对人体健康和环境无害。PMI/甘露糖筛选体系有望成为植物转基因的又一有效筛选手段。

甘露糖阳性选择系统在水稻遗传转化中的应用研究进展

甘露糖阳性选择系统是近几年应用较多的一种植物转基因安全筛选体系,该体系是以大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因pmi为筛选标记基因,D-甘露糖为筛选剂进行筛选。本文简要综述了甘露糖阳性选择系统在水稻转基因研究中的应用情况。

甘露糖正向筛选体系的建立及在拟南芥遗传转化中的应用

为了研究甘露糖正向筛选体系在拟南芥转化中的有效性,本研究参照GenBank上公布的PMI基因序列,通过PCR从大肠杆菌克隆了6-磷酸甘露糖异构酶(6-phosphomannose isomerase,PMI)基因,替换植物表达载体pCAMBIA1301中的潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase,HPT)基因,并将以CaMV35S和AmCBL1P两种启动子调控的沙冬青AmCBL1基因成功地构建到重组载体pPMI上,并导入根癌农杆菌E-HA105中,然后通过农杆菌花序浸染法转入拟南芥。将获得的阳性植株通过GUS组织化学法鉴定、氯酚红(chlorophenol red,CPR)法及PCR检测,证明PMI基因已经转入拟南芥中。在不使用抗生素和除草剂的情况下这种筛选体系为转基因拟南芥筛选提供了更加安全有效的方法,并且为以后AmCBL1基因的功能验证及植物抗逆性的改良奠定了基础。

甘露糖正向筛选体系在巨尾桉遗传转化中的应用

为了研究甘露糖正向筛选体系在巨尾桉遗传转化过程中的有效性,构建了以6-磷酸甘露糖异构酶(6-phosphomannose isomerase,PMI)为筛选标记的pCAMBIA1301植物表达载体,并将该载体通过农杆菌介导的遗传转化转入木本植物巨尾桉中。将获得的阳性植株通过氯酚红(chlorophenol red,CPR)法及PCR检测,桉树遗传转化的阳性率达到26.09%。另外,通过正交试验优化法,对巨尾桉组培快繁体系建立过程中不同浓度激素配比进行了研究,建立起良好的巨尾桉组织培养再生体系,由甘露糖筛选敏感性测试,获得了巨尾桉筛选临界浓度,蔗糖与甘露糖比例为19∶11,优化了巨尾桉遗传转化体系,为今后巨尾桉组织培养与遗传转化研究提供了重要的参考依据。

甘露糖筛选体系及在转基因玉米商业化中的应用

甘露糖在己糖激酶的作用下形成6-磷酸甘露糖,进一步在磷酸甘露糖异构酶(Phosphomannose isomerase,PMI)的催化下转化成植物可利用的6-磷酸果糖,从而使转化细胞在甘露糖作为主要碳源的培养基上正常生长,而非转化细胞生长受到抑制。这一筛选体系被认为是一种正向筛选(Positive selection),已被成功地应用于重要的粮食作物和经济作物中。甘露糖筛选的植株可以通过多种方法检测,其中氯酚红检测法和试纸条检测法简单方便,适用于初步筛选。甘露糖筛选体系安全高效,已被应用于玉米商业化产品中。综述了甘露糖(mannose)筛选体系的原理、筛选特点、植株的鉴定、筛选方法的优缺点以及在商业化中的应用,列举了利用甘露糖筛选的玉米单性状转化系用于抗鳞翅目和抗鞘翅目昆虫及抗高温淀粉酶的范例及其在育种叠加中的应用。这种育种叠加使得甘露糖筛选的性状与其他性状重叠而得到更广谱的具有抗除草剂抗虫性状的商业化产品。

甘露糖对乳癌细胞增殖及表柔比星化疗敏感度影响

目的探讨甘露糖对乳癌细胞增殖及表柔比星(EPI)化疗敏感性的影响。方法免疫印迹法测定乳癌细胞(BT-549、HCC1937、T-47D、MCF-7)和正常乳腺细胞(MCF-10A细胞)代谢甘露糖的关键蛋白磷酸甘露糖异构酶(MPI)的表达。将MCF-7和T-47D细胞随机分为对照组(含体积分数0.10胎牛血清的普通培养液)、甘露糖组(25 mmol/L甘露糖)、葡萄糖组(25 mmol/L葡萄糖)、EPI组(1μmol/L EPI)、甘露糖联合EPI组(1μmol/L EPI+25 mmol/L甘露糖)和葡萄糖联合EPI组(1μmol/L EPI+25 mmol/L葡萄糖),各组分别加入含相应药物培养液,于有氧条件和乏氧条件下培养,采用噻唑蓝(MTT)比色法测定甘露糖及甘露糖联合EPI对细胞生长活性的影响,免疫印迹法检测对照组、甘露糖及葡萄糖组T-47D细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-8、Bax和Bcl-2的表达。结果 MCF-10A、BT-549、HCC1937、T-47D和MCF-7细胞中MPI表达差异有统计学意义(F=392.680,P<0.05)。与MCF-10A细胞相比,T-47D细胞MPI表达量相对较低,MCF-7细胞表达相对较高,差异有统计学意义(t=25.449、32.857,P<0.05)。有氧条件下,甘露糖组T-47D细胞增殖率较对照组明显降低(t=33.338,P<0.05),MCF-7细胞增殖率与对照组比较差异无显著性(P>0.05);甘露糖联合EPI组T-47D细胞增殖率显著低于EPI单药组,差异有统计学意义(t=22.901,P<0.05);甘露糖联合EPI组与对照组相比MCF-7细胞增殖率差异无统计学意义(P>0.05)。乏氧条件下,甘露糖组T-47D细胞和MCF-7细胞增殖率较对照组显著降低(t=24.538、35.158,P<0.05),甘露糖联合EPI组T-47D和MCF-7细胞增殖率低于EPI单药组(t=37.986、54.622,P<0.05)。与空白对照组相比较,各加药组T-47D细胞Caspase-3、Caspase-8、Bax、Bcl-2蛋白表达差异无显著性(P>0.05)。结论甘露糖能抑制乳癌细胞增殖,并增加乳癌细胞对EPI敏感性,MPI表达较低的乳癌细胞对甘露糖更敏感。

L-核糖的生产研究进展

L-核糖是合成许多抗病毒药物的关键中间体,自然界和生物体中并不存在。L-核糖的制备方法有化学合成法和生物合成法。与化学合成法相比,生物合成法对环境更加有利。生物合成法是应用微生物及其酶以核糖醇或L-阿拉伯糖为原料生产L-核糖。综述了L-核糖的制备方法以及产品的分离纯化技术,并对L-核糖的研究现状和前景进行了展望。

根癌农杆菌介导gna基因对水稻的转化

褐飞虱在中国分布很广,近年来已成为南方稻区的主要害虫。大量研究表明,进行抗虫基因分子育种是迅速改良水稻褐飞虱抗性的有效途径。采用农杆菌介导法将来源于大肠杆菌的6-磷酸甘露糖异构酶(PMI)安全选择标记基因和)花莲凝集素(GNA)抗虫基因构建于同一表达载体上进行遗传转化,获得带有安全标记基因的抗褐飞虱转基因植株。通过PCR扩增、Southern印迹和GUS检测分析表明,PMI标记基因和抗虫GNA基因同时被转入部分植株中并得到了表达,其外缘基因主要以单拷贝的方式插入水稻基因组中。对随机选取的8个转基因单株T0代种子经含潮霉素的培养基培养15d后抗感苗数统计分析表明,绝大多数转基因植株后代符合单基因的遗传分离规律。

转基因植物生物安全标记基因

在大量转基因植物被推向市场的同时 ,人们对转基因植物对环境及人类健康等许多方面可能存在的风险感到担扰。标记基因的生物安全性成为人们普遍关注的问题之一。新的标记基因不仅要求能够对转基因植物进行筛选和鉴定 ,而且必须对环境和生物都是安全的。概述并评价了绿色荧光蛋白基因、核糖醇操纵子、6 磷酸甘露糖异构酶基因、木糖异构酶基因以及谷氨酸 1

透明颤菌血红蛋白基因表达载体构建及转化地被菊研究

根据透明颤菌(Vitreoscilla)血红蛋白基因Vgb序列设计引物,采用PCR法从pTPV-Vgb载体上克隆Vgb片段并添加酶切位点XhoⅠ,构建植物表达载体pCAMBIA1301-Pmi-Vgb。通过农杆菌介导法转化地被菊品种‘粉地毯’叶片,期望获得耐水湿能力提高的安全转基因地被菊植株。经过共培养、筛选、分化等步骤共获得了32个抗性芽。PCR检测结果表明8株呈阳性,氯酚红试验表明标记磷酸甘露糖异构酶基因(Pmi)在转基因株系中均有表达。该结果为进一步研究Vgb基因在地被菊耐水湿方面的作用奠定了基础。