甲基赤藓糖醇磷酸胞苷酰转移酶及其抑制剂研究进展

甲基赤藓糖醇磷酸(methylerythritol phosphate,MEP)途径是生产萜类化合物前体异戊二烯基二磷酸(isopentenyl diphosphate,IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(dimethylallyl diphosphate,DMAPP)必要的生化途径之一,该途径广泛存在于植物、细菌及病原体体内,而哺乳动物中不存在。MEP途径包含的7个关键酶都可以作为新型农药和医药的作用靶标。甲基赤藓糖醇磷酸胞苷酰转移酶(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidyltransferase,IspD)是MEP途径的第三个关键酶,它的活性位点亲脂性低,但拥有独特的变构位点,近年来引起研究人员的广泛关注。利用IspD小分子抑制剂来阻断MEP通路,从而间接地抑制萜类化合物的生成,可以造成病菌和植物的死亡,达到杀菌或除草目的。本文对IspD结构、催化机理、IspD抑制剂及其作用机制等内容进行了综述,可为以IspD作为靶标的抑制剂的筛选以及新型农药和医药的开发提供指导。

重组酿酒酵母磷酸胆碱胞苷转移酶(CCT酶)基因的工程菌稳定性研究

为了进一步研究基因工程菌E.coli BL21(DE3)/p ET-29a-cct在培养基中传代50次过程中菌种的稳定性,通过将菌体和菌落的形态、质粒的稳定性、质粒酶切图谱和重组CCT酶的表达量及活性作为指标进行考察,来评价该工程菌的稳定性。结果显示,重组CCT酶基因的工程菌在转接50次的过程中质粒稳定性高,其保有率为90%,表达产物可达发酵液总蛋白的15%以上。该菌在第50代后仍具有转化活性,说明工程菌转化活性稳定。

17β-雌二醇对肺组织磷酸胆碱胞苷酰转移酶的影响

目的 :在离体肺组织培养模型上观察 1 7β 雌二醇 (1 7β estradiol,E2 )对肺表面活性物质主要成分磷脂酰胆碱合成的限速酶—CTP :磷酸胆碱胞苷酰转移酶 (CCT)活性的影响并探讨其作用机制。方法 :采用无血清成年大鼠肺组织培养 ,提取标记有1 4C的反应产物CDP 胆碱 ,液闪测定1 4C放射性强度 ,反映CCT活性。结果 :① 1× 1 0 - 7～ 3×1 0 - 6 mol/L的E2 以剂量依赖方式提高CCT活性 ;②用 3× 1 0 - 6 mol/L的E2 处理肺组织 2h、4h、8h和 1 6h ,在 8h时微粒体CCT活性显著高于对照组 (P <0 .0 1 ) ,1 6h酶活性进一步升高 ;③H 7和W 7可分别抑制 3× 1 0 - 6 mol/L的E2 促CCT活性的效应。结论 :E2 可促进成年大鼠CCT活性 ,其细胞内信号转导途径与蛋白激酶C和钙调蛋白有关。

内皮素-1对肺组织磷酸胆碱二胞苷酰转移酶的影响

目的 在离体肺组织培养模型上观察低浓度 (1×10 -13 ～ 1× 10 -9mol·L-1)内皮素 1(ET 1)对肺表面活性物质 (PS)脂质主要成分磷脂酰胆碱 (PC)合成的限速酶———CTP :磷酸胆碱二胞苷酰转移酶 (CCT)活性的影响。方法 采用无血清成年大鼠肺组织培养 ,以 [M 14 C]胆碱作为前体参入CDP 胆碱 ,液闪测定14 C放射性强度 ,反映CCT活性。结果 ①CDP [M 14 C]胆碱的产量随微粒体和胞浆蛋白量增加、反应时间延长 (0～ 30min)而增多 ;②ET 1(1× 10 -12～ 1× 10 -9mol·L-1)以剂量依赖性提高微粒体CCT活性 ;③ET 1(1× 10 -10 mol·L-1)作用 8h ,微粒体CCT活性开始增强 ,随作用时间延长 (8～ 16h) ,酶活性逐渐增强 ;④ET 1(1× 10 -10 mol·L-1)可提高细胞微粒体CCT活性 ,而降低胞质CCT活性 ;⑤H 7和W 7均可分别抑制ET 1(1× 10 -10mol·L-1)促微粒体CCT活性增强的效应。结论 ET 1可促进肺组织细胞胞质CCT向微粒体转位 ,增加微粒体CCT活性 。

血管活性肠肽对肺组织CTP:磷酸胆碱二胞苷酰转移酶活性的影响

目的 :观察血管活性肠肽 (VIP)对肺组织微粒体中CTP :磷酸胆碱二胞苷酰转移酶活性的影响并探讨其作用机制。方法 :采用无血清成年大鼠肺组织培养 ,提取标记有1 4C的反应产物CDP -胆碱 ,液闪测定1 4C放射性强度 ,反映CTP :磷酸胆碱二胞苷酰转移酶活性。观察VIP对该酶影响的量 效关系与时 效关系以及蛋白激酶C抑制剂H 7和钙调蛋白阻断剂W 7预处理后酶活性的变化。结果 :①浓度为 3× 10 - 8mol·L- 1 的VIP可引起微粒体CTP :磷酸胆碱二胞苷酰转移酶的活性增强 ,并随着VIP浓度增加 ,酶活性增加 (P <0 .0 1)。②用 3× 10 - 7mol·L- 1 VIP作用 8h ,酶的活性开始显著增强 (P <0 .0 1) ,随着作用时间延长 ,酶活性逐渐增加。③H 7和W 7可显著抑制 3× 10 - 7mol·L- 1 的VIP对CTP :磷酸胆碱二胞苷酰转移酶活性的增强作用。结论 :肺内神经肽VIP可促进成年大鼠肺组织微粒体中CTP :磷酸胆碱二胞苷酰转移酶活性 。

肺癌患者胆碱激酶(Chok)及胆碱磷酸胞苷转移酶(PCYT)基因的表达水平研究

目的探讨肺癌患者胆碱激酶及胆碱磷酸胞苷转移酶基因的表达水平。方法选取2014年2月至2016年2月就诊于我院接受11C-胆碱PET/CT显像的可疑肺癌患者共68例,术后选取病变组织作为观察组,同时选取每例患者病变组织周围≥5cm处的正常组织作为自身对照组,将两组的组织分别进行病理检查和RT-PCR检测,分析两组患者病变组织胆碱激酶及胆碱磷酸胞苷转移酶基因的表达水平。结果经RTPCR检测,50例放射性高摄取的肺癌组织中Chok(0.75±0.13)和PCYT(0.73±0.21)基因的表达水平均显著高于对照组(0.34±0.11)、(0.35±0.05),差异均有统计学意义(P<0.05)。9例放射性高摄取的肺癌组织和10例良性病变组织中Chok和PCYT基因的表达水平与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论大部分肺癌患者存在胆碱激酶及胆碱磷酸胞苷转移酶基因表达水平的升高。

植物磷酸乙醇胺甲基转移酶的生物信息学分析

运用生物信息学的方法,对已在Genbank数据库中注册的菠菜、甜菜、拟南芥、陆地棉和辽宁碱蓬等中磷酸胆碱合成的关键酶磷酸乙醇胺甲基转移酶(PEAMT)的氨基酸序列进行分析。结果显示:植物PEAMT属于稳定蛋白质,含有较丰富的赖氨酸和亮氨酸;不同植物PEAMT的氨基酸序列具有较高的同源性,含有与SAM结合的保守结合域及Tyr-His氨基酸对;植物PEAMT属于胞质酶,不与膜结合;分子进化研究表明PEAMT可作为植物遗传分化和分子进化研究的重要依据;氨基酸序列中不存在信号肽;分子中不存在跨膜结构域,可能受蛋白激酶C的磷酸化;无规则卷曲是多肽链中的主要结构元件;蛋白质保守区域包含两个AdoMet-MTase区域,属于典型的SAM依赖性甲基转移酶功能结构域。本研究还初步构建了菠菜PEAMT的三维模型,能够认识植物中PEAMT的特异性及催化分子机制,并为通过分子改造创造出具有更强抗逆效能的PEAMT提供理论参考。

酿酒酵母磷酸胆碱胞苷转移酶基因(cct)的克隆表达及活性测定

以酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)基因组DNA为模板,克隆并表达了编码磷酸胆碱胞苷转移酶的基因cct。根据NCBI提供的序列信息,设计扩增cct基因的引物,经PCR扩增、酶切后,将cct插入到表达载体pET-29a(+)中,构建了重组质粒pET-29a-cct,经过酶切验证和测序后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在30℃条件下经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE结果显示构建的工程菌可高效表达相对分子质量约45 k的蛋白,与理论值相符。对粗酶液进行活性测定,表达产物可检测到CCT酶活性,即可转化CTP和磷酸胆碱为CDP-胆碱,此结果可为CDP-胆碱的生物合成提供依据。

磷酸胆碱胞苷酰转移酶α在口腔鳞状细胞癌中的表达及潜在临床意义

目的探讨磷酸胆碱胞苷酰转移酶α（cytidine triphosphate：phosphocholine cytidylyltransferase-α，CCT-α）在口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）中的表达及潜在临床意义。 方法以2016年5月至2016年7月在中南大学湘雅二医院口腔中心收集的58例OSCC组织标本为实验组，同一患者的癌旁组织为对照组。免疫组织化学法检测CCT-α在OSCC组织及癌旁组织中的表达情况，结合患者的临床病理资料分析CCT-α与OSCC患者肿瘤的临床病理特征的关系。采用实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测OSCC细胞株和正常口腔上皮细胞株中CCT-α mRNA及CCT-α蛋白的表达情况。 结果免疫组化染色结果示CCT-α阳性染色位于细胞核，CCT-α在OSCC组中的表达显著高于癌旁组（P=0.000）。临床病理资料分析示OSCC组织中CCT-α的表达水平与患者吸烟、饮酒史（P=0.001，P=0.004）及肿瘤大小（P=0.005）、分化程度（P=0.000）、是否发生淋巴结转移（P=0.000）密切相关。有吸烟、饮酒史的患者，CCT-α蛋白的表达水平明显升高。实时荧光定量PCR结果显示CCT-α mRNA在OSCC细胞株中的表达显著高于口腔上皮细胞株（P=0.016）。蛋白质印迹法结果显示CCT-α蛋白在OSCC细胞株中的表达显著高于口腔上皮细胞株，其蛋白表达趋势与CCT-α mRNA一致。 结论CCT-α可能在OSCC的发生发展中有重要作用。

知母皂苷对AD模型大鼠学习记忆能力及磷酸化Tau蛋白和胆碱乙酰基转移酶表达的影响

目的:研究知母皂苷(SAa B)对Aβ1-42诱导的大鼠学习记忆障碍的改善作用及机制。方法:选用SD大鼠48只随机分为4组:正常对照组,Aβ1-42组,SAa B(1、2.5 mg/ml)+Aβ1-42组,每组12只,侧脑室注射给药后第2 d进行Morris水迷宫实验,第7d快速取海马CA1区,Western Blot法观察磷酸化tau(P-tau)、磷酸化GSK-3β、磷酸化Akt蛋白及胆碱乙酰基转移酶(Ch AT)蛋白表达水平。结果:脑室内注射Aβ1-42大鼠出现明显的空间学习记忆障碍,表现为逃避潜伏期和游泳路程较正常对照组明显延长,在原平台象限游泳时间占总时间的百分比明显降低,同时伴有海马P-tau表达明显增加,p-GSK-3β、p-Akt、Ch AT表达明显降低。侧脑室内注射SAa B后,与Aβ1-42组相比,SAa B(1、2.5 mg/ml)+Aβ1-42组大鼠逃避潜伏期和游泳路程明显缩短,原平台象限游泳时间占总游泳时间百分比升高;海马P-tau表达明显降低,p-GSK-3β、p-Akt、Ch AT表达明显增加。结论:侧脑室内注射知母皂苷可通过降低Ptau表达水平,提高Ch AT活性,从而减少神经元纤维缠结的形成,并可能通过调节胆碱能功能的途径发挥抗痴呆的作用。

胡黄连2-C-甲基-D-赤藓糖-4-磷酸胞苷转移酶基因的生物信息学分析

目的研究胡黄连Picrorhiza kurrooa 2-C-甲基-D-赤藓糖-4-磷酸胞苷转移酶(MCT)基因特征并预测MCT结构与功能位点。方法以胡黄连MCT基因为研究对象,利用NCBI网站及生物信息学软件对其碱基分布、氨基酸组成、亲疏水性、保守区及二级结构和三级结构进行预测和分析;并对9个物种的MCT基因进行多重比对与进化分析。结果胡黄连MCT基因的mRNA序列长为1 216 bp(GenBank JQ991625.1),编码由399个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白质相对分子质量为44 448.5,其中量最高的为Ser(10.0%);整个多肽中疏水性氨基酸占59.5%,平均疏水值为0.050;与丹参Salvia miltiorrhiza MCT氨基酸序列对比同源性最高,达99%。结论胡黄连MCT基因处于稳定状态,编码的蛋白为疏水性蛋白,在进化过程中是相对保守的,获得的保守区段序列信息为其他物种MCT基因的克隆奠定了基础。

胞磷胆碱联合奥拉西坦治疗高血压脑出血临床效果及对炎性因子、氧化应激、NIHSS评分的影响

目的探讨胞磷胆碱联合奥拉西坦治疗高血压脑出血的临床效果及对炎性因子、氧化应激、美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)评分的影响。方法回顾性分析2019年2月—2020年2月收治的高血压脑出血87例的临床资料,根据治疗方案分为研究组44例和对照组43例,研究组给予胞磷胆碱联合奥拉西坦治疗,对照组给予奥拉西坦治疗。比较2组临床疗效、炎性因子及氧化应激指标水平,观察神经功能改善及不良反应发生情况。结果研究组总有效率高于对照组(P<0.05)。2组治疗后C反应蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、脂质过氧化物、髓过氧化物酶及丙二醛水平低于治疗前,且研究组低于对照组(P<0.05,P<0.01)。2组治疗后超氧化物歧化酶水平高于治疗前,且研究组高于对照组(P<0.05,P<0.01)。2组治疗后NIHSS评分低于治疗前,且研究组低于对照组(P<0.01)。2组不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论胞磷胆碱联合奥拉西坦治疗高血压脑出血效果确切,可有效调节患者氧化应激水平,减轻机体炎症反应和神经功能损伤,且安全性高。

利用重组胞苷转移酶酿酒酵母生物合成胞二磷胆碱的工艺研究

课题涉及一种过表达磷酸胆碱胞苷转移酶(Cholinephosphate cytidylyltransferase,EC 2.7.7.15,CCT)酿酒酵母基因工程菌的构建和应用。该菌株是将酿酒酵母来源的编码CCT酶基因cct与p YES2.0-Kanmx载体构建重组质粒,然后将其转化于酿酒酵母DFH中,构建基因工程菌QZ-016。通过过表达反应关键酶CCT酶而提高胞二磷胆碱(CDP-C)的转化率和产量。经过优化YPD培养基后,该菌株的菌浓PMV可达70.2 g/L,可应用于以CMP和CP为原料,生物转化制造CDP-C,反应7 h摩尔转化率可高达73.1%。该菌株的产率高,应用于生产CDP-C,具有成本低、制造能耗低、反应周期短等优点。

磷脂酰胆碱的合成和转运对极低密度脂蛋白分泌的调节作用

肝为脂蛋白的合成和分泌提供磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC),但同时又接受来自血浆脂蛋白中的PC。肝极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)的分泌需要PC的生物合成,最近的研究显示5'-胞苷二磷酸-胆碱途径(cytidine 5'-diphosphocholine,COD-胆碱)和磷脂酰乙醇胺甲基化途径参与了PC的生物合成。文中就PC的合成和转运对VLDL分泌功能的影响进行综述。

卵磷脂与细胞周期

卵磷脂作为哺乳动物细胞膜结构组成的重要成分,在细胞增殖过程中表现出周期性的变化.卵磷脂生物合成和分解代谢中关键酶的共同作用调节卵磷脂的变化规律,尤其是CTP:磷酸胆碱胞苷转移酶和非钙依赖的磷脂酶A2在其中起着非常重要的调节作用.在简述卵磷脂在细胞周期中的变化规律的基础上,详细阐述了卵磷脂周期性变化规律的调节机理,并就卵磷脂和细胞周期的关系及其重要生物学意义与相关疾病发生关系进行了探讨.

利用RT-PCR的方法检测恶性疟原虫海南株FCC1/HN CT基因在红细胞内期的表达及CTP基因真核表达载体的构建(英文)

目的 利用反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）的方法检测ＣＴＰ基因是否在恶性疟原虫红内期表达，并构建ＣＴＰ因的真核表达载体，以便进一步研究其功能。方法 按常规方法体外培养红内期恶性疟原虫，用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取红内期疟原虫总ＲＮＡ．通过ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ珠ＣＴＰ Ｍ码基因并构建ＣＴＰ基因的真核表达载体。结果 获得了恶性疟原虫ＣＴＰｃＤＮＡ的全编码区序列并将其克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３。结论（ＣＴＰ基因在恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株红细胞内期表达并成功地构建了ＣＴＰ基因的重组表达质粒。

大黄鱼CCTα基因的克隆及其表达量随稚鱼生长发育的变化

研究旨在克隆大黄鱼磷脂酰胆碱合成关键基因磷脂酰胆碱胞苷转移酶α(CCTα)基因全长,并检测其表达量随稚鱼生长发育的变化。利用同源克隆技术和RACE技术从大黄鱼肝脏中成功扩增出CCTα的全长。同时应用real-time PCR法检测不同日龄大黄鱼稚鱼CCTα的表达变化。序列分析表明,CCTα全长2419 bp(Gen Bank登录号:KF006239.1),包括273 bp的5'端非编码区,1107 bp的开放阅读框,1010 bp的3'端非编码区,共编码369个氨基酸。系统进化树分析表明,相比其他物种,大黄鱼CCTα基因与红鳍东方鲀的亲缘关系较近。定量结果表明,孵化后,大黄鱼仔稚鱼CCTα的表达量随日龄的变化先显著升高,在15日龄时达到最大值,随后显著下降并趋于平稳,CCTα基因表达量的变化趋势与大黄鱼稚鱼消化系统的发育密切相关。

低浓度内皮素-1对活性氧抑制肺表面活性物质脂质合成的保护

在离体肺组织培养模型上观察低浓度 (1～ 10 0pmol/L)内皮素 1(endothelin 1,ET 1)对活性氧所致肺表面活性物质 (pulmonarysurfactant,PS)脂质合成障碍及PS脂质主要组分磷脂酰胆碱合成限速酶CTP :磷酸胆碱二胞苷酰基转移酶 (phosphorylcholinecytidylyltransferase ,CCT)活性的影响。结果显示 :(1)黄嘌呤 黄嘌呤氧化酶超氧阴离子生成系统呈剂量依赖性地降低肺组织 3 H 胆碱的掺入量 ;(2 )ET 1可减轻活性氧所致 3 H 胆碱掺入量的减少和肺组织丙二醛含量的增高 ;但对肺组织超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及总抗氧化能力无明显影响 ;(3)ET 1可分别提高和降低肺组织细胞微粒体和胞浆的CCT活性 ,并可减轻活性氧所致肺微粒体CCT活性的降低。结果表明 ,低浓度ET 1具有保护肺微粒体的CCT活性、减轻氧化性肺损伤所致PS合成障碍的作用 。

滇龙胆GrCMS基因的克隆与表达分析

2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶是赤藓糖磷酸酯(MEP)途径中的第三个催化酶。以滇龙胆转录组为基础,采用RT-PCR技术从滇龙胆幼叶克隆2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶基因GrCMS,并进行原核表达和组织特异性表达分析。序列分析显示,GrCMS基因(登录号KJ917164)开放阅读框(ORF)长933 bp,编码310氨基酸,推测分子量为34.23 kD,等电点为7.68。蛋白质序列分析显示,GrCMS无信号肽,为亲水稳定蛋白,主要由α-螺旋和无规则卷曲构成,可能定位叶绿体;具有CMS保守结构域。进化分析结果表明,GrCMS蛋白与长春花CrCMS蛋白亲缘关系最近。原核表达结果表明,GrCMS与预期蛋白大小一致。定量PCR结果表明,GrCMS基因主要在叶中表达。结果为进一步研究该基因功能和龙胆苦苷生物合成途径奠定基础。

肺癌^(11)C-胆碱PET显像机制与胆碱代谢的研究

目的探讨肺癌组织11C-胆碱PET的显像及代谢的基本机制。方法收集肺部结节或团块样病变患者84例,术前均行11C-胆碱PET显像,采用目测法及半定量法分析显像结果,计算标准摄取值(SUV)。将术后取得的病变组织及正常对照组织用RT-PCR法检测胆碱激酶(Chok)及胆碱磷酸胞苷转移酶(PCYT)基因的表达水平,并分析两种关键酶基因表达强度与SUV值的相关性。结果 56例11C-胆碱PET/CT阳性的肺癌组织中有78.57%和71.43%的病例分别存在Chok和PCYT基因的过表达(P均<0.01),两种酶都过表达者占64.29%;9例PET/CT阴性的肺癌组织中Chok、PCYT基因均表达正常;19例良性病变中Chok、PCYT基因分别存在10.53%和15.79%的病例过表达(P=0.07,P=0.08);56例PET/CT阳性的肺癌患者中,Chok、PCYT基因的相对表达强度与SUVmean均存在正相关性(r=0.51,r=0.50,P均<0.01)。结论肺癌的11C-胆碱显像与肿瘤细胞中磷脂酰胆碱水平的异常升高有关,而磷脂酰胆碱水平的升高是由Chok及PCYT基因的过度表达引起的。