大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因的克隆与表达

通过PCR克隆了大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因manA,分别构建了含manA基因的原核和真核生物表达载体。在大肠杆菌中经IPTG诱导表达的GST-PMI融合蛋白,经亲和层析纯化和PreScission蛋白酶酶切,SDS-PAGE分析证实PMI蛋白为42 ku。对转manA基因的拟南芥进行PCR分析表明,manA基因已稳定整合到拟南芥基因组中。氯酚红显色反应证实,整合到拟南芥基因组中的manA基因能表达具有6-磷酸甘露糖异构酶活性的PMI蛋白。这些结果说明,克隆的manA基因可在细菌和高等植物中高效表达。

新型筛选标记磷酸甘露糖异构酶基因在转基因植物中的应用

广泛应用于植物遗传转化的抗生素和除草剂选择标记对环境生态和人类健康可能具有潜在风险,因此生物安全筛选标记已成为当前植物转基因研究的热点。磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)是一种新型生物安全选择标记基因,全面介绍了其作用原理、生物安全性、在植物转化中的应用与检测等,深入分析了其在植物转化中作为筛选标记存在的问题与不足,并就其发展前景进行了展望,以期为在转基因植物中的广泛应用奠定基础。

蜡状芽孢杆菌CZ磷酸甘露糖异构酶基因的克隆表达及酶学性质研究

将蜡状芽孢杆菌CZ中的磷酸甘露糖异构酶基因(pmi)进行克隆,并在大肠杆菌中进行异源表达。将PCR扩增得到的pmi基因与p ET-22b(+)表达载体进行连接,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建重组菌株BL21-p ET22b(+)-pmi,并成功表达了重组磷酸甘露糖异构酶。结果显示:克隆得到pmi基因序列全长为948 bp,编码315个氨基酸。通过镍柱His Trap HP亲和层析法纯化得到具有活性的重组酶,其蛋白分子大小约为40.8 ku。酶学性质结果显示:该酶的最适反应温度为35℃,在30~40℃酶活力相对稳定;最适p H为7.0,在弱碱性条件下保存12 h后仍存有50%以上酶活力;不同低浓度的金属离子Ni^(2+)、Ca^(2+)、Zn^(2+)、Cu^(2+)和Mg^(2+)均对该酶表现出不同程度的激活作用,其中Mn^(2+)对该酶激活作用最显著,当其浓度为1 mmol/L时,激活作用最大,而Co^(2+)对其有明显的抑制作用。

利用酵母磷酸甘露糖异构酶基因作为拟南芥遗传转化的筛选标记

利用PCR反应克隆来自酿酒酵母的磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因pmi,通过农杆菌介导的花序侵染法将PMI的基因导入受体拟南芥中,将转化后的拟南芥种子放在质量浓度为1g/L的甘露糖MS培养基上进行筛选培养,共得到抗性拟南芥植株4株。PCR反应证明酵母PMI的基因pmi已经整合到拟南芥基因组中,RT-PCR检测证明该基因的内含子能够在拟南芥中被正确剪切,同时通过GUS化学组织染色方法证明了伴随转化的GUS基因gus在拟南芥中得以表达,以上研究结果说明酵母PMI/甘露糖系统可以作为拟南芥遗传转化的筛选标记。

藻类磷酸甘露糖异构酶基因的序列结构特点及系统进化分析

磷酸甘露糖异构酶基因(phosphomannose isomerase,PMI)编码磷酸甘露糖异构酶(PMI),可逆催化甘露糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸之间的相互转化,在GDP-D-甘露糖的合成中起重要的作用,后者是生物体合成糖蛋白和糖脂必需的前体物质。本文根据在Genbank中已经登录的部分藻类PMI基因序列,与部分细菌、真菌、植物和动物的PMI基因序列做比较,研究其进化趋势和规律及其基因结构,为以后在大型藻类中研究该基因奠定基础。系统进化分析表明,藻类的PMI基因有2个进化方向,绿藻类的PMI基因与高等植物的进化趋势一致;而杂色藻类(硅藻和褐藻)则单独形成一个进化分支。多序列比对表明,磷酸甘露糖异构酶蛋白有3个保守区,其中有4个氨基酸残基位点是金属离子结合位点,分别为2个Glu和2个His。对部分藻类的PMI基因进行结构分析表明:在比较低等的藻类中,PMI基因没有内含子插入,而较高等的藻类中则有不同数目和长度的内含子插入。对部分藻类PMI基因的生物信息学分析结果显示,PMI基因编码的蛋白为酸性蛋白,分子量在40到60kDa之间;二级结构中均以α-螺旋和无规则卷曲为主;三级结构与二级结构相吻合。

金龟子绿僵菌甘露糖6-磷酸异构酶基因cDNA序列的克隆及分析

通过绿僵菌属甘露糖6-磷酸异构酶基因保守核苷酸区域设计简并性引物,采用RT-PCR及RACE-PCR技术成功克隆了金龟子绿僵菌mpi基因cDNA序列。该基因cDNA序列全长为1 513 bp,开放阅读框长度为1 328 bp,共编码441氨基酸。BLAST分析发现该基因演绎的氨基酸序列与其它真菌同源性较高,蛋白结构分析表明MPI蛋白是较保守的蛋白磷酸酶结构特征,主要由α螺旋和不规则卷曲构成。

金黄色葡萄球菌N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-异构酶基因的克隆与表达

目的对金黄色葡萄球菌N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-异构酶基因(APE)进行克隆、鉴定与表达,为新型抗菌药物的设计提供参考依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增APE基因,将扩增产物酶切后与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建表达APE的重组质粒,将重组质粒先转化大肠杆菌TG1内并提取质粒,经PCR、双酶切鉴定后再转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),对转化菌株进行诱导后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果构建了表达载体pET-32a(+)-APE,在37℃经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导时获得表达,表达的蛋白质相对分子质量为45.2×10~3。结论 APE基因成功克隆到表达质粒内并获得了表达。

一种源于枯草芽孢杆菌的新型甘露糖-6-磷酸异构酶的基因克隆与表达

通过PCR克隆了一种来自枯草芽孢杆菌str. 168菌株的甘露糖-6-磷酸异构酶编码基因(BSMPI-2),利用p ET-28a载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株。经IPTG诱导实现了BSMPI-2蛋白的表达,经过亲和层析纯化和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证,证实目的蛋白分子量约3. 54×10~4,BSMPI-2以L-核糖为底物时的最适反应条件为pH 8. 0、60℃、外源添加0. 5 mmol/L Co^(2+),该酶催化2 h可将29%的L-核糖异构为L-核酮糖。

日本血吸虫(中国大陆株)磷酸丙糖异构酶(SjC-TPI)基因克隆与序列分析

根据已知日本血吸虫菲律宾株TPI序列，设计合成一对5’端分别带有BamH1，Sal1酶切位点的引物P1和P2，制备日本血吸虫成虫（中国大陆株）mRNA，采用反转录聚合酶链反应技术，从mRNA中扩增出日本血吸虫中国大陆株TPI基因片段，序列分析表明，日本血吸虫（中国大陆株）TPI基因开放阅读框架全长为759bp，与曼氏血吸虫TPI基因的同源性为84％。与日本血吸虫（菲律宾株）TPI基因的同源性为99.7％。

茶树GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因cDNA全长的克隆与表达分析

抗坏血酸(Vc)是重要的抗氧化剂,在茶树体内的各种生理代谢及抵御非生物胁迫中起重要作用,Vc含量关系到绿茶品质优劣。GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)是茶树Vc生物合成途径中的关键酶之一。本研究通过RACE-PCR方法从茶树中克隆了GMP c DNA全长序列,共计1510 bp,其中包含1 086 bp的开放阅读框(ORF),编码361个氨基酸,推测蛋白分子量为39.599 k Da。BLAST分析表明,茶树GMP基因氨基酸序列与猕猴桃的亲缘性最高,达到96%。实时定量PCR分析表明,茶树新梢芽下第三叶中GMP基因表达量最高,嫩茎中最低,不同品种茶树新梢叶片中表达量存在明显差异。高温胁迫初期,GMP基因表达量及抗坏血酸含量迅速升高,然后逐渐下降且均低于同期对照。

超表达番茄GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因马铃薯对温度胁迫的响应

【目的】研究番茄GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因(GMPase)在马铃薯中的超表达对其抵御温度胁迫能力的影响。【方法】利用已经获得的超表达番茄GMPase的两个转基因马铃薯株系,用野生型马铃薯作对照,比较其在常温(25/20℃)、温度胁迫(10/5℃低温处理3 d,35/30℃高温处理3 d)及25/20℃恢复3 d后GMPase的相对表达量、抗坏血酸(AsA)含量及其相关生理指标的变化。【结果】在常温、温度胁迫与恢复阶段,与野生型植株相比,转基因马铃薯植株具有较高的GMPase相对表达量、GMPase活性、AsA和脱氢抗坏血酸(DHA)含量;高温和低温胁迫后,转基因马铃薯的脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAHR)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性均明显提高,丙二醛(MDA)和H2O2含量及细胞质膜透性均明显降低。【结论】番茄GMPase在马铃薯中的超表达可能有提高马铃薯植株抵御温度胁迫的能力。

转磷酸甘露糖变位酶基因提高水稻维生素C含量

维生素C（VC）是人体健康所必需的营养元素。人类由于缺乏VC合成途径中的最后一种酶（L-古洛糖酸内酯氧化酶）,自身不能合成VC。水稻是重要的粮食作物,增加水稻种子中VC含量,能够提高其营养价值。磷酸甘露糖变位酶（PMM）是VC合成通路中一种重要的酶,催化甘露糖-6-磷酸到甘露糖-1-磷酸的转变。将水稻PMM基因（OsPMM）构建在双右边界双元载体pMNDRBBin6上,并用种子特异表达的启动子BX14驱动其表达。通过农杆菌介导的转化系统,OsPMM基因被转入粳型三系恢复系C418中。通过分子检测,在T2代筛选到了无选择标记的转基因植株。对OsPMM基因在转基因植株中的表达进行分析,发现OsPMM基因在转基因水稻种子内的表达水平明显提高,相应地,转基因系种子中的VC含量也提高了25%-50%。

蛇足石杉1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(HsDXR1)基因克隆与表达分析

基于本实验室已获得的蛇足石杉转录组数据,获得一个编码1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase,DXR)的转录本,分析其开放阅读框序列,发现该转录本编码全长为1 440 bp的蛇足石杉DXR基因(HsDXR1),含有479个氨基酸残基。采用RT-PCR方法获得了HsDXR1全长,并对HsDXR1编码蛋白的理化性质、结构域及三维结构进行预测分析。结果显示HsDXR1编码蛋白的预测分子量为51.496 1 kDa,等电点为6.44;不含信号肽和跨膜区;亚细胞定位预测表明该蛋白最可能定位于叶绿体;具有DXR蛋白典型的结构域。实时荧光定量PCR检测HsDXR1基因在蛇足石杉的茎中表达量最高,其次为根,在叶中表达量最低。本研究获得了蛇足石杉HsDXR1基因的编码区序列,为进一步研究HsDXR1在蛇足石杉萜类化合物生物合成途径中的功能奠定基础。

日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶特异性肽段的基因克隆表达及特性鉴定

目的 应用基因工程方法制备 Sj C- TPI中特有抗原表位区域的肽段。方法 用 PCR法对Sj C- TPI与人的 TPI相应部分同源性较低的两个亲水区 15～ 6 6 aa和 12 9- 16 3aa的 DNA的基因序列进行扩增。采用基因拼接法连接后 ,克隆入表达质粒载体 p MAL - c2 x,转化入大肠杆菌 TB1 ,进行表达和鉴定。结果 该目的基因片段被成功地克隆入表达质粒载体 p MAL - c2 x,并能融合表达。经进一步纯化获得特异的重组肽段具有良好的抗原性 ,能被日本血吸虫病人血清识别 ,而不被正常人血清识别。结论 获得与人的 TPI同源性较低的特异重组肽段 。

枣GDPD甘露糖焦磷酸化酶基因的克隆及生物信息学分析

GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-D-mannose pyrophosphorylase,GMP)是植物As A生物合成的第一个关键酶,至今未见该基因在枣中的相关报道。本研究根据Gen Bank中登录的苹果、桃和草莓等植物GMP保守序列设计引物,采用同源克隆法,从"骏枣"果实中克隆出该基因并对其编码的蛋白进行了生物信息学分析。该基因包含完整的开放阅读框为1086bp,编码361个氨基酸残基,预测蛋白分子量为39.588ku,理论p I值为7.12,命名为Zj GMP(登录号KJ934995);序列分析表明,枣GMP与桃、葡萄、草莓、苹果GMP的相似性分别为88%、87%、87%和87%。进化树分析表明,该基因与桃、苹果和草莓等植物的GMP亲缘关系较近。

拟南芥GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因转化生菜的研究

维生素C是植物体内重要的抗氧化物质,同时也是人体所必需的营养物质。为了提高生菜中维生素C的含量,根据GenBank中拟南芥GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因(GMP)序列设计特异引物,从拟南芥cDNA中扩增出了GMP基因编码区片段,分别连上CaMV 35S启动子、MYC序列和NOS终止子后将含GMP基因的表达盒插入到植物表达载体pCAMBIA2301中,获得含有GMP基因的植物表达载体p2301-GMP-myc。通过农杆菌介导法转化生菜,获得了64株转基因植株,PCR检测以及荧光定量PCR分析证实外源基因已被成功导入生菜基因组中并表达。采用HPLC-ELSD测定转基因生菜中维生素C的含量。结果表明,大多数转基因生菜中维生素C的含量高于对照植株。转基因生菜中维生素C含量最高的约为对照的2.5倍。该研究证明过量表达GMP基因是提高生菜中维生素C含量的有效方法。

编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶(TPI)抗原基因的克隆与测序

目的 :获得编码日本血吸虫大陆株磷酸丙糖异构酶 ( Sjc TPI)的 c DNA基因片段 ,对其克隆与测序。方法 :以日本血吸虫大陆株成虫总 RNA为模板 ,经过逆转录 -聚合酶链 (式 )反应( RT- PCR)获得编码 Sjc TPI抗原的 c DNA片段 ,并克隆于载体 M13mp18、M13mp19,双脱氧链末端终止法测 DNA序列。结果 :体外 PCR扩增获得了编码 Sjc TPI的 0 .75kb c DNA片段 ,6个重组克隆子经酶切鉴定均有 0 .75kb片段的插入。测得编码 Sjc TPI的 DNA序列。结论 :用自行设计的引物成功地扩增了编码日本血吸虫大陆株 TPI抗原的基因片段并进行了克隆、测序 ,为制备重组 TPI进行疫苗试验打下基础。

玉米磷酸丙糖异构酶基因的克隆及原核表达

为克隆玉米(Zea mays L.)磷酸丙糖异构酶基因ZmTPI,并进行序列分析和原核表达研究,根据玉米TPI基因的cDNA全长序列设计特异引物,以玉米叶片总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增得到了约750bp的基因编码区cDNA片段,T/A克隆后进行了序列测定及序列分析,随后将克隆到的该基因片段构建到原核表达载体PGEX-4T-1上,得到的重组表达质粒GST-ZmTPI转化Bl21进行融合蛋白的诱导表达及纯化。结果显示,玉米ZmTPI(GenBank:EU959275)cDNA全长1 216bp,753bp开放阅读框编码250个氨基酸,推测分子量26.7205kDa,理论等电点为5.12;该蛋白具有高度保守的TIM结构域,与其它高等植物的同源蛋白有很高的相似性;进化树分析表明,玉米TPI与甘蔗亲缘关系最近,处于同一进化支;SDS-PAGE检测结果显示,成功诱导表达并且纯化了与预期大小一致的融合蛋白。玉米ZmTPI蛋白的基因克隆和原核表达及纯化的成功,为进一步研究目的蛋白的酶活性质及生物学功能奠定了基础。

芹菜中6-磷酸甘露糖还原酶基因的克隆、进化和表达分析

以2个芹菜品种‘津南实芹’和‘美国西芹’为试材,采用RT-PCR技术分别获得6-磷酸甘露糖还原酶(M6PR)cDNA序列。序列分析表明:来源于2个芹菜品种的6-磷酸甘露糖还原酶基因核苷酸序列全长均为930 bp,编码309个氨基酸;预测其蛋白质相对分子质量为35×103,pI值为6.38。空间结构分析显示:M6PR蛋白由11个α-螺旋和13条β-延伸主链组成,中间形成1个疏水穴;催化四分体(Asp、Tyr、Lys和His)分布于疏水穴内部,具有催化活性。进化分析显示:芹菜M6PR与卷柏、小立碗藓、云杉等远古物种的醛-酮还原酶(AKR)相似性较高。实时定量PCR表达分析表明:M6PR基因主要在芹菜的茎中表达,具有明显的组织特异性。

日本血吸虫磷酸丙糖异构酶编码基因的克隆与序列测定

目的 克隆和鉴定日本血吸虫磷酸丙糖异构酶 (SjT PI)编码基因 ,为寻找血吸虫病的候选疫苗联合应用打基础。方法 设计合成引物 ,抽提日本血吸虫成虫总RNA ,用RT PCR法从中扩增出SjTPI基因编码序列 ,将其克隆入pGEM T载体 ,用双酶切、以重组质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果 RT PCR法从成虫总RNA中扩增出大小为 75 9bpSjTPI基因编码序列 ,重组质粒 pGEM SjT PI经双酶切、PCR扩增 ,均可获得一条与RT PCR产物一致的DNA片段 ,序列测定结果表明具有一个长度为 75 9bp的完整开放阅读框 ,与日本血吸虫 (菲律宾株 )和曼氏血吸虫磷酸丙糖异构酶核苷酸序列有高度同源性 (分别为 99%和88% )。结论 该实验成功地克隆了SjTPI编码基因 ,为进一步研究提供了条件。