大片吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆表达和免疫原性分析

磷酸丙糖异构酶(TPI)是生物体糖酵解的一种关键酶,对大片吸虫获取能量而赖以生存有着十分重要的作用。本试验根据肝片吸虫TPI(GenBank:KC164346.1)的基因序列,设计带有BamHⅠ和XhoⅠ作为酶切位点的引物,以大片吸虫的cDNA为模板,扩增大片吸虫磷酸丙糖异构酶(FgTPI)基因。结果:FgTPI基因开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸,理论等电点pI为8.07;构建的重组表达质粒FgTPI-pET-28a(+)成功在大肠杆菌中表达,重组蛋白的分子量约为32 kDa;重组蛋白免疫BALB/c小鼠,收取多克隆抗体,ELISA检测结果显示,rFgTPI能诱导较高的IgG抗体水平;用感染大片吸虫动物的血清检测重组蛋白的免疫原性,Western blot分析表明,重组蛋白rFgTPI具有良好的免疫原性;生物信息学预测显示,FgTPI主要以α螺旋和β折叠为主,β转角较少,有3个较长的无规则卷曲;通过α-磷酸甘油脱氢酶偶联法测定其活性,发现FgTPI酶促反应最佳pH值为7.5,最适温度为35℃。本试验结果为深入研究FgTPI的生物学功能、评价其作为抗大片吸虫病疫苗候选分子奠定了基础。

大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因的克隆与表达

通过PCR克隆了大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因manA,分别构建了含manA基因的原核和真核生物表达载体。在大肠杆菌中经IPTG诱导表达的GST-PMI融合蛋白,经亲和层析纯化和PreScission蛋白酶酶切,SDS-PAGE分析证实PMI蛋白为42 ku。对转manA基因的拟南芥进行PCR分析表明,manA基因已稳定整合到拟南芥基因组中。氯酚红显色反应证实,整合到拟南芥基因组中的manA基因能表达具有6-磷酸甘露糖异构酶活性的PMI蛋白。这些结果说明,克隆的manA基因可在细菌和高等植物中高效表达。

金龟子绿僵菌甘露糖6-磷酸异构酶基因cDNA序列的克隆及分析

通过绿僵菌属甘露糖6-磷酸异构酶基因保守核苷酸区域设计简并性引物,采用RT-PCR及RACE-PCR技术成功克隆了金龟子绿僵菌mpi基因cDNA序列。该基因cDNA序列全长为1 513 bp,开放阅读框长度为1 328 bp,共编码441氨基酸。BLAST分析发现该基因演绎的氨基酸序列与其它真菌同源性较高,蛋白结构分析表明MPI蛋白是较保守的蛋白磷酸酶结构特征,主要由α螺旋和不规则卷曲构成。

新型筛选标记磷酸甘露糖异构酶基因在转基因植物中的应用

广泛应用于植物遗传转化的抗生素和除草剂选择标记对环境生态和人类健康可能具有潜在风险,因此生物安全筛选标记已成为当前植物转基因研究的热点。磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)是一种新型生物安全选择标记基因,全面介绍了其作用原理、生物安全性、在植物转化中的应用与检测等,深入分析了其在植物转化中作为筛选标记存在的问题与不足,并就其发展前景进行了展望,以期为在转基因植物中的广泛应用奠定基础。

蜡状芽孢杆菌CZ磷酸甘露糖异构酶基因的克隆表达及酶学性质研究

将蜡状芽孢杆菌CZ中的磷酸甘露糖异构酶基因(pmi)进行克隆,并在大肠杆菌中进行异源表达。将PCR扩增得到的pmi基因与p ET-22b(+)表达载体进行连接,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建重组菌株BL21-p ET22b(+)-pmi,并成功表达了重组磷酸甘露糖异构酶。结果显示:克隆得到pmi基因序列全长为948 bp,编码315个氨基酸。通过镍柱His Trap HP亲和层析法纯化得到具有活性的重组酶,其蛋白分子大小约为40.8 ku。酶学性质结果显示:该酶的最适反应温度为35℃,在30~40℃酶活力相对稳定;最适p H为7.0,在弱碱性条件下保存12 h后仍存有50%以上酶活力;不同低浓度的金属离子Ni^(2+)、Ca^(2+)、Zn^(2+)、Cu^(2+)和Mg^(2+)均对该酶表现出不同程度的激活作用,其中Mn^(2+)对该酶激活作用最显著,当其浓度为1 mmol/L时,激活作用最大,而Co^(2+)对其有明显的抑制作用。

金黄色葡萄球菌N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-异构酶基因的克隆与表达

目的对金黄色葡萄球菌N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸2-异构酶基因(APE)进行克隆、鉴定与表达,为新型抗菌药物的设计提供参考依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增APE基因,将扩增产物酶切后与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建表达APE的重组质粒,将重组质粒先转化大肠杆菌TG1内并提取质粒,经PCR、双酶切鉴定后再转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),对转化菌株进行诱导后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果构建了表达载体pET-32a(+)-APE,在37℃经异丙基-β-D硫代半乳糖苷诱导时获得表达,表达的蛋白质相对分子质量为45.2×10~3。结论 APE基因成功克隆到表达质粒内并获得了表达。

利用酵母磷酸甘露糖异构酶基因作为拟南芥遗传转化的筛选标记

利用PCR反应克隆来自酿酒酵母的磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因pmi,通过农杆菌介导的花序侵染法将PMI的基因导入受体拟南芥中,将转化后的拟南芥种子放在质量浓度为1g/L的甘露糖MS培养基上进行筛选培养,共得到抗性拟南芥植株4株。PCR反应证明酵母PMI的基因pmi已经整合到拟南芥基因组中,RT-PCR检测证明该基因的内含子能够在拟南芥中被正确剪切,同时通过GUS化学组织染色方法证明了伴随转化的GUS基因gus在拟南芥中得以表达,以上研究结果说明酵母PMI/甘露糖系统可以作为拟南芥遗传转化的筛选标记。

一种源于枯草芽孢杆菌的新型甘露糖-6-磷酸异构酶的基因克隆与表达

通过PCR克隆了一种来自枯草芽孢杆菌str. 168菌株的甘露糖-6-磷酸异构酶编码基因(BSMPI-2),利用p ET-28a载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株。经IPTG诱导实现了BSMPI-2蛋白的表达,经过亲和层析纯化和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证,证实目的蛋白分子量约3. 54×10~4,BSMPI-2以L-核糖为底物时的最适反应条件为pH 8. 0、60℃、外源添加0. 5 mmol/L Co^(2+),该酶催化2 h可将29%的L-核糖异构为L-核酮糖。

日本血吸虫(中国大陆株)磷酸丙糖异构酶DNA疫苗的研制及其保护性免疫的研究

目的 研究日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶 DNA疫苗诱导 C5 7BL /6小鼠的保护性免疫作用。方法 分别以 p U C19- Sj CTPI和 pc DNA1.1- IL - 12为模板设计引物 ,将 PCR扩增到的Sj CTPI基因以及 IL - 12的亚单位 P35 和 P40 基因克隆到真核表达载体 pc DNA .3.1中。大量制备 pc D-NA3.1- Sj CTPI和 pc DNA 3.1- P35 、pc DNA3.1- P40 的质粒 DNA。把 45只 5～ 6周龄 C5 7BL /6小鼠分成 3组 ,对照组 (pc DNA组 )肌肉注射 10 0μg的 pc DNA3.1;实验组 (TPI组 )肌肉注射 10 0μg的pc DNA3. 1- Sj CTPI;加强组 (TPI+ IL - 12组 )肌肉注射 10 0μg的 pc DNA 3.1- Sj CTPI及 10 0μg的pc DNA3.1- P35 和 pc DNA3.1- P40 的混合物 ,分别于第 1、5周各免疫 1次 ,第 9周每鼠用 45条尾蚴攻击感染 ,攻击后 45 d剖杀小鼠 ,计数成虫、肝内虫卵。采用免疫组化法检测 Sj CTPI在局部肌组织内的表达 ,用脾细胞培养法检测特异性抗原刺激后的 IL - 2、IL - 4、IL - 10、IFN-γ在攻击前后的水平。分别于 2次免疫前和攻击前及攻击后 2周经尾静脉采血 ,分别采用 EL ISA和 Western- blot检测血清中抗 TPI抗体。结果 Sj CTPI可在 C5 7BL /6小鼠骨骼肌细胞膜、细胞浆中得到表达。细胞因子 IL -2的水平在攻击前、后 。

日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶DNA疫苗对猪保护性免疫作用研究

目的 探讨日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶 (Sj CTPI) DNA疫苗诱导猪的保护性免疫作用。方法 分别构建并制备 pc DNA 3.1- Sj CTPI DNA疫苗及 pc DNA3.1- P35和 P40 (IL - 12的两个亚单位 )的 DNA疫苗。取上海松江本地猪 (自幼阉割 ) 30头 ,分为 A、B、C 3组 ,每组 10头。 A组 (TPI组 )每头猪于两侧臂部肌肉注射 5 0 0 μg Sj CTPI DNA疫苗 ;B组 (TPI+IL- 12组 )每头猪肌肉注射 5 0 0 μg Sj CTPI DNA及 5 0 0 μg P35 DNA疫苗、5 0 0 μg P40 DNA疫苗。C组 (对照组 )每头猪肌肉注射 5 0 0 μg pc DNA3.1质粒 DNA。共免疫 3次 ,每次间歇 3周。末次免疫后 30 d,每猪攻击 6 0 0条日本血吸虫尾蚴 (背部贴片法 )。攻击后 45 d剖杀 ,经胸主动脉灌注 ,并从门静脉处收集成虫计数。从肝脏上同一部位切下小块肝组织 ,置 5 % KOH内溶解 ,后计算每克虫卵数。比较各组间的减虫率、减雌率和减卵率。在免疫前、末次免疫后和攻击后从猪耳静脉采血 ,分离血清 ,用 EL ISA法测抗体。结果 TPI组和 TPI+IL- 12组与质粒对照组相比 ,分别获得 48.3%和 46 .2 %的减虫率 ,5 3.6 %和5 9.6 %的减雌率 ,49.4%和 6 5 .8%的减卵率。TPI组的 10头猪中有 6头在免疫后可检出抗 r Sj CTPI抗体 ,TPI+IL- 12组 10头猪中有

果糖-1,6-二磷酸醛缩酶和丙糖磷酸异构酶共表达对蓝藻光合作用效率的影响

以转高等植物ALD和TPI基因的鱼腥藻 712 0为对象 ,研究了ALD和TPI两个酶表达量对细胞光合固碳效率的影响。考察了初始pH、NaHCO3浓度和CO2 浓度对转基因藻和野生藻生长、光合活性及无机碳亲和力的影响。结果表明 ,转基因藻在较高碳源浓度下 ,其生长速率和光合放氧活性比野生藻有显著的提高 ,并且可以比野生藻耐受更高的pH。在含有 2 %CO2 的空气中 ,转基因藻对外源无机碳的亲和力比野生藻提高了 4 0

日本血吸虫(中国大陆株)磷酸丙糖异构酶(SjC-TPI)基因克隆与序列分析

根据已知日本血吸虫菲律宾株TPI序列，设计合成一对5’端分别带有BamH1，Sal1酶切位点的引物P1和P2，制备日本血吸虫成虫（中国大陆株）mRNA，采用反转录聚合酶链反应技术，从mRNA中扩增出日本血吸虫中国大陆株TPI基因片段，序列分析表明，日本血吸虫（中国大陆株）TPI基因开放阅读框架全长为759bp，与曼氏血吸虫TPI基因的同源性为84％。与日本血吸虫（菲律宾株）TPI基因的同源性为99.7％。

重组日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶蛋白质表达、纯化及特性分析

磷酸丙糖异构酶（ＴＰＩ）是已被公认的血吸虫病疫苗候选分子之一，本研究将日本血吸虫中国大陆株ＴＰＩ分子基因ＤＮＡ片段定向克隆到表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３（编码２６ｋＤａ的ＧＳＴ蛋白）中，构建重组表达质粒，然后转化大肠杆菌ＢＬ２１感受态细胞，阳性克隆用ＩＰＴＧ诱导，阳性菌株可表达分子量约５５ｋＤａ的融合蛋白（ＧＳＴ－ＴＰＩ），此融合蛋白可与ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ结合成复合物，用凝血酶切割融合蛋白复合物，获得分子量约２８ｋＤａ的重组表达ＴＰＩ分子。重组ＴＰＩ分子具有磷酸丙糖异构酶活性，并能被日本血吸虫重感染兔血清，血吸虫病人血清所识别。重组ＴＰＩ免疫家兔产生抗体的效价最高可达１∶２５６００，该血清抗体能识别日本血吸虫中国大陆株成虫抗原中分子量约２８ｋＤａ的蛋白条带。

茶树GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因cDNA全长的克隆与表达分析

抗坏血酸(Vc)是重要的抗氧化剂,在茶树体内的各种生理代谢及抵御非生物胁迫中起重要作用,Vc含量关系到绿茶品质优劣。GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMP)是茶树Vc生物合成途径中的关键酶之一。本研究通过RACE-PCR方法从茶树中克隆了GMP c DNA全长序列,共计1510 bp,其中包含1 086 bp的开放阅读框(ORF),编码361个氨基酸,推测蛋白分子量为39.599 k Da。BLAST分析表明,茶树GMP基因氨基酸序列与猕猴桃的亲缘性最高,达到96%。实时定量PCR分析表明,茶树新梢芽下第三叶中GMP基因表达量最高,嫩茎中最低,不同品种茶树新梢叶片中表达量存在明显差异。高温胁迫初期,GMP基因表达量及抗坏血酸含量迅速升高,然后逐渐下降且均低于同期对照。

超表达番茄GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶基因马铃薯对温度胁迫的响应

【目的】研究番茄GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因(GMPase)在马铃薯中的超表达对其抵御温度胁迫能力的影响。【方法】利用已经获得的超表达番茄GMPase的两个转基因马铃薯株系,用野生型马铃薯作对照,比较其在常温(25/20℃)、温度胁迫(10/5℃低温处理3 d,35/30℃高温处理3 d)及25/20℃恢复3 d后GMPase的相对表达量、抗坏血酸(AsA)含量及其相关生理指标的变化。【结果】在常温、温度胁迫与恢复阶段,与野生型植株相比,转基因马铃薯植株具有较高的GMPase相对表达量、GMPase活性、AsA和脱氢抗坏血酸(DHA)含量;高温和低温胁迫后,转基因马铃薯的脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAHR)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性均明显提高,丙二醛(MDA)和H2O2含量及细胞质膜透性均明显降低。【结论】番茄GMPase在马铃薯中的超表达可能有提高马铃薯植株抵御温度胁迫的能力。

离心力对蚕豆叶片质外体汁液中磷酸己糖异构酶活力的影响

采用真空灌注离心法提取蚕豆叶片质外体汁液 ,通过测定不同离心力条件下叶片和叶片质外体汁液中磷酸己糖异构酶 (HPI)活力 ,判断蚕豆叶片质外体提取液是否受到细胞渗出物污染的结果表明 ,采用的适宜条件为 :离心温度≤ 4℃ ,离心力 5 0 0～ 80 0×g ,离心时间 8min。此条件下所获得的蚕豆叶片质外体汁液没有或很少受到细胞质的污染。

葡甘露聚糖微波法磷酸酯化改性研究

采用Na2HPO4与Na H2PO4质量比为2∶1的混合盐为酯化剂对葡甘露聚糖(konjac glucomannan,KGM)进行磷酸酯化改性,以酯化取代度为指标,微波法改性的最佳工艺条件为反应温度60℃、微波辐射时间7 min、pH 4.0、磷酸盐的质量分数30%、微波功率800 W,获到酯化取代度为0.055 4的葡甘露聚糖磷酸单酯(konjac glucomannan phosphate,KGMP)。红外光谱表明,KGM主链分子上引入磷酸基团,得到KGMP。电镜扫描显示,KGMP颗粒体积大,结构更紧密。

磷酸丙糖异构酶的折叠及稳定性研究

从鸡胸肌中纯化出磷酸丙糖异构酶(triosephosphateisomerase,TIM),通过蛋白质内源荧光,圆二色性,紫外吸收二阶导数光谱等多种研究溶液构象的方法,对TIM被盐酸胍和热变性过程进行了详细的研究.结果表明,用不同测量方法得到TIM的变性过程均高度协同,没有观察到折叠中间态,应用单分子二态去折叠模型计算了TIM去折叠的热力学参数.通过圆二色光谱在222nm处的变化监测的TIM热变性过程也是高度协同的二态过程,天然态TIM的表观Tm为64.6℃.在低浓度盐酸胍存在下,TIM的热稳定性降低.讨论了二体蛋白质的可能去折叠机制,证明在使用的实验条件下磷酸丙糖异构酶去折叠过程中二级结构与三级结构的变化是同时发生的,其去折叠遵循观察不到二体解离的表观二态过程.

日本血吸虫磷酸丙糖异构酶小鼠免疫试验

目的：探讨从日本血吸虫大陆株成虫分离的天然磷酸丙糖异构酶抗原（ＳｊｃＴＰＩ）免疫小鼠后对尾蚴攻击感染的保护性作用。方法：采用丙酮沉淀法从日本血吸虫大陆株成虫中提取天然的ＴＰＩ抗原，并以所提纯的ＳｊｃＴＰＩ抗原加福氏佐剂经皮下和肌肉注射免疫ＮＩＨ小鼠，攻击感染后６ｗｋ收集小鼠血清并计数成虫负荷及肝、肠组织虫卵数。同时设有日本血吸虫成虫抗原（ＳＷＡＰ）免疫对照组和攻击感染对照组。结果：天然ＳｊｃＴＰＩ抗原免疫小鼠后减虫率为２１．４％－２５．０％，肝组织减卵率达５７．８％－６０．３％；ＥＬＩＳＡ法检测ＴＰＩ免疫小鼠血清抗ＴＰＩ抗体ＯＤ值明显高于对照组小鼠的ＯＤ值（Ｐ＜０．０５）。结论：天然的ＳｊｃＴＰＩ抗原具明显的免疫原性和抗原性，可以继续进行编码ＴＰＩ基因的克隆与表达。

转磷酸甘露糖变位酶基因提高水稻维生素C含量

维生素C（VC）是人体健康所必需的营养元素。人类由于缺乏VC合成途径中的最后一种酶（L-古洛糖酸内酯氧化酶）,自身不能合成VC。水稻是重要的粮食作物,增加水稻种子中VC含量,能够提高其营养价值。磷酸甘露糖变位酶（PMM）是VC合成通路中一种重要的酶,催化甘露糖-6-磷酸到甘露糖-1-磷酸的转变。将水稻PMM基因（OsPMM）构建在双右边界双元载体pMNDRBBin6上,并用种子特异表达的启动子BX14驱动其表达。通过农杆菌介导的转化系统,OsPMM基因被转入粳型三系恢复系C418中。通过分子检测,在T2代筛选到了无选择标记的转基因植株。对OsPMM基因在转基因植株中的表达进行分析,发现OsPMM基因在转基因水稻种子内的表达水平明显提高,相应地,转基因系种子中的VC含量也提高了25%-50%。