磷酸胆碱聚合物载AT1受体siRNA对血管内皮细胞AT1受体表达的影响

目的探讨新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70载AT1受体siRNA对血管内皮细胞AT1受体表达的影响。方法应用琼脂糖凝胶电泳表征具有不同N/P比值的MPC30-DEA70与siRNA的复合物;将不同比例的MPC30-DEA70/siRNA基因复合物转染至人脐静脉内皮细胞,应用荧光显微镜(FM)检测其细胞内分布;流式细胞术(FCM)检测转染效率及荧光强度;Western blot法和RT-PCR法检测AT1受体蛋白及mRNA的表达情况。结果不同N/P比值的基因复合物在电泳中可见不同程度的迟滞现象,随正电性增强而显著。FM观察到MPC30-DEA70/siRNA复合物分布在细胞核周围,FCM结果显示随N/P比值的增大,转染效率明显增加,荧光强度也随之增强。RT-PCR法和Western blot法显示随着N/P比值的增大,基因复合物可使AT1受体的mRNA和蛋白表达明显下降(P<0.05)。结论 MPC30-DEA70可作为AT1受体siRNA的载体转染至血管内皮细胞,下调AT1受体的mRNA及蛋白的表达,提示阳离子磷酸胆碱聚合物可以有效负载和运输siRNA,抑制特异基因的表达,是一种有效的非病毒类转基因载体。

新型阳离子磷酸胆碱聚合物可作为反义寡核苷酸基因的运输载体

背景:病毒类基因载体虽然具有较高的转染效率,其安全性一直受到人们的质疑。目的:以阳离子磷酸胆碱聚合物作为基因药物运输的载体,研究其对人类c-myc反义寡核苷酸(AS-ODN)的负载和运输能力,并对其安全性和有效性进行评价,方法:应用原子转移自由基聚合法合成具有高度生物相容性的双嵌段磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70,并对其溶液进行表征。用DNA凝胶电泳法对MPC30-DEA70与针对AS-ODN生成不同N/P比值的基因复合物进行表征。将MPC30-DEA70/AS-OD基因复合物转染至体外培养的HEK293细胞,检测其细胞相容性、转染效率和细胞内转运机制。结果与结论:MPC30-DEA70在pH=4.0-11.0范围内的0.01 mol/L PBS中显示出高度水溶性,其正电性随pH值降低而增强。MPC30-DEA70/AS-ODN基因复合物在DNA凝胶电泳中显示出不同程度的电泳迟滞,随电性增强而显著。MTT法检测显示MPC30-DEA70对HEK293细胞株的毒性呈剂量依赖性,高浓度下细胞毒性显著增强。流式细胞术检测发现复合物的转染随N/P比值增加而显著增强;共聚焦显微镜观察到AS-ODN分子在细胞核内的转运,提示其有效的核定位。证实新型阳离子磷酸胆碱聚合物可以有效负载和运输反义寡核苷酸,是一种高效安全的非病毒类转基因载体。

磷酸胆碱聚合物MPC_(30)-DEA_(70)负载转化生长因子β1AS-ODN转染心肌细胞

背景:目前反义寡核苷酸的基因治疗已经拥有良好的应用前景,但是反义寡核苷酸的相对分子质量小却不容易入细胞并且易被核酸酶降解,能否有效地穿过细胞膜且不被核酸酶降解从而与目的基因结合发挥作用,因此人们一直致力于理想载体的选择、基因转移效率的增加和转移特异性等研究。目的:探讨新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70能否有效地负载转化生长因子β1反义寡核苷酸(AS-ODN)进入心肌细胞,并观察其对该基因胞内生物表达的影响。方法:按不同N/P电荷比值将载体MPC30-DEA70与转化生长因子β1 AS-ODN络合成形成基因复合物并且对其总电性进行表征;采用MTT法检测MPC30-DEA70与心肌细胞的生物相容性;共聚焦激光扫描显微镜观察MPC30-DEA70/TGF-β1AS-ODN在细胞内的分布和定位;应用流式细胞仪检测MPC30-DEA70/TGF-β1AS-ODN(FAM标记)的细胞转染效率和荧光强度;Western blot、RT-PCR法检测转化生长因子β1细胞内表达水平。结果与结论:MPC30-DEA70与心肌细胞具有较好的细胞相容性,在较高质量浓度(>20 mg/L)下才表现出一定的细胞毒性并呈剂量依赖;MPC30-DEA70/TGF-β1AS-ODN复合物对心肌细胞具有较高的转染效率,并且能够携带转化生长因子β1 AS-ODN进入细胞后下调转化生长因子β1 m RNA和蛋白的表达。新型阳离子磷酸胆碱基聚合物MPC30-DEA70可以有效负载和运输转化生长因子。

磷酸胆碱聚合物载反义c—myc寡核苷酸对兔髂动脉球囊损伤后血管狭窄的影响

目的探讨局部转运磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70载反义c—myc寡核苷酸（c—mycAS—ODN）基因复合物对兔髂动脉球囊损伤后血管狭窄的影响。方法40只家兔随机分为对照组、多聚赖氨酸（PLL）组、裸c—mycAS—ODN组、PLL载基因复合物N／P=3：1组和N／P=5：1组，每组各8只。构建兔髂动脉球囊损伤模型，于血管损伤段行PLL、c—mycAS—ODN、PLL载N／P=3：1和N／P=5：1基因复合物的局部转运。24h后应用共聚焦显微镜观察基因复合物在髂动脉的分布情况；4周后苏木精-伊红染色光镜下观察髂动脉的组织形态学变化，包括新生内膜面积（NIA）、中膜面积（MA）和新生内膜／中膜面积比（I／M）；Western blot法检测各组损伤血管处c—myc蛋白的表达情况。结果共聚焦显微镜可见转染N／P=3：1、N／P=5：1基因复合物的血管内膜有均匀的绿色荧光分布。苏木精-伊红染色光镜下对照组、PLL组、裸c—mycAS—ODN组均可见显著的内膜增生，组间比较NIA、I／M无显著性差异（P〉0．05）；与对照组比较，N／P=3：1组和N／P=5：1组NIA、I／M均明显减少（P〈0．05），后两组间比较无显著性差异（P〉0．05）。Western blot显示对照组、PLL组、裸c—mycAS—ODN组c—myc蛋白表达均明显增高，组间比较无显著性差异（P〉0．05）；与对照组比较，N／P=3：1组和N／P=5：1组c—myc蛋白表达明显减少（P〈0．05），后两组间比较无显著性差异（P〉0．05）。结论多聚赖氨酸可促进MPC30-DEA70／c—myc AS—ODN复合物进入髂动脉血管，有效抑制球囊损伤后新生内膜的过度增生，为基因治疗血管内狭窄提供了新型的非病毒类转基因手段。

磷酸胆碱聚合物载TGF—β1反义寡核苷酸转染血管外膜成纤维细胞对TGF—β1的影响

目的观察新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70能否有效地转染针对转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的反义寡核苷酸（AS—ODN）进入到血管外膜成纤维细胞中及转染后对血管外膜成纤维细胞内TGF-β1表达的影响，为MPC30-DEA70，聚合物作为药物基因治疗载体在心血管疾病中的运用奠定基础。方法组织贴块法培养大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞；应用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察MPC30-DEA70／TGF-β1AS-ODN（FAM标记）在细胞内的分布和定位；流式细胞仪（FCM）检测二者的细胞转染效率、荧光强度；免疫印迹实验（Western blot）检测TGF-β1细胞内表达。结果①原代培养的细胞呈纺锤形，多角形或者不规则形，细胞核较大，数量1～2个不等，轮廓清楚，核仁大而明显，呈椭圆形；②激光共聚焦显微镜观察到FAM标记的基因复合物多数分布在细胞核周围；③流式结果显示转染效率及荧光强度随N／P比增加而明显增大；④Western blot结果显示随着N／P比值的增大，TGF-β1的蛋白表达明显下降（P〈0．05）。结论MPC30-DEA70，能够携带TGF-β1-AS—ODN进入离体培养的大鼠胸主动脉外膜成纤维细胞，并能下调TGF—β1蛋白的表达。

磷酸胆碱聚合物载AT1受体反义寡核苷酸对自发性高血压大鼠血压及心血管重构的影响

目的探讨磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70载AT1受体反义寡核苷酸(AS-ODN)对自发性高血压大鼠(SHR)血压及心血管重构的影响。方法将MPC30-DEA70(N)与FAM-AS-ODN(P)按不同N/P比值络合后经尾静脉注入SD大鼠体内,未经处理的SD大鼠为对照,3周后观察复合物在全身各组织器官的分布。再将MPC30-DEA70与AT1受体AS-ODN按不同N/P比值络合后经尾静脉注入8周龄SHR大鼠体内,未经处理的SHR大鼠为对照,3周后测量尾动脉压,对主动脉及心肌组织行天狼星红染色,并用Western blot法和RT-PCR法检测AT1受体蛋白及mRNA表达情况。结果 MPC30-DEA70/FAM-AS-ODN复合物能够进入肾脏组织;空白对照组和N/P=1∶0组的尾动脉压持续上升,缬沙坦组、N/P=10∶1组和N/P=1∶1组的尾动脉压较空白对照组明显下降;空白对照组和N/P=1∶0组心肌细胞肥大,主动脉壁增厚,胶原纤维大量沉积,而缬沙坦组、N/P=10∶1组和N/P=1∶1组上述情况较空白对照组明显改善;N/P=10∶1组和N/P=1∶1组AT1a蛋白和mRNA表达较空白对照组显著降低。结论 MPC30-DEA70能够安全有效地进入肾脏各组织,在体内运载AT1受体AS-ODN,下调AT1受体蛋白及其mRNA表达,抑制SHR大鼠血压进展及心血管重构,是一种创新性的非病毒类基因运输载体。

阳离子磷酸胆碱聚合物载AT1受体反义寡核苷酸转染大鼠心肌成纤维细胞的研究

目的:探讨新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70载AT1受体的反义寡核苷酸(AS-ODN)对离体培养的大鼠心肌成纤维细胞AT1受体及Ⅰ型胶原蛋白表达的影响。方法:MTT法检测MPC与心肌成纤维细胞的细胞相容性;应用激光扫描共聚焦显微镜(CLAM)检测复合物在细胞内的定位,流式细胞仪(FCM)检测转染效率及荧光强度,Western blot检测AT1受体蛋白、Ⅰ型胶原蛋白的表达。结果:MPC浓度>40μg/mL时才出现明显细胞毒性,激光共聚焦显微镜观察到FAM标记的基因复合物多数分布在细胞核周围,少量分布于细胞核内。流式结果显示转染效率及荧光强度随N/P比增加而明显增大。Western blot结果显示,转染复合物后各组细胞AT1受体及Ⅰ型胶原蛋白的表达也相应减少。结论:MPC30-DEA70在安全浓度范围内就能够携带AT1R-ASODN以较高的转染率进入离体培养的大鼠心肌成纤维细胞,并成功靶向抑制AT1R及Ⅰ型胶原蛋白的表达。从而可以推断阳离子磷酸胆碱聚合物可以有效负载反义寡核苷酸(AS-ODN),靶向性抑制基因的表达,为新型非病毒性基因载体的研究提供了一定的理论依据。

阳离子磷酸胆碱聚合物负载siRNA进行细胞转染的可行性

目的探讨新型阳离子磷酸胆碱聚合物(MPC30DEA70)负载短片断干扰RNA(siRNA)进行细胞转染的可行性以及生物学效应。方法 MTT法分析MPC30DEA70对HepG2.2.15细胞的毒性;设计特异性siRNA,以MPC30DEA70负载红色荧光标记的siRNA转染HepG2.2.15细胞,在荧光显微镜下观察该载体携带siRNA能否进入细胞中及在该细胞中的转染效率。在此基础之上,观察对荧光素酶基因表达的抑制效应。结果在MPC30DEA70的浓度为0.5、1、3、5μl时,未发现对HepG2.2.15细胞产生明显的毒性,细胞存活率均在80%以上,并且能够携带siRNA进入细胞内,在48h的转染效率达(52.33±1.97)%,转染后能够有效地抑制荧光素酶质粒在HepG2.2.15细胞内的表达。结论 MPC30DEA70携带的siRNA在HepG2.2.15细胞中有着较高的转染效率,并发挥一定的生物效应,有望成为有效的siRNA载体。

阳离子磷酸胆碱聚合物MPC_(30)-DEA_(70)载MiRNA-195反义寡核苷酸转染心肌细胞的研究

目的:探讨新型阳离子磷酸胆碱聚合物MPC30-DEA70(PC)载MiRNA-195反义寡核苷酸(AMOMiRNA-195)转染心肌细胞及其对心肌细胞肥厚的影响。方法:应用琼脂糖凝胶电泳表征具有不同比值的MPC30-DEA70与AMO-MiRNA-195的复合物,将不同比例的MPC30-DEA70/AMO-MiR-195基因复合物(PC复合物)转染至体外培养的乳鼠心肌细胞。应用倒置荧光显微镜(FMI)及激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察MPC30-DEA70/AMO-MiR-195(FAM标记)在细胞内的分布及定位;流式细胞仪(FCM)检测转染效率及荧光强度;RT-PCR检测心肌细胞MiRNA-195的表达;RT-PCR法检测心肌肥厚标志物心房钠尿肽(ANP)、α-肌球蛋白重链(α-MHC)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)编码基因Nppa、Myh6、Myh7基因的表达。结果:1不同比值的PC复合物在电泳中可见不同程度的电泳迟滞现象,随电性增强而显著;2FMI及CLSM观察到MPC30-DEA70/AMO-MiR-195(FAM标记)分布在细胞核周围,少量进入细胞核。3流式细胞术显示随N/P比值的增加,转染效率明显增大,荧光强度也随之增强;4RT-PCR法显示PC复合物可使MiRNA-195及心肌肥厚标志性基因Nppa、Myh7基因表达降低,且随着N/P比值的增大,MiRNA-195、Nppa及Myh7基因表达明显下降(P<0.05),Myh6基因表达无明显变化。结论:MPC30-DEA70可作为AMO-MiRNA-195的载体转染至体外培养的乳鼠心肌细胞,并下调MiRNA-195及心肌肥厚标志性基因Nppa、Myh7基因表达。

磷酸胆碱表面改性涤纶材料及抗凝血性研究

采用氧等离子体预处理涤纶材料(聚对苯二甲酸乙二醇酯,PET)表面,并通过紫外辐照在其表面接枝聚合丙烯酸,以接枝聚丙烯酸链中的羧基为反应位点,通过原子转移自由基聚合在PET表面进一步固定磷酸胆碱聚合物。经漫反射红外光谱及X射线光电子能谱分析测试表明,涤纶薄膜表面成功地固定了磷酸胆碱聚合物。经磷酸胆碱聚合物改性的涤纶表面亲水性得到改善,体外抗凝血性评价表明,固定磷酸胆碱的PET表面能够有效地抑制纤维蛋白原分子的变性,降低血小板粘附和激活。

MPC30-DEA70载AMO-miR-146a对大鼠颈总动脉球囊损伤后血管内膜增生的影响

目的阳离子磷酸胆碱聚合物(MPC30-DEA70)负载反义miR-146a寡核苷酸(AMO-miR-146a)转染大鼠颈总动脉球囊损伤处血管平滑肌细胞(VSMC),观察其对血管内膜增生的影响。方法 60只SD大鼠完全随机化分为未损伤组、单纯损伤组、多聚赖氨酸(PLL)组、AMO-miR-146a组、PLL载MPC30-DEA70/AMO-miR-146a复合物(P/M=3:1组和P/M=5:1组),每组10只。通过光学显微镜观察4周后大鼠颈总动脉组织形态学变化,q-PCR法检测miR-146a的表达以及应用Western blot法检测增殖细胞核抗原蛋白(PCNA)、NFκBp65的表达情况。结果苏木精-伊红染色,光镜下显示,除未损伤组外,单纯损伤组、PLL组、AMO-miR-146a组、P/M=3:1组、P/M=5:1组大鼠颈总动脉血管新生内膜有不同程度的增生,而中膜面积无明显改变;与单纯损伤组比较,PLL组、AMO-miR-146a组新生内膜面积差异无统计学意义(P>0.05),P/M=3:1组和P/M=5:1组新生内膜面积明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),后两组组间比较差异无统计学意义(P>0.05);q-PCR及Western blot检测显示P/M=3:1组和P/M=5:1组miR-146a及目的蛋白PCNA、NFκBp56的表达较未损伤组高,差异有统计学意义(P<0.05),但明显低于单纯损伤组、PLL组、AMO-miR-146a组,差异有统计学意义(P<0.05),而P/M=3:1组和P/M=5:1组组间miR-146a、PCNA、NFκBp56的表达差异无统计学意义(P>0.05);单纯损伤组、PLL组、AMO-miR-146a组组间miR-146a、PCNA、NFκBp56的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 MPC30-DEA70可与AMO-miR-146a络合,借助PLL进入VSMC,有效抑制球囊损伤后VSMC的miRNA-146a的表达,使PCNA、NFκBp56下调,抑制新生内膜增生,防止血管狭窄。

MPC30-DEA70载AMO-miR-222对大鼠颈总动脉球囊损伤后血管狭窄的影响

目的:阳离子磷酸胆碱聚合物(MPC30-DEA70)为非病毒类转基因载体,可与AMO-mi R-222络合,通过导管球囊系统将MPC30-DEA70/AMO-mi R-222基因复合物导入大鼠颈内动脉球囊损伤处,观察对血管平滑肌细胞增生及血管狭窄程度的影响。方法:90只雄性SD大鼠随机分为未损伤组、多聚赖氨酸(PLL组)、MPC30-DEA70/AMO-mi R-222组、PLL/AMO-mi R-222组、PLL/MPC30-DEA70组、AMO-mi R-222组、单纯损伤组、PLL载P/A=3:1组和P/A=5:1组,每组各10只。构建大鼠颈总动脉球囊损伤模型,予血管损伤段行PLL、MPC30-DEA70/AMO-mi R-222、PLL/AMO-mi R-222、PLL/MPC30-DEA70、AMO-mi R-222、PLL载P/A=3:1和P/A=5:1复合物的转运。4周后通过光学显微镜观察HE染色血管段组织形态学改变。Western blot法检测各组血管段p57Kip2、p27Kip1蛋白的表达情况。RT-PCR法检测各组血管段mi R222扩增情况。结果:光学显微镜下,多聚赖氨酸(PLL组)、裸MPC30-DEA70/AMO-mi R-222组、PLL/AMO-mi R-222组、PLL/MPC30-DEA70组、AMO-mi R-222组、MPC30-DEA70组可见内膜显著增生,新生内膜/中膜比值无组间差异,较PLL载P/A=3:1组和P/A=5:1组有组间差异,后两组比较无组间差异,未损伤组未见新生内膜增殖。Western blot法检测显示PLL载P/A=3:1组和P/A=5:1组P57kip2、P27kip1蛋白表达含量较未损伤组降低(P<0.05),较余六组增高(P<0.05),组间比较无显著差异(P>0.05)。RT-PCR法检测显示,mi R-222表达在未损伤组很低,PLL载P/A=3:1组和P/A=5:1组增高,余六组过表达(组间比较无显著差异)。结论:MPC30-DEA70可与AMO-mi R-222络合,有效抑制球囊损伤后血管mi R222表达,从而抑制新生内膜增生及血管狭窄。