利用柞蚕核型多角体病毒表达系统表达谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶

谷氨酰胺果糖-6-磷酸酰胺转移酶(glutamine:fructose-6-phosphate amidotransferase,GFAT)是己糖胺生物合成途径(HBP)中的限速酶,与蛋白质糖基化修饰密切相关。本研究克隆的柞蚕GFAT基因(ApGFAT)CDS由2 022个碱基构成,编码674个氨基酸。将该基因连接到柞蚕杆状病毒转移载体pApM748BE后与ApNPV-Δph/egfp+共转染Tn-High Five细胞获得重组病毒。将重组病毒注射到柞蚕蛹体内,收集发病蛹血淋巴,用镍离子螯合柱纯化得到纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测表明,ApGFAT蛋白在柞蚕蛹体内得到成功表达,酶活力为0.978μmol/(min·mg)。

磷酸转移酶系统影响细菌生物膜形成的研究进展

细菌生物膜(BF)是细菌在物体表面形成的一种复杂三维结构,具有高度耐药性和环境适应性。BF的形成是细菌适应环境和导致持续感染的重要方式,其存在严重威胁人类健康。细菌磷酸转移酶系统(PTS)作为细菌糖类摄取和代谢糖类的关键系统,在细菌代谢和信号传导中发挥至关重要的作用,其通过独特的磷酸化级联反应,从而精确调控糖类的运输和代谢,进而影响细菌的生理状态和行为模式。该文就PTS关键组分在不同细菌中对其BF影响的研究进展作一综述。

变异链球菌磷酸转移酶系统ptxA、ptxB基因对细菌生长能力的影响

目的研究变异链球菌(S.mutans)磷酸转移酶系统(PTS)中抗坏血酸家族ptxA、ptxB基因对细菌生长能力的影响。方法构建ptxA、ptxB和ptxAB双重基因缺陷菌株以及ptxAB功能补偿菌株。在仅以抗坏血酸作为唯一碳源时,使用实时荧光定量聚合酶链反应检测野生株中ptxA、ptxB基因的表达情况。连续监测野生株、缺陷株和补偿株的菌液OD600值,比较其生长能力。结果经过聚合酶链反应和测序鉴定,结果证明缺陷株和补偿株构建成功。在以抗坏血酸作为唯一碳源的培养基中,野生株ptxA、ptxB基因的表达量均明显增高(P<0.01)。缺陷株的生长能力较野生株有所下降,但是在补偿株中可以得到补偿。结论 ptxA、ptxB基因与S.mutans对抗坏血酸的吸收利用密切相关,缺陷株和补偿株的构建为进一步研究目的基因在S.mutans抗坏血酸代谢中的作用机制提供了理论基础。

肺炎克雷伯菌果糖磷酸转移酶系统EⅡC编码基因frwC缺失株的构建及表型分析

目的利用同源重组技术构建肺炎克雷伯菌果糖磷酸转移酶系统(PTS系统)EⅡC编码基因frwC无痕缺失株,并构建回补株,探讨frwC基因对肺炎克雷伯菌生长、超黏表型及毒力的影响。方法利用自杀载体pKO3-Km质粒构建frwC基因缺失株,同时扩增包含frwC基因编码区、启动区及转录终止区的基因片段,克隆至pGEM-Teasy质粒电转至缺失株构建frwC基因回补株。通过生长曲线测定、高速离心实验、小鼠毒力实验分析frwC基因对肺炎克雷伯菌生长、超黏表型及毒力的影响。结果成功构建了肺炎克雷伯菌frwC基因缺失株与回补株,发现frwC基因敲除后细菌生长速度下降、黏性增加、细菌毒力减弱。结论肺炎克雷伯菌果糖磷酸转移酶系统frwC基因编码蛋白EⅡC影响细菌的生成、超黏表型及毒力。

PCR法筛选日本血吸虫cDNA文库中磷酸丙糖转移酶基因

目的 用PCR法自日本血吸虫童虫cDNA文库筛选磷酸丙糖转移酶 (TPM )基因 ,为进一步亚克隆和表达奠定基础。方法 根据GeneBank中的日本血吸虫TPM基因开放阅读框设计合成一对引物 ,应用PCR测定cDNA文库中该基因的频率。根据测得的频率 ,将适量的噬菌体接种于96孔细胞培养板上进行细菌培养扩增。再利用PCR鉴定阳性克隆所在位置 ,经过选择性扩增 ,筛选出阳性克隆 ,并环化成质粒 ,经测序验证后构建pGEM T/TPM克隆载体。结果 经过 3轮筛选 ,所得阳性克隆经过测序 ,用GenebankBLAST进行序列比较 ,证实为日本血吸虫磷酸丙糖转移酶基因。重组质粒 pGEM T经双酶切证实有约 76 0bp的插入片段。结论 从日本血吸虫cDNA文库中筛选出TPM基因 ,并成功地构建该基因的克隆载体 。

谷氨酰胺∶6-磷酸果糖酰基转移酶抑制剂细胞筛选模型的建立

目的 建立己糖胺途径的关键酶谷氨酰胺∶6 磷酸果糖酰基转移酶(glutamine∶fructose 6 phosphateamidotransferase,GFAT)抑制剂的细胞筛选模型。方法 用改进的GDH法测定GFAT的活性。以速效胰岛素依赖的葡萄糖摄取观察细胞对胰岛素的反应性;用长效胰岛素诱导HIRc细胞,形成己糖胺途径过度活跃和胰岛素抵抗的细胞模型,并应用该细胞模型和GDH法筛选GFAT抑制剂。结果 用25nmol·L-1长效胰岛素刺激HIRc细胞36h,可明显激活己糖胺途径,使GFAT活性上升47%;同时产生胰岛素抵抗,使速效胰岛素依赖的葡萄糖摄取能力降低21%。Azaserine可明显抑制该模型中GFAT的活性。结论 长效胰岛素既可过度激活HIRc细胞己糖胺途径,又可使其产生胰岛素抵抗。该模型可用于筛选GFAT抑制剂。

血吸虫磷酸丙糖转移酶基因的克隆及表达

目的 对血吸虫磷酸丙糖转移酶基因进行克隆及原核表达 ,以寻找新的预防日本血吸虫感染的疫苗候选分子。方法 用血吸虫病人阳性混合血清经大肠杆菌预吸收后对日本血吸虫童虫cDNA文库进行免疫学筛选 ,所获阳性克隆测序后 ,送GenBankBLAST进行蛋白质序列同源性比较 ,证实与其它物种的磷酸丙糖转移酶有很高的同源性。将其克隆入 pGEM-T载体质粒 ,再定向亚克隆入pBK -CMV表达质粒载体上经IPTG诱导表达后 ,用SDS -PAGE和Western -blot分析和鉴定表达产物。结果 用PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定均证实TPM基因的重组成功 ,表达产物为 32kD的融合蛋白 ,表达产物可被免疫阳性血清识别。结论 首次成功构建编码日本血吸虫磷酸丙糖转移酶基因表达载体克隆 。

化脓性链球菌磷酸酶转移系统研究进展

化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)是一种引起人类多种疾病的革兰阳性病原菌,其磷酸烯醇丙酮酸依赖性磷酸转移酶系统(Phosphoenol pyruvate-dependent phosphotransferase pathway, PTS)由系统通透酶(EII)、通用PTS系统蛋白酶I(EI)和含组氨酸蛋白(HPr)组成,受HPr磷酸化状态调节,具有摄取葡萄糖和果糖的功能,PTS组分对SLS、Mga和sagA等毒力因子表达产生影响。主要对PTS系统的组分、调节机制、糖类摄取和对毒力影响等进行综述,为化脓性链球菌PTS系统所影响的调控网络和代谢通路的深入研究提供参考。

藻类Dol-P甘露糖转移酶的系统进化分析

蛋白质O-甘露糖基化是一种广泛存在于生物体内的蛋白质翻译后修饰过程,即在Dol-P甘露糖转移酶(PMT)催化下将长萜酰甘露糖上的甘露糖连接到肽链上丝氨酸或者苏氨酸羟基的过程。本文对国际千种植物转录组计划(1KP)中22种海洋红藻及19种海洋褐藻的转录组数据库进行搜索,获得了6条来自海萝(Gloiopeltis furcata)的PMT基因序列。通过对其序列特征的分析发现藻类PMT序列与真菌及动物具有相似的亲疏水性列谱,表明真核生物PMT间具有相似的跨膜区。藻类PMT的N端较为保守,但较其他真核生物PMT的loop5存在222个氨基酸的缺失,导致其loop5处缺少了3个MIR结构域使得loop5明显减小。此外,利用贝叶斯法构建系统进化树表明藻类的PMT基因来自于内共生过程的质体基因转移。

七叶一枝花中两个尿苷二磷酸糖基转移酶基因的克隆和原核表达

尿苷二磷酸糖基转移酶(uridine diphosphate glycosyltransferases,UGTs)是重楼皂苷生物合成途径下游的关键酶,通过催化薯蓣皂苷元或偏诺皂苷元的糖基化反应以形成多种重楼皂苷.因此,获取并表征与重楼皂苷合成相关的UGTs,对于解析重楼皂苷的生物合成途径具有重要的研究价值.为此,在获得2个UGTs基因(PpUGT01和PpUGT42)全长的基础上,分别构建了它们的原核表达载体,并将其在大肠杆菌中顺利表达,同时获得了可溶性蛋白表达产物.此外,还进一步利用体外酶促反应对PpUGT42的催化活性进行了分析.结果为获得催化重楼皂苷生成的关键UGTs奠定了基础,也可为人工合成重楼皂苷提供新的线索.

磷酸转移酶系统关键基因敲除对Klebsiella pneumoniae产1,3-丙二醇的影响

克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)在以葡萄糖作辅底物发酵甘油生产1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PDO)过程中,由于细胞存在碳分解代谢抑制现象,葡萄糖优先于甘油被菌体吸收代谢用于细胞生长及副产物的累积,影响1,3-PDO的合成。基于K.pneumoniae葡萄糖转运及碳代谢调控相关的磷酸转移酶系统(phosphotransferase system,PTS),利用Red重组技术对PTS系统中与葡萄糖特异性转运相关的基因ptsG(编码葡萄糖特异性转运膜透性酶EⅡBC^(Glc))、crr(编码胞浆可溶性葡萄糖特异性转运酶EⅡAGlc)分别进行敲除,并考察上述基因缺失对细胞生长、1,3-PDO合成和副产物代谢的影响。结果显示,敲除ptsG、crr基因后,甘油转化率较野生菌分别提高26.2%和42.7%,其中突变株K.pneumoniaeΔcrr的1,3-PDO的产量达到23.1 g/L,提高35.8%。上述结果表明,敲除ptsG、crr基因改造PTS系统能够有效提高底物甘油利用率,强化1,3-PDO合成。

喹啉酸磷酸核糖转移酶与疾病的研究进展

喹啉酸磷酸核糖转移酶(quinolinate phosphoribosyltransferase,QPRT)是色氨酸代谢过程中的关键酶,近年来,研究发现QPRT不仅参与诸多神经系统疾病的发病机制,还与感染性疾病、肿瘤的发生有关,本文就此进行综述。1QPRT生物学特性QPRT是磷酸核糖转移酶家族成员,通过催化喹啉酸(quinolinic acid,QA)的分解,参与NAD的从头合成途径。

多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1调控β-1,4-甘露糖基转移酶介导甲状腺癌细胞增殖机制

目的探讨多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP1)调控β-1,4-甘露糖基转移酶(ALG1)对甲状腺癌(TC)细胞增殖/凋亡的影响及其潜在机制。方法采用慢病毒表达载体(pLV)构建pLV-EGFP空载与pLV-ALG1过表达8305C细胞系,采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测细胞蛋白水平表达,使用Kaplan-Meier数据库分析TC患者总生存期(OS);采用细胞计数试剂盒(CCK)-8和集落形成实验检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况。从TCGA数据库中筛选出TC患者中与PARP1表达呈显著相关的前1000个差异基因,富集相关信号通路,比较这些通路的差异表达状况,并在过表达细胞系中进行相应验证。结果PARP1在TC细胞系中表达显著增加,且与患者OS呈负相关(P<0.05)。PARP1抑制剂(NMS-P118)显著抑制8305C细胞的增殖,促进细胞凋亡(P<0.05)。TCGA数据库筛选并富集分析发现,N-糖基化修饰信号通路显著富集,NMS-P118显著抑制了β-1,4-甘露糖基转移酶(ALG1)的表达水平(P<0.05),但对p38的影响不明显(P>0.05)。生物素标记的甘露糖结合凝集素(MBL)检测发现NMS-P118显著下调了8305C细胞的甘露糖修饰水平(P<0.05)。Kaplan-Meier数据库分析发现TC中ALG1高表达的患者OS具有降低倾向(P<0.05)。过表达ALG1可逆转NMS-P118对8305C细胞增殖的抑制,减少细胞凋亡(P<0.05)。结论PARP1可通过促进糖基转移酶ALG1的表达介导TC的增殖并抑制其凋亡,PARP1可能是治疗TC的重要新靶点。

重组日本血吸虫磷酸丙糖转移酶免疫保护性的研究

目的观察重组日本血吸虫磷酸丙糖转移酶(rSj-TPM)在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护作用,寻找新的血吸虫疫苗候选分子。方法以rSj-TPM每鼠50μg/100μl、100μg/100μl和200μg/100μl分别免疫BALB/c小鼠,同时设生理盐水对照组,尾蚴攻击模型小鼠,计算减虫率、减卵率,观察它们的抗血吸虫感染作用;病例切片观察肝脏组织中肉芽肿的变化。结果用重组Sj-TPM免疫BALB/c小鼠,1、2及3组诱导的减虫率分别为27.1%、32.1%和35.2%;1、2及3组诱导的肝组织减卵率分别为34.2%、39.29%和43.66%,各实验组与对照组比较,经t检验差别有显著意义(P<0.05);各实验组间两两比较,经X^2检验差别无显著意义(P>0.05)。病理可见重组Sj-TPM组小鼠肝脏表面较光滑,质地较软,色泽略带暗红色,隐约可见少量灰白色小点,虫卵结节较少;生理盐水组小鼠肝组织中可见大量的虫卵肉芽肿形成,肉芽肿体积较大,周围有大量炎细胞浸润,较多的肝细胞变性坏死。结论日本血吸虫磷酸丙糖转移酶可能是一种潜在的血吸虫病疫苗候选分子。

金线莲甘露糖-1-磷酸尿苷转移酶基因的克隆与表达分析

【目的】甘露糖是金线莲多糖重要组成成分,对甘露糖-1-磷酸尿苷转移酶(GMP)基因进行克隆和基因表达调控分析,为进一步研究金线莲多糖的生物合成奠定基础。【方法】以梅花山金线莲植株为材料,克隆ArGMP基因的cDNA序列和基因组序列,利用在线软件进行生物信息学分析,并对其基因表达调控模式进行qRTPCR分析。【结果】金线莲ArGMP基因ORF区序列长1086 bp,共编码361个氨基酸;基因组序列长度为1760 bp,含有3个内含子,GenBank登录号OQ030271。生物信息学分析表明:ArGMP蛋白是一种较稳定的、无跨膜结构的亲水蛋白,该蛋白与铁皮石斛、深圳拟兰、蝴蝶兰等兰科植物的亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示:ArGMP基因在金线莲不同组织中的表达量差异显著,在花中的表达量最高;在不同种植温度处理条件下,25℃时表达量最高,高温严重抑制其表达;35℃高温处理不同时间显示,处理3 h后ArGMP基因表达量显著下降;而不同浓度NaCl胁迫处理对ArGMP基因表达基本无影响。【结论】克隆了甘露糖-1-磷酸尿苷转移酶基因的cDNA序列和基因组序列,发现该基因具有组织特异性表达的特点,且该基因受温度调控,而不受盐胁迫调控,这为进一步研究金线莲多糖生物合成调控机制奠定理论基础。

转磷酸甘露糖变位酶基因提高水稻维生素C含量

维生素C（VC）是人体健康所必需的营养元素。人类由于缺乏VC合成途径中的最后一种酶（L-古洛糖酸内酯氧化酶）,自身不能合成VC。水稻是重要的粮食作物,增加水稻种子中VC含量,能够提高其营养价值。磷酸甘露糖变位酶（PMM）是VC合成通路中一种重要的酶,催化甘露糖-6-磷酸到甘露糖-1-磷酸的转变。将水稻PMM基因（OsPMM）构建在双右边界双元载体pMNDRBBin6上,并用种子特异表达的启动子BX14驱动其表达。通过农杆菌介导的转化系统,OsPMM基因被转入粳型三系恢复系C418中。通过分子检测,在T2代筛选到了无选择标记的转基因植株。对OsPMM基因在转基因植株中的表达进行分析,发现OsPMM基因在转基因水稻种子内的表达水平明显提高,相应地,转基因系种子中的VC含量也提高了25%-50%。

单增李斯特菌PTS系统转运蛋白IIB^(man)介导运动性和感染的功能研究

为探究单增李斯特菌(LM)磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白IIB^(man)在LM生长、运动性及其生物学功能,本研究以LM EGD-e株基因组为模板,经PCR扩增iiB^(man)基因的上下游基因片段(不包含iiB^(man)基因),插入质粒pKSV7以构建缺失质粒;以LM EGD-e基因组为模板,采用PCR扩增iiB^(man)基因与启动子片段,插入质粒pIMK2以构建回补质粒,经PCR和测序鉴定后,将缺失质粒转化LM EGD-e感受态细胞,通过氯霉素抗性及42℃压力下使重组质粒与LM EGD-e株的同源片段发生同源重组单交换获得一代同源重组菌株,然后在无抗性培养基中30℃培养使质粒丢失,获得缺失株ΔiiB^(man)。将回补质粒转化ΔiiB^(man)感受态细胞中,通过卡那霉素抗性筛选获得回补株CΔiiB^(man),缺失株和回补株均经PCR和测序鉴定。37℃培养EGD-e、ΔiiB^(man)、CΔiiB^(man)12 h,期间每隔1 h测定OD_(600nm)并绘制生长曲线,分析各菌株生长特性,结果显示,各菌株体外生长趋势相似。将各菌株菌液接种于TSA半固体培养基,培养至24 h和48 h时检测细菌运动圈大小,结果显示ΔiiB^(man)的运动圈直径分别是EGD-e的1.5及1.6倍(P<0.05、P<0.01),CΔiiB^(man)与EGD-e运动圈直径均基本一致。在各菌株培养上清中加入绵羊血,检测各菌株溶血能力,结果显示,ΔiiB^(man)的溶血能力较EGD-e及CΔiiB^(man)增强。将各菌株以MOI 20感染RAW264.7细胞,在感染后2 h、5 h和8 h收集细胞进行点样计数,结果显示,在感染后2 h和5 h时ΔiiB^(man)的胞内增殖能力较EGD-e及CΔiiB^(man)显著增强(P<0.05)。将各菌株以2×10^(5)cfu/只经腹腔注射感染小鼠48 h后剖杀,取肝脏和脾脏研磨并点样计数,结果显示,ΔiiB^(man)在小鼠脏器载菌量较EGD-e及CΔiiB^(man)极显著增多(P<0.001)。上述结果首次表明IIB^(man)不影响LM的生长,但影响LM的运动性及提高LM的体外溶血活性;IIB^(man)参与LM的胞内增殖和宿主脏器定植。本研究为了解LM PTS系统所介导的细菌体外环境适应及宿主感染的分子机制,以及LM感染的防控奠定了基础。

不同检测系统间血清酶结果具可比性的尝试

目的 :探讨不同检测系统间血清酶结果具可比性的方法。方法 :以罗氏试剂及程序、罗氏cfas校准品、日立 70 60为标准系统 ,奥林帕斯AU2 70 0、中生试剂为待评系统 ,分别测定 5 0份新鲜血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶 (AST)、碱性磷酸酶 (ALP)、肌酸激酶 (CK )、γ -谷氨酰基转移酶 (GGT)、乳酸脱氢酶(LDH)、羟丁酸脱氢酶 (HBDH ) ,以标准检测系统结果为Y ,待评系统结果为X ,对各指标进行线性回归 (Y =aX +b) ,以直线回归方程的a、b校正待评系统。校正完成后 ,再以标准系统、待评系统同时测定 5 0份新鲜血清中以上各指标 ,对结果进行统计分析。结果 :校正前待评系统与标准系统各指标均值相对偏倚超过 5 %的有ALT、GGT、LDH、CK、ALP ,分别为 -11 0 %、-13 5 %、-11 4%、+2 3 %、+8%。校正后 ,各指标相对偏倚均小于 5 %。结论 :以标准系统与待评系统的线性回归直线方程来校正待评系统 。

大肠杆菌ptsHI-crr基因的敲除及其对苯丙氨酸生产的影响

L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)是重要的食品和医药中间体。利用大肠杆菌发酵葡萄糖生产苯丙氨酸时,对葡萄糖转运起重要作用的磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统(PTS)对苯丙氨酸产量有很大影响。由ptsHI-crr操纵子编码的磷酸组氨酸载体蛋白(HPr),酶I(EI)和酶IIAGlc是PTS的必要组分,通过敲除ptsHI-crr得到PTS缺陷菌株,可以使葡萄糖代谢更多地流向苯丙氨酸生物合成。采用Red同源重组技术将大肠杆菌染色体上的ptsHI-crr基因替换为四环素抗性基因,得到PTS缺陷菌株。该菌株在以葡萄糖为惟一碳源的培养基中摇瓶培养,菌密度为对照菌株的2.7倍,苯丙氨酸产量为对照菌株的6.3倍。

Nampt/PBEF/visfatin在呼吸系统疾病的研究应用

尼克酰胺磷酸核糖转移酶（Nampt）又名内脏脂肪素（vis-fatin）和前B细胞克隆增强因子（PBEF）。因为Nampt已经分别被人类及小鼠基因组命名委员会指定为该基因和蛋白质的官方命名,故在本综述中,统一使用官方命名Nampt。由于Nampt具有调节尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）合成、代谢、炎症反应、细胞通透性、血管生成等多种生物学功能,进而在急性肺损伤、慢性阻塞性肺病、肺癌等多种呼吸系统疾病中发挥重要作用。深入研究Nampt与肺部疾病的关系,可能为相关疾病的诊断和治疗提供新靶点。本文就Nampt在呼吸系统相关疾病中的研究进行综述。