替米沙坦通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路抑制硬化性胃癌细胞增殖

目的研究替米沙坦对硬化性胃癌(SGC)细胞增殖的影响,并探讨其作用机制。方法常规培养胃癌细胞MKN1和SGC细胞HSC45。采用细胞计数盒8实验检测替米沙坦对MKN1和HSC45增殖能力的影响;流式细胞仪检测替米沙坦对HSC45凋亡和细胞周期的影响;蛋白质印迹法检测激活替米沙坦对HSC45自噬和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白表达的影响;采用PI3K/AKT/mTOR信号通路激活剂SC79和替米沙坦共同处理HSC45,分别检测激活PI3K/AKT/mTOR信号通路后,替米沙坦对HSC45增殖、凋亡、自噬和细胞周期的影响。结果替米沙坦呈浓度和时间依赖性抑制MKN1和HSC45细胞增殖(均P<0.001),且对HSC45细胞增殖抑制效果更为显著(P<0.05)。替米沙坦组HSC45早期凋亡率、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达量、G_(0)/G_(1)期细胞周期比例均高于对照组[(26.2±2.6)%比(1.3±0.4)%、(1.02±0.09)比(0.29±0.04)、(53.4±3.4)%比(38.1±2.9)%],磷酸化PI3K、磷酸化AKT和磷酸化mTOR蛋白表达均低于对照组(均P<0.05)。替米沙坦组和替米沙坦+SC79组HSC45细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达及G_(0)/G_(1)期细胞比例均高于对照组,但替米沙坦+SC79组均低于替米沙坦组(均P<0.05)。结论替米沙坦下调PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进SGC细胞凋亡、自噬和周期阻滞,进而抑制SGC细胞增殖能力。

针刺对脑心综合征大鼠脑组织细胞凋亡、炎症因子及丝裂原活化蛋白激酶/核因子-κB/激活蛋白-1信号通路的影响

目的探讨针刺对脑心综合征大鼠脑组织细胞凋亡、炎症因子及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)/激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)信号通路的影响。方法将36只SD大鼠随机分为针刺组、模型组和对照组,各12只。采用胶原酶加肝素联合注射大鼠尾状核制备脑心综合征大鼠模型,对照组给予等剂量生理盐水向大鼠尾状核注入,手术操作过程同模型组。模型组和假手术组均不予针刺;针刺组选心俞穴、内关穴、风府穴和水沟穴,每日针刺1次,连续3天。采用原位末端凋亡(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)法测定脑组织细胞凋亡情况;神经功能采用Zea-Longa法评估;运用酶联免疫法测定白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α水平;采用Western Blot法测定MAPK、NF-κB、AP-1蛋白表达。结果模型组和针刺组大鼠脑组织细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠脑组织AI低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠神经行为评分高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠神经行为评分低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠MAPK蛋白灰度值、NF-κB蛋白灰度值和AP-1蛋白灰度值高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠MAPK蛋白灰度值、NF-κB蛋白灰度值和AP-1蛋白灰度值低于模型组(P<0.05)。结论脑心综合征大鼠采用针刺可减轻大鼠脑组织细胞凋亡,减轻大鼠炎症因子,且可下调MAPK/NF-κB/AP-1信号通路表达。

基于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白通路探讨大株红景天注射液对缺氧H9C2心肌细胞损伤的影响

目的探讨大株红景天注射液对缺氧H9C2心肌细胞的影响及保护机制。方法取H9C2心肌细胞缺氧造模,实验分为正常组、模型组、大株红景天注射液组(简称:SI组)、尼可地尔组。采用RT-qPCR检测磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的mRNA;免疫蛋白印记法检测PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的蛋白表达;流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果与模型组比较,SI组及尼可地尔组PI3K、AKT、mTOR的mRNA表达均显著降低(P<0.05)。与模型组比较,SI组和尼可地尔组PI3K、AKT、mTOR蛋白表达无明显差异(P>0.05)。经磷酸化处理后,与模型组比较,SI组和尼可地尔组p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的蛋白表达显著下降(P<0.05);与尼可地尔组相比,SI组p-PI3K、p-AKT的蛋白表达下降(P<0.05),p-mTOR的蛋白含量无明显差异(P>0.05)。结论大株红景天注射液通过下调PI3K/AKT/mTOR通路,起到了抑制缺氧心肌细胞过度自噬,改善心肌细胞损伤的作用。

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B和丝裂原活化蛋白激酶/细胞信号调节激酶1/2信号通路抑制剂对乳腺癌细胞缺氧诱导因子-2α表达的影响

目的探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和丝裂原活化蛋白激酶/细胞信号调节激酶1/2(MEK/ERK1/2)信号通路抑制剂对缺氧诱导的乳腺癌MCF-7细胞中缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)表达的影响。方法乳腺癌MCF-7细胞常规培养24 h后,分为常氧组、缺氧组、缺氧+低剂量LY294002组、缺氧+高剂量LY294002组,缺氧+低剂量U0126组和缺氧+高剂量U0126组。常氧组细胞使用含生理盐水的RPMI 1640培养基,缺氧组细胞使用含100μmol·L-1氯化钴的RPMI 1640培养基,缺氧+低剂量LY294002组细胞使用含100μmol·L-1氯化钴和4μmol·L-1 LY294002的RPMI 1640培养基,缺氧+高剂量LY294002组细胞使用含100μmol·L-1氯化钴和40μmol·L-1 LY294002的RPMI 1640培养基,缺氧+低剂量U0126组细胞使用含100μmol·L-1氯化钴和2μmol·L-1 U0126的RPMI 1640培养基,缺氧+高剂量U0126组细胞应用含8μmol·L-1 U0126的RPMI 1640培养基,继续培养3 h。采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测各组细胞HIF-2αmRNA的表达;采用Western blot法检测各组细胞HIF-2α蛋白、磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白的表达。结果缺氧组细胞中HIF-2αmRNA相对表达量及HIF-2α蛋白、p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白相对表达量高于常氧组(P<0.05);缺氧+低剂量LY294002组、缺氧+高剂量LY294002组、缺氧+低剂量U0126组、缺氧+高剂量U0126组细胞中HIF-2αmRNA相对表达量及HIF-2α蛋白、p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白相对表达量低于缺氧组(P<0.05)。缺氧+高剂量LY294002组细胞中HIF-2αmRNA相对表达量及HIF-2α蛋白、p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白相对表达量低于缺氧+低剂量LY294002组(P<0.05);缺氧+高剂量U0126组细胞中HIF-2αmRNA相对表达量及HIF-2α蛋白、p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白相对表达量低于缺氧+低剂量U0126组(P<0.05)。结论PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信号通路可能是缺氧诱导HIF-2α表达的上游信号通路,在缺氧条件下对HIF-2α具有正向调节作用,在乳腺癌的发生、发展中发挥重要作用。

解毒祛瘀方通过抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路逆转乳腺癌细胞他莫昔芬耐药的机制研究

目的探讨解毒祛瘀方通过抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路对乳腺癌细胞他莫昔芬耐药的逆转作用及机制。方法采用低浓度逐步加量诱导法建立乳腺癌他莫昔芬耐药细胞株MCF-7C,并分为空白对照组、解毒祛瘀方(2.5 g/L)组、他莫昔芬(10μmol/L)组、他莫昔芬(10μmol/L)+解毒祛瘀方(2.5 g/L)组、胰岛素样生长因子1(IGF-1)(10μg/L)+他莫昔芬(10μmol/L)+解毒祛瘀方(2.5 g/L)组。采用噻唑蓝法验证MCF-7C细胞的耐药性、解毒祛瘀方的细胞毒性以及对MCF-7C细胞他莫昔芬耐药性的影响。利用流式细胞术检测细胞凋亡率。利用蛋白质印迹法检测各组MCF-7C细胞中PI3K/Akt/雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路相关蛋白的表达。结果 MCF-7C细胞对他莫昔芬的耐药指数为7.20;而经解毒祛瘀方(2.5 g/L)协同作用后,MCF-7C细胞对他莫昔芬的耐药指数为2.02。他莫昔芬+解毒祛瘀方组MCF-7C细胞凋亡率明显高于他莫昔芬组[(56.72±7.25)%比(13.24±0.76)%],同时p-PI3K[(0.37±0.06)比(0.68±0.07)]、p-Akt[(0.17±0.02)比(0.51±0.05)]、p-mTOR[(0.10±0.02)比(0.39±0.02)]蛋白表达量也明显低于他莫昔芬组(均P <0.05)。而加入PI2K/Akt通路激活剂IGF-1后,IGF-1+他莫昔芬+解毒祛瘀方组MCF-7C细胞增殖抑制率和凋亡率较他莫昔芬+解毒祛瘀方组均明显降低(均P <0.05)。结论解毒祛瘀方可逆转乳腺癌细胞他莫昔芬的耐药性,其作用机制可能与抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路活化有关。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路与白血病干细胞耐药的研究进展

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases,PI3Ks）信号参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。近年发现PI3Ks和其下游分子蛋白激酶B（protein kinase B,PKB或Akt）所组成的信号通路与肿瘤的发生、发展密切相关,调节肿瘤细胞的增殖、存活和凋亡。

长链非编码RNA MIR4435-2HG靶向微小RNA-1-3p调控信号通路磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B对胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制研究

目的探讨长链非编码RNA MIR4435-2HG(LncRNA MIR4435-2HG)通过调控微小RNA-1-3p(miR-1-3p)的表达对胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其可能作用机制。方法体外培养正常胰腺细胞系hTERT-HPNE与胰腺癌细胞系PANC-1、SW1990、PaTu8988、BxPC-3,将胰腺癌PaTu8988细胞按照随机数字表法分为si-MIR4435-2HG组(转染MIR4435-2HG siRNA)、si-con组(转染siRNA Control)、miR-1-3p组(转染miR-1-3p mimics)、miR-con组(转染miR-1-3p阴性对照)、si-MIR4435-2HG+an⁃ti-miR-1-3p组(共转染MIR4435-2HG siRNA与miR-1-3p抑制剂)、si-MIR4435-2HG+anti-miR-con组(共转染MIR4435-2HG siR⁃NA与miR-1-3p抑制剂的阴性对照),同时将未经任何处理的细胞作为NC组。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRTPCR)检测细胞中MIR4435-2HG与miR-1-3p的表达;双荧光素酶报告基因检测MIR4435-2HG与miR-1-3p的相互作用。四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)分析敲低MIR4435-2HG及上调miR-1-3p表达对胰腺癌细胞增殖的影响;Transwell迁移及侵袭实验检测MIR4435-2HG及上调miR-1-3p表达对胰腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。蛋白质印迹法(Western blotting)检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)及磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路相关蛋白的表达。结果MIR4435-2HG在胰腺癌细胞中的表达水平明显高于正常胰腺细胞;MIR4435-2HG可特异性结合miR-1-3p并调控其表达活性;敲低MIR4435-2HG与上调miR-1-3p表达后,可抑制胰腺癌PaTu8988细胞增殖,明显减弱细胞迁移及侵袭能力[其中NC组、miR-con组、si-MIR4435-2HG组增殖活性分别为48 h:(1.21±0.10)、(1.18±0.12)、(0.86±0.09),细胞迁移数量分别为(90.56±9.16)、(88.56±8.91)、(26.49±2.10),细胞侵袭数量分别为(160.79±16.12)、(155.09±15.49)、(69.23±7.10),均P<0.05],下调PaTu8988细胞中cyclin D1、MMP2、MMP9、p-Akt、PI3Kp110α、PI3Kp110β的表达;抑制miR-1-3p表达可促进胰腺癌PaTu8988细胞增殖、迁移及侵袭。结论敲低LncRNA MIR4435-2HG可通过靶向调控miR-1-3p表达并抑制PI3K/Akt信号通路活化而降低细胞增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达,进而减弱胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。

色瑞替尼对肺癌细胞H3122增殖及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路的影响

目的探讨色瑞替尼对肺癌细胞H3122增殖及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响。方法将对数生长期H3122细胞随机分为空白组及低、中、高剂量色瑞替尼组,每组设5个复孔。低、中、高剂量色瑞替尼组分别加入色瑞替尼,使每孔终质量浓度分别为16.67、33.33、66.66 mg·L^-1,空白组加入等量的磷酸盐缓冲液。采用甲基噻唑基四唑法检测干预24、48、72 h后各组细胞增殖抑制率,流式细胞术检测干预72 h后各组细胞凋亡率,实时荧光定量聚合酶链式反应检测干预72 h后各组细胞中PI3K、Akt、Caspase-3 mRNA相对表达量,蛋白质免疫印迹法检测干预72 h后各组细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Caspase-3蛋白表达。结果培养24、48、72 h后,低、中、高剂量色瑞替尼组细胞增殖抑制率均高于空白组(P<0.05),中、高剂量色瑞替尼组细胞增殖抑制率高于低剂量组(P<0.05),高剂量色瑞替尼组细胞增殖抑制率高于中剂量组(P<0.05);低、中、高剂量色瑞替尼组细胞增殖抑制率随时间延长均呈显著上升趋势(P<0.05)。培养72 h时,低、中、高剂量色瑞替尼组细胞凋亡率均高于空白组(P<0.05),中、高剂量色瑞替尼组细胞凋亡率高于低剂量组(P<0.05),高剂量色瑞替尼组细胞凋亡率高于中剂量组(P<0.05)。4组细胞中Caspase-3 mRNA相对表达量随色瑞替尼剂量的增加呈上升趋势,组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);4组细胞中PI3K、Akt mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。4组细胞中Caspase-3蛋白相对表达量随色瑞替尼剂量增加呈上升趋势,p-PI3K/PI3K、pAkt/Akt随色瑞替尼剂量的增加呈下降趋势,组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论色瑞替尼可抑制肺癌细胞增殖,促使其凋亡,且呈一定的剂量依赖性,其作用机制可能与调控PI3K、Akt及其下游Caspase-3基因和蛋白表达有关。

丙泊酚对过氧化氢诱导的大鼠肝Kupffer细胞氧化应激损伤及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路的影响

目的探讨丙泊酚对过氧化氢诱导的大鼠肝Kupffer细胞氧化应激损伤及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响。方法从SD大鼠肝组织中分离出Kupffer细胞。用100μmol/L过氧化氢诱导Kupffer细胞建立氧化应激损伤细胞模型,并随机分为模型组、丙泊酚低浓度组、丙泊酚中浓度组、丙泊酚高浓度组和阳性对照组,另取正常Kupffer细胞作为对照组。对照组和模型组均以不含丙泊酚的细胞培养液培养,丙泊酚低、中、高浓度组分别以含5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L丙泊酚的细胞培养液培养,阳性对照组以含0.1μmol/L盐酸右美托咪定的细胞培养液培养。培养12 h后,检测细胞活性、细胞凋亡率,细胞中乳酸脱氢酶(LDH)释放量、活性氧簇含量、过氧化氢酶(CAT)活性、PI3K和Akt磷酸化水平。结果与对照组相比,模型组Kupffer细胞活性、CAT活性、PI3K和Akt的磷酸化水平均降低,凋亡率、LDH释放量、活性氧簇含量均升高(均P<0.05);与模型组相比,阳性对照组、丙泊酚低、中浓度组Kupffer细胞活性、CAT活性、PI3K和Akt的磷酸化水平均升高,凋亡率、LDH释放量、活性氧簇含量均降低(均P<0.05),而丙泊酚高浓度组Kupffer细胞CAT活性、PI3K和Akt的磷酸化水平均降低,凋亡率、LDH释放量、活性氧簇含量均升高(均P<0.05)。结论低、中浓度(5μmol/L、25μmol/L)的丙泊酚能够减轻过氧化氢诱导的Kupffer细胞氧化应激损伤,提高细胞活性,抑制细胞凋亡,其机制可能与激活PI3K/Akt通路有关。

基于磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路探讨预防应用舒洛地特减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用研究

心肌缺血再灌注损伤在心肺复苏、冠状动脉搭桥手术等均占有极为重要的地位 ,其属于一种病理生理过程 ,现阶段相关医学研究表明 ,缺血预处理及后处理能够促进一定心肌保护效应的产生.但是,缺血处理的临床应用受到了最佳时间、安全时限等的限制.应用药物能够对缺血处理获取的相似心肌保护效应进行模拟 ,为临床研究其应用提供有效依据.本研究对河北北方学院动物实验中心提供的60只正常雄性大鼠的临床资料进行了统计分析 ,研究了基于磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K ）/蛋白激酶B （Akt）信号通路探讨预防应用舒洛地特减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用 ,现报告如下.

磷脂酰肌醇3-激酶蛋白激酶B信号通路在胃癌及癌旁组织中的表达及与其病理特征的关系

目的分析磷脂酰肌醇3-激酶蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路在胃癌及癌旁组织中的表达及与其病理特征的关系。方法选取2018年2月至2019年4月商丘市第一人民医院收治的54例胃癌患者,检测磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表达水平,对比p-PI3K、p-Akt在胃癌及癌旁组织中的表达情况和不同病理特征胃癌组织中的阳性表达率。结果p-PI3K胃癌组织阳性表达率[81.48%(44/54)]高于癌旁组织[22.22%(12/54)](P<0.05)。p-Akt胃癌组织阳性表达率[75.93%(41/54)]高于癌旁组织[20.37%(11/54)](P<0.05)。低分化、有淋巴结转移的胃癌组织p-PI3K阳性表达率高于中高分化、无淋巴结转移的胃癌组织(均P<0.05);低分化、有淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期的胃癌组织p-PI3K阳性表达率高于中高分化、无淋巴结转移、TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期的胃癌组织(均P<0.05)。结论p-PI3K、p-Akt胃癌组织阳性表达率高,p-PI3K、p-Akt表达情况与分化程度、疾病分期、淋巴结转移密切相关,PI3K/Akt信号通路可能为临床药物治疗提供新靶点。

替罗非班通过磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路对氧糖剥夺心肌细胞的干预作用

目的探讨替罗非班对氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)心肌细胞的干预作用,并探索其相关机制。方法H9C2细胞被分为正常组、模型组、替罗非班组、抑制剂组、替罗非班+抑制剂组。建立OGD细胞模型,以MTT曲线确定最终的实验浓度和作用时间为替罗非班100 nmol/L,作用时间为24 h。以流式细胞仪检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;以酶联免疫吸附试验法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)浓度;以Western Blot法检测磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、磷酸化PI3K(phosphorylation PI3K,p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和磷酸化AKT(phosphorylation AKT,p-AKT)的表达。结果和模型组比较,替罗非班组、抑制剂组、替罗非班+抑制剂组的ROS和TNF-α、IL-6、ANP、BNP浓度显著降低,p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。和抑制剂组比较,替罗非班+抑制剂组p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的表达水平显著降低,ROS和TNF-α、IL-6、ANP、BNP浓度显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论替罗非班可调控PI3K/AKT信号通路,对OGD心肌细胞起到保护作用。

基于磷脂酰肌醇3激酶与苏氨酸蛋白激酶1信号通路小檗碱调节巨噬细胞极化机制研究

目的探究小檗碱对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人髓系白血病单核细胞(THP-1)巨噬细胞极化的影响和可能作用机制。方法采用佛波酯(PMA)将THP-1细胞诱导成巨噬细胞,加入不同浓度的小檗碱,分别为对照组、小檗碱5μmol/L组、小檗碱10μmol/L组、小檗碱20μmol/L组、小檗碱40μmol/L组、小檗碱50μmol/L组,干预24 h或48 h。采用细胞计数8试剂盒检测细胞活力,筛选小檗碱最佳浓度和时间。将PMA诱导的THP-1巨噬细胞分为空白组、模型组、小檗碱组、抑制剂组、小檗碱+抑制剂组。酶联免疫吸附测定检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和转化生长因子β_(1)(TGF-β_(1))的含量;定量聚合酶链反应检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、精氨酸酶1(Arg1)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、苏氨酸蛋白激酶1(Akt1)mRNA表达情况;Western blot检测Akt1和磷酸化Akt1(p-Akt1)抗体蛋白含量。结果干预24 h时,与对照组比较,小檗碱40μmol/L组和50μmol/L组巨噬细胞活性降低(P<0.05);干预48 h时,小檗碱5μmol/L组、小檗碱10μmol/L组、小檗碱20μmol/L组、小檗碱40μmol/L组、小檗碱50μmol/L组巨噬细胞活性均低于对照组[(0.89±0.02)%、(0.82±0.03)%、(0.71±0.02)%、(0.62±0.03)%、(0.53±0.02)%vs(1.01±0.01)%,P<0.05]。小檗碱20μmol/L组处理24 h时对细胞活力影响不大,作为最佳浓度和时间。与空白组比较,模型组iNOS含量和TNF-αmRNA水平升高,TGF-β_(1)含量、Arg1 mRNA、PI3K mRNA、Akt1 mRNA及p-Akt1/Akt1蛋白表达水平降低(P<0.05);与模型组比较,小檗碱组iNOS含量和TNF-αmRNA水平降低,TGF-β_(1)含量、Arg1 mRNA、PI3K mRNA、Akt1 mRNA及p-Akt1/Akt1蛋白表达水平升高(P<0.05);与小檗碱组比较,小檗碱+抑制剂组iNOS含量和TNF-αmRNA水平升高,Arg1 mRNA、PI3K mRNA、Akt1 mRNA及p-Akt1/Akt1蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论小檗碱可通过激活PI3K/Akt1通路,抑制ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞炎性反应,并抑制巨噬细胞向M1型极化,促进其向M2型极化。

黏蛋白16基因通过磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路调节胆囊癌细胞活力和迁移

目的探讨黏蛋白16基因(MUC16)是否通过磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路调节胆囊癌细胞(GBC-SD)活力和迁移。方法过表达MUC16后,通过Real-time PCR筛选相关基质金属蛋白酶(MMP)家族的蛋白质。其次,过表达MUC16、敲低MUC16和PI3K/Akt通路抑制剂BKM120处理后,通过免疫印迹法检测PI3K/Akt通路和MMP-9的蛋白水平。最后,过表达MUC16或敲低MUC16,通过细胞计数试剂盒8(CCK-8)和刮伤实验检测GBC-SD的活力和迁移情况。结果过表达MUC16后,MMP-9 mRNA的相对表达量显著升高(P<0.05)。过表达MUC16后, MMP-9、p-Akt、PI3K的蛋白水平明显升高(P<0.05),但是PI3K抑制剂BKM120可以避免这现象。而敲低MUC16后,发现MMP-9、p-Akt、PI3K的蛋白水平明显降低(P<0.05)。过表达MUC16后,GBC-SD的细胞活力和迁移能力明显增高(P<0.05),而敲低了MUC16后,GBC-SD的细胞活力和迁移能力明显降低(P<0.05)。另外,敲低MMP-9后,GBC-SD的细胞活力和迁移能力也明显降低(P<0.05)。但是,在过表达MUC16的同时敲低MMP-9,发现GBC-SD的细胞活力和迁移能力与对照组相比差异无显著性(P>0.05)。结论 MUC16激活PI3K/Akt通路促进MMP-9的蛋白表达,进而提升胆囊癌细胞GBC-SD的细胞活力和迁移能力。

雷公藤甲素通过丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/糖原合成酶激酶-3β通路对MGC803细胞增殖、侵袭与迁移的影响

目的 探讨雷公藤甲素通过丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/糖原合成酶激酶-3β(AKT/GSK-3β)通路对MGC803细胞增殖、侵袭与迁移的影响。方法 体外培养MGC803细胞,确定雷公藤甲素的干预剂量和干预时间。将细胞分为阴性对照组(A组,不进行处理),阳性对照组(B组,10μmol/L顺铂),雷公藤甲素高、中、低剂量组(C组、D组、E组)。干预48 h,采用Transwell法检测细胞侵袭能力,采用划痕试验法检测迁移能力,采用免疫印迹(Western blot)法检测检测相关蛋白的表达。结果 随着雷公藤甲素浓度的增加,MGC803细胞增殖率降低(P <0.05);48 h时半数抑制浓度(IC50)最小,选择干预时间为48 h,C组、D组、E组的干预剂量分别为80,40,20 nmol/L。与B组比较,C组、D组、E组侵袭细胞数、细胞迁移距离及波形蛋白(vimentin),snail,p-AKT/AKT,p-GSK-3β/GSK-3β表达水平均显著升高(P <0.05),上皮钙黏素(E-cadherin)、β-联蛋白(β-catenin)表达水平均显著降低(P <0.05),且呈剂量依赖关系。结论 雷公藤甲素可通过抑制AKT/GSK-3β信号通路而抑制MGC803细胞增殖、侵袭与迁移。

血管外膜脂肪组织源性脂联素通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路促进血管内膜损伤后内皮细胞增生的研究

目的 研究血管外膜脂肪组织分泌的脂联素对血管内膜损伤后内皮细胞增生的影响及可能的分子机制.方法 将C57BL/6J野生型小鼠72只完全随机分为A组（仅剪开颈部皮肤后再缝合）、B组（给予颈动脉套管结扎）、C组（剪开颈部皮肤后于颈动脉周围移植脂联素基因敲除小鼠脂肪组织）及D组（颈动脉套管结扎同时于颈动脉周围移植脂联素基因敲除小鼠脂肪组织）,每组18只.手术8周后处死小鼠,取各组小鼠左颈总动脉切片,采用苏木精-伊红染色,观察各组小鼠颈动脉内膜增生情况并测定内膜增厚程度,以内膜面积与中膜面积的比值表示.应用酶联免疫吸附试验检测各组小鼠颈动脉组织内脂联素水平.采用蛋白质印迹法检测各组小鼠颈动脉组织内磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）及其磷酸化产物的水平.体外实验将小鼠内皮细胞以5＆#215;104个/ml接种于内皮细胞生长培养基中,将细胞分为对照组、脂联素组（在对照组基础上加入重组脂联素100 mg/L）及PI3K抑制组（在对照组基础上加入重组脂联素100 mg/L和PI3K抑制剂LY29400 250 μg/L）,利用标记5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）的微小RNA（miR-21）模拟物转染小鼠内皮细胞,使其在细胞中呈过表达状态,通过荧光显微镜观察各组内皮细胞的增生情况,比较BrdU阳性细胞百分率.结果 B组小鼠颈动脉内膜增厚程度明显大于A组、C组和D组,差异均有统计学意义[（1.37±0.09）比（0.82±0.18）、（0.71±0.05）、（1.03±0.06）,P值分别为0.023、0.001、0.010].B组小鼠脂联素的表达水平明显高于A组、C组和D组,差异有统计学意义[（95±6） ng/L比（77±5）ng/L、（55±5）ng/L、（70±7）ng/L,P=0.049、0.021、0.027].C组与D组小鼠颈动脉组织内AKT及PI3K磷酸化产物水平较A组与B组降低.体外实验脂联素组内皮细胞的BrdU阳性细胞率较对照组明显增加,差异有统计学意义[（30.0±1.7）％比（10.5±1.4）％,P＜0.01];PI3K抑制组内皮细胞的BrdU阳性细胞率较脂联素组明显降低,差异具有统计学意义[（13.9±1.8）％比（30.0±1.7）％,P＜0.01].结论 血管外膜脂肪组织源性脂联素可能通过PI3K/AKT信号通路在血管内膜损伤后促进内皮细胞增生.

蛋白激酶B及其在磷脂酰肌醇3-激酶介导的信号转导中的作用

蛋白激酶B(PKB)是原癌基因c akt的表达产物 ,它参与由生长因子激活的经磷脂酰肌醇 3 激酶 (PI3K)介导的信号转导过程。与许多蛋白激酶相似 ,PKB分子具有一特殊的AH/PH结构域 (AH/PHdomain) ,后者能介导信号分子间的相互作用。PKB是PI3K直接的靶蛋白。PI3K产生的脂类第二信使PI 3,4, P2 和PI 3,4,5 P3等均能与PKB和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶 (PDK)的AH/PH结构域结合 ,使二者转位于质膜上并活化。PDK也能使PKB磷酸化而激活 ,激活的PKB又进一步激活抗细胞凋亡机制、葡萄糖代谢 (糖原合成、糖酵解及葡萄糖的摄取 )及蛋白质合成等过程 。

芪术颗粒对肝纤维化形成过程中磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸蛋白激酶信号传导通路的影响

目的观察芪术颗粒在肝纤维化形成过程中对磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号传导通路的影响,进一步阐明其抗肝纤维化的作用机制。方法将Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、实验对照组和芪术颗粒组,采用四氯化碳复制肝纤维化模型,造模同日即给予相应治疗,芪术颗粒组2 g/(kg?d)灌胃,体积为1.0 mL/100 g体质量,实验对照组、模型组给予等体积无菌水,正常组正常喂养。分别于造模后第1、2、4周处理、取材,Western blot免疫印迹法检测p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)、Bad(Ser136)、Caspase9蛋白表达。结果与正常组比较,模型组、芪术颗粒组各时间点p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)、Bad(Ser136)、Caspase9蛋白表达均升高(P<0.05)。与模型组比较,第1、2、4周时芪术颗粒组p-Akt(Ser473)表达显著降低,第1、4周Caspase9表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);p-Akt(Thr308)、Bad(Ser136)表达低于模型组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论芪术颗粒对PI3K/Akt信号传导通路的激活有调控作用,从而抑制肝纤维化的发生和发展。

左氧氟沙星对肺结核大鼠肺组织自噬及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路的影响

目的探讨左氧氟沙星对肺结核大鼠肺组织自噬及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路的影响。方法按照随机数字表法将50只大鼠分为正常组、模型组及低、中、高剂量左氧氟沙星组,每组10只。正常组大鼠经尾静脉注射生理盐水,其余组大鼠经尾静脉注射结核杆菌悬液制备肺结核模型。造模后第2天开始,低、中、高剂量左氧氟沙星组大鼠每日分别灌胃6.5、13.0、26.0 mg·kg-1左氧氟沙星生理盐水溶液2 mL,正常组和模型组大鼠每日灌胃等体积的生理盐水,连续2个月。给药结束后处死大鼠取肺组织,采用苏木精-伊红染色观察各组大鼠肺组织病理学变化,免疫组织化学染色法检测各组大鼠肺组织中自噬标志分子微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)的表达,实时荧光定量聚合酶链反应和Western blot分别检测各组大鼠肺组织中Beclin1、Atg5、PI3K、磷酸化Akt(p-Akt)mRNA和蛋白表达。结果正常组大鼠肺组织未见炎症反应;模型组大鼠肺组织结构破坏,出现大量结核结节,呼吸道周围症性细胞浸润明显,肺实质有肺泡管、肺泡腔不规则扩大,出现干酪样坏死;低、中、高剂量左氧氟沙星组大鼠肺组织病理损伤程度较模型组明显改善,并随着药物处理剂量增加,损伤程度逐渐减轻。模型组和低、中剂量左氧氟沙星组大鼠肺组织中LC3B阳性细胞数显著多于正常组(P<0.05);高剂量左氧氟沙星组大鼠肺组织中LC3B阳性细胞数与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05);低、中、高剂量左氧氟沙星组大鼠肺组织中LC3B阳性细胞数显著少于模型组(P<0.05);中剂量左氧氟沙星组与低、高剂量左氧氟沙星组大鼠肺组织中LC3B阳性细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05);高剂量左氧氟沙星组大鼠肺组织中LC3B阳性细胞数显著少于低剂量左氧氟沙星组(P<0.05)。模型组和低、中剂量左氧氟沙星组大鼠肺组织中Beclin1 mRNA表达水平显著高于正常组(P<0.05);高剂量左氧氟沙星组与正常组大鼠肺组织中Beclin1 mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。与正常组比较,模型组和低、中、高剂量左氧氟沙星组大鼠肺组织中Atg5 mRNA表达水平显著升高,PI3K、p-Akt mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与模型组比较,低、中、高剂量左氧氟沙星组大鼠肺组织中Beclin1、Atg5 mRNA表达水平显著降低,PI3K、p-Akt mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。低、中剂量左氧氟沙星组大鼠肺组织中Beclin1、Atg5、PI3K mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05);中剂量左氧氟沙星组大鼠肺组织中p-Akt mRNA表达水平显著高于低剂量左氧氟沙星组(P<0.05)。与低剂量左氧氟沙星组比较,高剂量左氧氟沙星组大鼠肺组织中Beclin1、Atg5 mRNA表达水平显著降低,PI3K、p-Akt mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。与中剂量左氧氟沙星组比较,高剂量左氧氟沙星组大鼠肺组织中Beclin1、Atg5 mRNA表达水平显著降低,PI3K、p-Akt mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。与正常组比较,模型组和低、中剂量左氧氟沙星组大鼠肺组织中Beclin1蛋白表达水平显著升高,PI3K、p-Akt蛋白表达水平显著降低(P<0.05);高剂量左氧氟沙星组和正常组大鼠肺组织中Beclin1、PI3K、p-Akt蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05);模型组和低、中、高剂量左氧氟沙星组大鼠肺组织中Atg5蛋白表达水平均显著高于正常组(P<0.05)。与模型组比较,低、中、高剂左氧氟沙星量组大鼠肺组织中Beclin1、Atg5蛋白表达水平显著降低,PI3K、p-Akt蛋白表达水平显著升高,且呈剂量依赖性(P<0.05)。结论左氧氟沙星可能通过激活肺组织中PI3K/Akt信号通路、抑制自噬相关蛋白表达,降低肺结核大鼠肺细胞自噬水平,减轻肺损伤。

磷酯酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路介导葛根素改善缺氧复氧损伤的作用及机制

目的:探讨磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路介导葛根素改善缺氧复氧损伤的作用及机制。方法:应用噻唑蓝法筛选出合适的葛根素以及PI3K抑制剂LY294002干预人脐静脉内皮细胞EA.hy926的浓度。分为对照组、缺氧复氧组、缺氧复氧+葛根素组(葛根素组),缺氧复氧+葛根素+LY294002处理组(葛根素+抑制剂组),每组均设3个复孔。应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测葛根素预处理细胞后以及葛根素预处理细胞的同时加入LY294002后对B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3)、活化天冬氨酸蛋白水解酶-9(cleaved caspase-9)、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)、Akt蛋白表达的影响。应用实时荧光定量PCR检测葛根素预处理对EA.hy926细胞缺氧复氧后天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)和Bcl-2信使核糖核酸(mRNA)表达的影响。应用Hoechest染色检测葛根素预处理对EA.hy926细胞凋亡的影响。结果:葛根素(10^(-7)mol/L)明显升高缺氧复氧后EA.hy926细胞活力(P<0.001),并显著上调Bcl-2蛋白水平的表达,下调Bax、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白水平的表达(P均<0.01)。与缺氧复氧组相比,葛根素预处理后,p-Akt蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。加入LY294002(10μmol/L)后p-Akt蛋白表达水平下降,且抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平下降,促凋亡蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bax的表达水平升高(P均<0.01)。结论:葛根素对缺氧复氧诱导的EA.hy926细胞凋亡具有抑制作用,其抑制作用可能与其对PI3K/Akt信号通路的调控有关。