重组酿酒酵母磷酸胆碱胞苷转移酶(CCT酶)基因的工程菌稳定性研究

为了进一步研究基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET-29a-cct在培养基中传代50次过程中菌种的稳定性,通过将菌体和菌落的形态、质粒的稳定性、质粒酶切图谱和重组CCT酶的表达量及活性作为指标进行考察,来评价该工程菌的稳定性。结果显示,重组CCT酶基因的工程菌在转接50次的过程中质粒稳定性高,其保有率为90%,表达产物可达发酵液总蛋白的15%以上。该菌在第50代后仍具有转化活性,说明工程菌转化活性稳定。

酿酒酵母磷酸胆碱胞苷转移酶基因(cct)的克隆表达及活性测定

以酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)基因组DNA为模板,克隆并表达了编码磷酸胆碱胞苷转移酶的基因cct。根据NCBI提供的序列信息,设计扩增cct基因的引物,经PCR扩增、酶切后,将cct插入到表达载体pET-29a(+)中,构建了重组质粒pET-29a-cct,经过酶切验证和测序后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在30℃条件下经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE结果显示构建的工程菌可高效表达相对分子质量约45 k的蛋白,与理论值相符。对粗酶液进行活性测定,表达产物可检测到CCT酶活性,即可转化CTP和磷酸胆碱为CDP-胆碱,此结果可为CDP-胆碱的生物合成提供依据。

17β-雌二醇对肺组织磷酸胆碱胞苷酰转移酶的影响

目的 :在离体肺组织培养模型上观察 1 7β 雌二醇 (1 7β estradiol,E2 )对肺表面活性物质主要成分磷脂酰胆碱合成的限速酶—CTP :磷酸胆碱胞苷酰转移酶 (CCT)活性的影响并探讨其作用机制。方法 :采用无血清成年大鼠肺组织培养 ,提取标记有1 4C的反应产物CDP 胆碱 ,液闪测定1 4C放射性强度 ,反映CCT活性。结果 :① 1× 1 0 - 7～ 3×1 0 - 6 mol/L的E2 以剂量依赖方式提高CCT活性 ;②用 3× 1 0 - 6 mol/L的E2 处理肺组织 2h、4h、8h和 1 6h ,在 8h时微粒体CCT活性显著高于对照组 (P <0 .0 1 ) ,1 6h酶活性进一步升高 ;③H 7和W 7可分别抑制 3× 1 0 - 6 mol/L的E2 促CCT活性的效应。结论 :E2 可促进成年大鼠CCT活性 ,其细胞内信号转导途径与蛋白激酶C和钙调蛋白有关。

内皮素-1对肺组织磷酸胆碱二胞苷酰转移酶的影响

目的 在离体肺组织培养模型上观察低浓度 (1×10 -13 ～ 1× 10 -9mol·L-1)内皮素 1(ET 1)对肺表面活性物质 (PS)脂质主要成分磷脂酰胆碱 (PC)合成的限速酶———CTP :磷酸胆碱二胞苷酰转移酶 (CCT)活性的影响。方法 采用无血清成年大鼠肺组织培养 ,以 [M 14 C]胆碱作为前体参入CDP 胆碱 ,液闪测定14 C放射性强度 ,反映CCT活性。结果 ①CDP [M 14 C]胆碱的产量随微粒体和胞浆蛋白量增加、反应时间延长 (0～ 30min)而增多 ;②ET 1(1× 10 -12～ 1× 10 -9mol·L-1)以剂量依赖性提高微粒体CCT活性 ;③ET 1(1× 10 -10 mol·L-1)作用 8h ,微粒体CCT活性开始增强 ,随作用时间延长 (8～ 16h) ,酶活性逐渐增强 ;④ET 1(1× 10 -10 mol·L-1)可提高细胞微粒体CCT活性 ,而降低胞质CCT活性 ;⑤H 7和W 7均可分别抑制ET 1(1× 10 -10mol·L-1)促微粒体CCT活性增强的效应。结论 ET 1可促进肺组织细胞胞质CCT向微粒体转位 ,增加微粒体CCT活性 。

血管活性肠肽对肺组织CTP:磷酸胆碱二胞苷酰转移酶活性的影响

目的 :观察血管活性肠肽 (VIP)对肺组织微粒体中CTP :磷酸胆碱二胞苷酰转移酶活性的影响并探讨其作用机制。方法 :采用无血清成年大鼠肺组织培养 ,提取标记有1 4C的反应产物CDP -胆碱 ,液闪测定1 4C放射性强度 ,反映CTP :磷酸胆碱二胞苷酰转移酶活性。观察VIP对该酶影响的量 效关系与时 效关系以及蛋白激酶C抑制剂H 7和钙调蛋白阻断剂W 7预处理后酶活性的变化。结果 :①浓度为 3× 10 - 8mol·L- 1 的VIP可引起微粒体CTP :磷酸胆碱二胞苷酰转移酶的活性增强 ,并随着VIP浓度增加 ,酶活性增加 (P <0 .0 1)。②用 3× 10 - 7mol·L- 1 VIP作用 8h ,酶的活性开始显著增强 (P <0 .0 1) ,随着作用时间延长 ,酶活性逐渐增加。③H 7和W 7可显著抑制 3× 10 - 7mol·L- 1 的VIP对CTP :磷酸胆碱二胞苷酰转移酶活性的增强作用。结论 :肺内神经肽VIP可促进成年大鼠肺组织微粒体中CTP :磷酸胆碱二胞苷酰转移酶活性 。

肺癌患者胆碱激酶(Chok)及胆碱磷酸胞苷转移酶(PCYT)基因的表达水平研究

目的探讨肺癌患者胆碱激酶及胆碱磷酸胞苷转移酶基因的表达水平。方法选取2014年2月至2016年2月就诊于我院接受11C-胆碱PET/CT显像的可疑肺癌患者共68例,术后选取病变组织作为观察组,同时选取每例患者病变组织周围≥5cm处的正常组织作为自身对照组,将两组的组织分别进行病理检查和RT-PCR检测,分析两组患者病变组织胆碱激酶及胆碱磷酸胞苷转移酶基因的表达水平。结果经RTPCR检测,50例放射性高摄取的肺癌组织中Chok(0.75±0.13)和PCYT(0.73±0.21)基因的表达水平均显著高于对照组(0.34±0.11)、(0.35±0.05),差异均有统计学意义(P<0.05)。9例放射性高摄取的肺癌组织和10例良性病变组织中Chok和PCYT基因的表达水平与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论大部分肺癌患者存在胆碱激酶及胆碱磷酸胞苷转移酶基因表达水平的升高。

磷酸胆碱胞苷酰转移酶α在口腔鳞状细胞癌中的表达及潜在临床意义

目的探讨磷酸胆碱胞苷酰转移酶α（cytidine triphosphate：phosphocholine cytidylyltransferase-α，CCT-α）在口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）中的表达及潜在临床意义。 方法以2016年5月至2016年7月在中南大学湘雅二医院口腔中心收集的58例OSCC组织标本为实验组，同一患者的癌旁组织为对照组。免疫组织化学法检测CCT-α在OSCC组织及癌旁组织中的表达情况，结合患者的临床病理资料分析CCT-α与OSCC患者肿瘤的临床病理特征的关系。采用实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测OSCC细胞株和正常口腔上皮细胞株中CCT-α mRNA及CCT-α蛋白的表达情况。 结果免疫组化染色结果示CCT-α阳性染色位于细胞核，CCT-α在OSCC组中的表达显著高于癌旁组（P=0.000）。临床病理资料分析示OSCC组织中CCT-α的表达水平与患者吸烟、饮酒史（P=0.001，P=0.004）及肿瘤大小（P=0.005）、分化程度（P=0.000）、是否发生淋巴结转移（P=0.000）密切相关。有吸烟、饮酒史的患者，CCT-α蛋白的表达水平明显升高。实时荧光定量PCR结果显示CCT-α mRNA在OSCC细胞株中的表达显著高于口腔上皮细胞株（P=0.016）。蛋白质印迹法结果显示CCT-α蛋白在OSCC细胞株中的表达显著高于口腔上皮细胞株，其蛋白表达趋势与CCT-α mRNA一致。 结论CCT-α可能在OSCC的发生发展中有重要作用。

利用重组胞苷转移酶酿酒酵母生物合成胞二磷胆碱的工艺研究

课题涉及一种过表达磷酸胆碱胞苷转移酶(Cholinephosphate cytidylyltransferase,EC 2.7.7.15,CCT)酿酒酵母基因工程菌的构建和应用。该菌株是将酿酒酵母来源的编码CCT酶基因cct与p YES2.0-Kanmx载体构建重组质粒,然后将其转化于酿酒酵母DFH中,构建基因工程菌QZ-016。通过过表达反应关键酶CCT酶而提高胞二磷胆碱(CDP-C)的转化率和产量。经过优化YPD培养基后,该菌株的菌浓PMV可达70.2 g/L,可应用于以CMP和CP为原料,生物转化制造CDP-C,反应7 h摩尔转化率可高达73.1%。该菌株的产率高,应用于生产CDP-C,具有成本低、制造能耗低、反应周期短等优点。

卵磷脂与细胞周期

卵磷脂作为哺乳动物细胞膜结构组成的重要成分,在细胞增殖过程中表现出周期性的变化.卵磷脂生物合成和分解代谢中关键酶的共同作用调节卵磷脂的变化规律,尤其是CTP:磷酸胆碱胞苷转移酶和非钙依赖的磷脂酶A2在其中起着非常重要的调节作用.在简述卵磷脂在细胞周期中的变化规律的基础上,详细阐述了卵磷脂周期性变化规律的调节机理,并就卵磷脂和细胞周期的关系及其重要生物学意义与相关疾病发生关系进行了探讨.

磷脂酰胆碱的合成和转运对极低密度脂蛋白分泌的调节作用

肝为脂蛋白的合成和分泌提供磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC),但同时又接受来自血浆脂蛋白中的PC。肝极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)的分泌需要PC的生物合成,最近的研究显示5'-胞苷二磷酸-胆碱途径(cytidine 5'-diphosphocholine,COD-胆碱)和磷脂酰乙醇胺甲基化途径参与了PC的生物合成。文中就PC的合成和转运对VLDL分泌功能的影响进行综述。

利用RT-PCR的方法检测恶性疟原虫海南株FCC1/HN CT基因在红细胞内期的表达及CTP基因真核表达载体的构建(英文)

目的 利用反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）的方法检测ＣＴＰ基因是否在恶性疟原虫红内期表达，并构建ＣＴＰ因的真核表达载体，以便进一步研究其功能。方法 按常规方法体外培养红内期恶性疟原虫，用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取红内期疟原虫总ＲＮＡ．通过ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ珠ＣＴＰ Ｍ码基因并构建ＣＴＰ基因的真核表达载体。结果 获得了恶性疟原虫ＣＴＰｃＤＮＡ的全编码区序列并将其克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３。结论（ＣＴＰ基因在恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株红细胞内期表达并成功地构建了ＣＴＰ基因的重组表达质粒。

低浓度内皮素-1对活性氧抑制肺表面活性物质脂质合成的保护

在离体肺组织培养模型上观察低浓度 (1～ 10 0pmol/L)内皮素 1(endothelin 1,ET 1)对活性氧所致肺表面活性物质 (pulmonarysurfactant,PS)脂质合成障碍及PS脂质主要组分磷脂酰胆碱合成限速酶CTP :磷酸胆碱二胞苷酰基转移酶 (phosphorylcholinecytidylyltransferase ,CCT)活性的影响。结果显示 :(1)黄嘌呤 黄嘌呤氧化酶超氧阴离子生成系统呈剂量依赖性地降低肺组织 3 H 胆碱的掺入量 ;(2 )ET 1可减轻活性氧所致 3 H 胆碱掺入量的减少和肺组织丙二醛含量的增高 ;但对肺组织超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及总抗氧化能力无明显影响 ;(3)ET 1可分别提高和降低肺组织细胞微粒体和胞浆的CCT活性 ,并可减轻活性氧所致肺微粒体CCT活性的降低。结果表明 ,低浓度ET 1具有保护肺微粒体的CCT活性、减轻氧化性肺损伤所致PS合成障碍的作用 。

肺癌^(11)C-胆碱PET显像机制与胆碱代谢的研究

目的探讨肺癌组织11C-胆碱PET的显像及代谢的基本机制。方法收集肺部结节或团块样病变患者84例,术前均行11C-胆碱PET显像,采用目测法及半定量法分析显像结果,计算标准摄取值(SUV)。将术后取得的病变组织及正常对照组织用RT-PCR法检测胆碱激酶(Chok)及胆碱磷酸胞苷转移酶(PCYT)基因的表达水平,并分析两种关键酶基因表达强度与SUV值的相关性。结果 56例11C-胆碱PET/CT阳性的肺癌组织中有78.57%和71.43%的病例分别存在Chok和PCYT基因的过表达(P均<0.01),两种酶都过表达者占64.29%;9例PET/CT阴性的肺癌组织中Chok、PCYT基因均表达正常;19例良性病变中Chok、PCYT基因分别存在10.53%和15.79%的病例过表达(P=0.07,P=0.08);56例PET/CT阳性的肺癌患者中,Chok、PCYT基因的相对表达强度与SUVmean均存在正相关性(r=0.51,r=0.50,P均<0.01)。结论肺癌的11C-胆碱显像与肿瘤细胞中磷脂酰胆碱水平的异常升高有关,而磷脂酰胆碱水平的升高是由Chok及PCYT基因的过度表达引起的。

吸入一氧化氮对内毒素性肺损伤大鼠肺磷脂合成的影响

目的 探讨吸入 2 0× 10 - 6 (V /V )浓度一氧化氮 (NO)气体对大鼠内毒素性肺炎症损伤时磷脂酰胆碱 (PC)合成代谢的影响。方法 成年大鼠先随机分为接受静脉注射内毒素 (LPS)和对照组(C) ,2 4h后再随机给予吸空气 (Air)、 95 %氧气 (O2 )、 2 0× 10 - 6 NO加空气 (NO)、 2 0× 10 - 6 NO加 95 %氧气 (O2 NO)干预。采用氚标记氯化胆碱掺入法 ,测大鼠合成PC能力。Weinhold法测肺组织磷酸胆碱二胞苷酰基转移酶 (CCT)的活性。结果 在干预后 4h ,NO组LPS大鼠肺组织 (LT)及支气管肺泡灌洗液(BALF)中总磷脂 (TPL)及饱和磷脂酰胆碱 (DSPC)放射活性小于其他各组 (P <0 0 1) ,CCT活性小于其他各组 (P <0 0 1)。在干预后 2 4h ,O2 组LPS大鼠LT及BALF中TPL及DSPC放射活性小于其他各组 (P <0 0 1) ,CCT活性、BALF中TPL含量、DSPC/TP均显著低于其他干预下的LPS大鼠 (P <0 0 1及P <0 0 5 )。结论 针对炎症损伤肺 ,吸入 2 0× 10 - 6 浓度的NO 2 4h不会对磷脂酰胆碱合成代谢产生持续影响 ,并能拮抗高氧对磷脂合成的抑制作用。