磷酸腺苷活性激酶/环氧化酶-2在槲皮素抑制K562白血病细胞增殖中的作用

目的观察对槲皮素人慢性粒细胞白血病细胞株K562增殖的影响。方法不同浓度槲皮素孵育K562细胞48小时后用CCK-8法检测细胞存活率;Western-blot法检测槲皮素孵育K562 p-AMPK(磷酸腺苷活性激酶)和Cox-2(环氧化酶-2)蛋白表达水平。结果槲皮素抑制K562细胞的增殖,呈时间和浓度依赖性。槲皮素孵育48h后K562细胞的IC50值是83.11μm;随着槲皮素浓度的增加,K562细胞Cox-2蛋白水平表达下降,而p-AMPK蛋白表达水平上升。结论槲皮素呈浓度依赖性抑制HL-60细胞的增殖,可能通过激活AMPK抑制Cox-2进而抑制K562细胞增殖。

一磷酸腺苷活化蛋白激酶对环氧合酶-2表达与5氟-尿嘧啶治疗结肠癌敏感性的关系

目的探讨一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)对环氧合酶-2(COX-2)蛋白表达及结肠癌5-氟尿嘧啶(5-Fu)化疗敏感性的影响。方法选用HT-29结肠癌细胞株,按照HT-29细胞的培养液不同,分为空白对照组(常规培养)、5-Fu培养组、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(AICAR)培养组、5-Fu+AICAR培养组。用western blot法测定各组中P-ACC和COX-2的表达,并分别于培养6、12、24小时分析5-Fu培养组和5-Fu+AICAR培养组中P-ACC和COX-2的表达水平的变化;用MTT法检测12、24、48小时各组细胞的存活率。结果5-Fu组作用后COX-2蛋白上调,AICAR致P-ACC表达后,可下调COX-2蛋白的表达;5-Fu联合AICAR可降低细胞存活率。结论AMPK的激活可能下调COX-2表达,并可能提高以5-Fu治疗为基础的结肠癌化疗敏感性。

前列腺素E2通过环磷酸腺苷-蛋白激酶A信号通路上调人THP-1巨噬细胞血管内皮生成因子表达并促进体外血管生成

目的探讨前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)是否上调人THP-1巨噬细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达及其促进体外血管生成的分子机制。方法用不同浓度PGE2、2种PGE2受体(EP2和EP4)拮抗剂或环磷酸腺苷-蛋白激酶A(c AMP-PKA)通路特异性抑制剂SQ22536、H89处理人THP-1巨噬细胞,Western blotting检测人THP-1巨噬细胞内VEGF蛋白表达的变化,Transwell小室和Matrigel胶实验分析PGE2对人THP-1巨噬细胞促进人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)迁移和成管的影响。结果 PGE2通过EP2受体激活c AMP-PKA通路,上调人THP-1巨噬细胞VEGF蛋白表达,以及促进HUVECs的迁移和成管效应。结论 PGE2可能通过上调人THP-1源巨噬细胞VEGF的表达,并且促进血管生成,对胚胎着床起保护作用。

芍药甘草汤干预COX2-PGE_2-cAMP通路的止痛分子机理研究

目的:探讨芍药甘草汤的镇痛作用机理。方法:通过实验观察芍药甘草汤对甲醛致痛模型大鼠脊髓后角环氧化酶-2(COX2)、前列腺素E2(PGE)2和环磷酸腺苷(cAMP)水平的影响。结果:较大剂量芍药甘草汤对甲醛致痛模型大鼠的脊髓后角COX2有抑制作用,能降低血清中PGE2和cAMP浓度。结论:COX2-PGE2-cAMP信号通路参与了芍药甘草汤的镇痛作用。

消定膏对骨折愈合过程中COX-2/PGE_2/cAMP信号通路表达的影响

目的研究消定膏(无名异、儿茶、大黄等)对兔环氧化酶-2(COX-2)、前列腺素E2(PGE2)、环磷酸腺苷(c AMP)不同时相表达的影响,探讨其对骨折愈合的作用机制。方法将128只新西兰大耳白兔随机分为空白组、模型组、青鹏膏组(棘豆、亚大黄、诃子等)和消定膏组,除空白组外,其余各组均采用骨缺损法造成尺骨3 mm骨缺损模型,造模成功后,空白组、模型组仅做外固定。用药后第3、7、14、28天各组随机抽取8只,取骨痂组织,光镜下观察病理形态学变化,实时荧光定量-聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测骨痂组织COX-2 mRNA表达水平,免疫组化法检测骨痂组织PGE2、c AMP蛋白的表达。结果与模型组、青鹏膏组比较,消定膏组骨痂和胶原纤维的形成明显优于其他组,消定膏组COX-2 mRNA表达及PGE2、c AMP蛋白表达在术后7、14 d明显增强(P<0.05),且在术后14 d左右出现峰值。结论消定膏具有明显的促进骨折愈合作用,可能与其对COX-2/PGE2/c AMP信号通路的影响有关。

熊果酸抑制胃癌细胞COX-2表达的信号转导研究

目的进一步明确熊果酸(ursolic acid,UA)抑制胃癌细胞环氧化酶-2(cycloxygenase-2,COX-2)表达的信号转导通路。方法人胃腺癌细胞株SGC-7901和MKN-45常规培养于RPMI-1640培养液中,细胞长至亚单层后分别加抗氧化剂N-乙酰-L半胱氨酸(NAC)、单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)激活剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(AICAR)、AMPK抑制剂compound C和信号转导与转录活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)抑制剂WP1066预处理后再加UA连续培养24 h,Western blot检测AMPK、STAT3磷酸化水平和COX-2蛋白表达。结果抗氧化剂NAC和AMPK抑制剂compound C有效地阻断了UA抑制STAT3磷酸化和COX-2表达的作用,AMPK激活剂AICAR抑制STAT3磷酸化和COX-2表达,AICAR和UA联合作用大于单用,STAT3抑制剂WP1066对UA诱导的AMPK磷酸化无明显影响,WP1066单独或联合UA均可抑制STAT3磷酸化和COX-2表达且联合作用大于单用。结论 UA通过ROS/AMPK/STAT3信号转导通路抑制胃癌细胞COX-2表达。

银杏双黄酮介导AMPK/COX-2通路对黑色素瘤细胞凋亡的影响

目的:基于单磷酸腺苷活化蛋白激酶/环氧合酶-2(AMPK/COX-2)通路探究银杏双黄酮(GBB)对黑色素瘤细胞发生凋亡的影响。方法:体外培养人黑色素瘤细胞株A875,用不同浓度(50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)GBB、10μmol/LAMPK抑制剂Compound C、200μmol/L GBB+10μmol/L Compound C作用于A875细胞24 h。采用倒置显微镜观察细胞形态,Annexin V-FITC/PI双染色法检测GBB对A875细胞凋亡的影响,Western blotting法检测磷酸化乙酰辅酶A羧化酶(p-ACC)、磷酸化AMPK(p-AMPK)及COX-2蛋白表达。结果:随着GBB浓度的增加,细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞形态回缩变小、变圆、变亮,细胞间接触消失,部分细胞脱落裂解为碎片状,悬浮细胞增多,折光性减弱,呈现典型的细胞凋亡形态。GBB可提高p-ACC、p-AMPK蛋白表达,降低COX-2蛋白表达(均P<0.05);Compound C逆转了GBB对p-ACC、p-AMPK蛋白表达的促进作用及对COX-2蛋白表达的抑制作用(均P<0.05)。结论:GBB可诱导人黑色素瘤A875细胞凋亡,且呈剂量依赖性,此过程可能是通过介导AMPK/COX-2通路实现的。

Nrf2/HO-1、cAMP/PKA在TGR5减轻高糖、高脂诱导H9C2心肌细胞损伤中的作用机制

目的探讨核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶-1(HO-1)、环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)在G蛋白偶联胆汁酸受体1(TGR5)减轻高糖、高脂诱导H9C2心肌细胞损伤中的作用机制。方法将大鼠H9C2心肌细胞进行传代培养后分为对照组、高糖+高脂组、高糖+高脂+齐墩果酸组、干扰组(高糖+高脂+齐墩果酸+TGR5 shRNA)、Nrf2/HO-1组[高糖+高脂+齐墩果酸+Nrf2 siRNA病毒与HO-1抑制剂锌原卟啉(ZnPP)预处理]、cAMP/PKA组[高糖+高脂+齐墩果酸+SQ22536(cAMP抑制剂)预处理],荧光显微镜观察心肌细胞4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色结果,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定各组心肌细胞活性,采用活性氧荧光探针检测心肌细胞内活性氧(ROS)水平,应用图像分析法、BCA法分别测定各组心肌细胞表面积、蛋白含量,采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测各组Nrf2、HO-1、PKA水平,以比色法测定肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)水平,高效液相色谱法(HPLC)测定cAMP水平。结果荧光显微镜显示,高糖+高脂组心肌细胞染色强度较对照组增加,而高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组大部分心肌细胞恢复正常,仅少许细胞被染成强蓝色,干扰组染色强度较高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组增加。与对照组比较,高糖+高脂组心肌细胞活性率下降,ROS水平及心肌细胞表面积、心肌细胞蛋白含量增加,而高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组心肌细胞活性率高于高糖+高脂组,ROS水平及心肌细胞表面积、心肌细胞蛋白含量低于高糖+高脂组,差异均有统计学意义(P<0.01);与高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组比较,干扰组心肌细胞活性率下降,ROS水平及心肌细胞表面积、心肌细胞蛋白含量增加,差异均有统计学意义(P<0.01);高糖+高脂组Nrf2、HO-1、PKA、LDH、cAMP水平高于对照组,高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组Nrf2、HO-1、PKA、LDH、cAMP水平均低于高糖+高脂组,干扰组Nrf2、HO-1、PKA、LDH、cAMP水平均高于高糖+高脂+齐墩果酸组、Nrf2/HO-1组、cAMP/PKA组,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论激活TGR5受体可能对高糖、高脂诱导H9C2心肌细胞损伤有保护作用,其信号转导机制可能与抑制Nrf2/HO-1、cAMP/PKA信号通路有关。

沉默信息调节因子2相关酶3调控机制及其在奶牛乳腺炎中的作用

沉默信息调节因子2相关酶3(SIRT3)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性去乙酰化酶Sirtuin的家族成员,SIRT3主要调控细胞代谢、生物合成、细胞凋亡及氧化应激等方面。本文主要综述了SIRT3与核因子-κB(NF-κB)、单磷酸腺苷依赖的蛋白激酶(AMPK)、非酯化脂肪酸(NEFA)和活性氧(ROS)通路的调控机制以及SIRT3在奶牛乳腺炎中的作用,以期为奶牛乳腺炎的靶向治疗提供理论支撑。

消积通便方对便秘小鼠VIP-cAMP-PKA信号通路的影响

目的探讨消积通便方治疗便秘的作用机制。方法将64只SPF级雄性ICR小鼠随机分为空白组、模型组、消积通便方低剂量组、消积通便方中剂量组、消积通便方高剂量组、莫沙必利组。空白组给予生理盐水灌胃,其余各组给予洛哌丁胺10 mg/kg灌胃,均每日2次,共14 d。消积通便方低、中、高剂量组以及莫沙必利组小鼠均于第8天开始灌胃相应药物,正常组和模型组灌胃等量的生理盐水,均连续7 d。观察各组小鼠一般情况,记录实验第15天胃排空率及肠道推进率,采用ELISA法测定血清中血管活性肠肽(VIP)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)水平,HE染色观察结肠组织黏膜情况,实时荧光定量PCR法检测结肠组织中环磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶A(PKA)mRNA表达情况。结果空白组小鼠一般状态良好,体重逐步增加;模型组小鼠有不同程度易激惹或倦怠,精神不振,反应迟钝,进食量及饮水量减少;消积通便方各组及莫沙必利组小鼠精神状态及活动改善,进食、饮水量渐增。与空白组比较,模型组小鼠胃排空率及血清VIP、iNOS水平均明显增高(P均<0.05),肠道推进率及结肠组织中PKA mRNA、cAMP mRNA表达量均明显降低(P均<0.05);HE染色显示结肠黏膜固有层及黏膜下层可见炎性细胞浸润,肌层明显变薄。与模型组比较,消积通便方中、高剂量组及莫沙必利组小鼠胃排空率及血清VIP、iNOS水平均明显降低(P均<0.05),消积通便方高剂量组和莫沙必利组小鼠肠道推进率及结肠组织中PKA mRNA、cAMP mRNA表达量均明显升高(P均<0.05);HE染色显示消积通便方中、高剂量组及莫沙必利组小鼠结肠组织损伤明显减轻。结论消积通便方可能通过下调VIP、iNOS水平,激活cAMP-PKA通路,从而调节肠道平滑肌的活动,促进肠蠕动,缓解便秘症状。

基于VIP-cAMP-PKA-AQP3信号通路探讨益气润肠方治疗气虚型便秘大鼠的作用机制

目的:基于VIP-cAMP-PKA-AQP3信号通路探讨益气润肠方对气虚便秘模型大鼠作用及其机制。方法:选取48只SD大鼠随机分为空白组、模型组、乳果糖组、益气润肠方低剂量组、益气润肠方中剂量组和益气润肠方高剂量组,每组8只。空白组大鼠正常饮食,每日给予生理盐水灌胃,其余大鼠给予洛哌丁胺混悬液3 mg/(kg·d)灌胃加饥饱饮食2周制作气虚便秘模型。造模成功后,空白组及模型组每日给予生理盐水灌胃,乳果糖组给予乳果糖口服溶液1.67 g/(kg·d)灌胃,益气润肠方高、中、低剂量组分别给予益气润肠方17.5、8.75、4.375 g/(kg·d)灌胃,连续2周。14 d后称量大鼠粪便湿重、粪便干重并计算粪便含水率;留取结肠组织,采用苏木精伊红染色法观察结肠病理变化,qPCR检测大鼠结肠血管活性肠肽(VIP)、环磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶A(PKA)、水通道蛋白3(AQP3)mRNA表达水平,Western blot检测大鼠VIP、AQP3蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组大鼠体质量明显降低(P<0.01),粪便湿重及粒数明显减少(P<0.01);与模型组比较,益气润肠方低、中、高剂量组和乳果糖组体质量明显增高(P<0.01,P<0.05),粪便湿重增加、粪便粒数增多(P<0.05,P<0.01),但粪便含水率无统计学意义(P>0.05)。与乳果糖组比较,益气润肠方中、高剂量组粪便湿重明显增加、粪便粒数显著增多(P<0.05)。与空白组比较,模型组VIP、cAMP、PKA、AQP3 mRNA表达水平明显降低(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,乳果糖组及益气润肠方各剂量组VIP、cAMP、PKA、AQP3 mRNA表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),益气润肠方高剂量组效果最显著(P<0.01),且优于乳果糖组(P<0.05)。与模型组比较,益气润肠方各剂量组VIP、AQP3的蛋白表达水平升高,且呈剂量依赖性(P<0.05)。益气润肠方可以明显改善咯派丁胺造成的便秘大鼠的肠道病理形态损害。结论:益气润肠方可通过调控VIP-cAMP-PKA-AQP3通路治疗大鼠气虚型便秘。

PARP调节癫痫大鼠海马核转录因子κB及相关炎症因子的表达

目的:探讨癫痫大鼠海马组织核转录因子κB(NF-κB)随时间的变化规律及聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-AB)对NF-κB及白细胞介素1β(IL-1β)、环氧化酶-2(COX-2)的调节作用。方法:应用Western blotting检测海藻氨酸致痫大鼠海马核蛋白中NF-κBp65在不同时点及3-AB干预癫痫大鼠后的表达;应用RT-PCR及Western blotting检测IL-1β、COX-2 mRNA和蛋白水平在3-AB干预前后的变化。结果:大鼠海马核蛋白内NF-κBp65在癫痫后2h开始增高(P<0.05),持续12h(P<0.05),24h后恢复至对照组水平;应用3-AB后,NF-κBp65在核蛋白中含量明显下降(P<0.05);癫痫发作6h海马组织内IL-1β、COX-2 mRNA和蛋白水平表达增高(P<0.05),3-AB干预显著降低IL-1β、COX-2 mRNA及蛋白的表达(P<0.05)。结论:癫痫发作可诱发海马组织NF-κB的核转位及IL-1β、COX-2的表达,3-AB能明显抑制癫痫诱发的NF-κB核转位及IL-1β、COX-2的表达。

基于“肝肾相关”理论从Ca2+-CaM/CaMKⅡ-CREB信号转导途径探析黑逍遥散防治阿尔茨海默病的可行性

阿尔茨海默病(AD)是一种起病隐匿的增龄性神经退化性疾病,随着社会老龄化发展趋势而迅猛增加,严重威胁着人民群众健康,如果缺乏有效防治措施,将给社会经济和医疗保障体系造成巨大冲击。研究发现细胞信号转导异常是许多疾病发生的关键环节,细胞信号转导理论被广泛应用于阐明中医脏象实质和中医药作用机制的研究。"肝肾相关"是"五脏相关"理论的核心板块之一,适用于复杂疾病发病机制的阐释,解释多证候的相关性,及指导临证处方用药。黑逍遥散作为本研究组基于肝肾相关理论防治AD的首选复方,可通过疏肝养血、健脾益肾,通脑络利神窍而发挥防治AD作用。本文基于"肝肾相关"理论,从中医学角度阐述了AD的发病机制,通过查阅文献并结合前期研究,提出了从Ca2+-钙/钙调蛋白依赖性蛋白(CaM)/钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)-环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)细胞信号转导途径防治AD的方法与思路。

创伤性脑损伤对大鼠海马神经元骨架蛋白及学习记忆功能的影响

创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是极为常见的外伤性疾病,致死率和致残率很高。存活者伴随的空间认知功能障碍,给患者家庭和社会造成了极大的负担。目前,对TBI造成的空间记忆障碍缺乏系统研究。脑损伤后海马组织与记忆有关的分子以及组成神经元骨架的分子如何变化研究甚少。本研究采用Wistar大鼠为研究对象,并随机将其分为假手术(sham)组和创伤性脑损伤(TBI)组。TBI组再按致伤后时间长短分为6 h、12 h、24 h、72 h、15 d五个亚组。TBI组应用PinPointTM颅脑撞击器撞击而致伤,sham组不撞击。采用Morris水迷宫评价实验动物空间记忆能力;干湿重法测定脑含水量,评估脑水肿与海马水通道蛋白4(aquaporin-4,AQP-4)的相关性;海马神经元特异性核蛋白(neuron specific nuclear protein,NeuN)标记和免疫荧光检测评估TBI致大鼠神经元丢失情况;通过Western印迹检测TBI致海马骨架相关蛋白质和记忆相关蛋白质含量变化。本研究证实,与sham组相比,TBI组大鼠潜伏期明显增加[(61.98±12.82)s vs.(28.32±8.52)s,n=5,P<0.01,day 15],探索时间明显缩短[(36.98±0.37)s vs.(73.68±5.09)s,n=5,P<0.01,day15],表明脑创伤损害了动物的空间参考记忆能力和空间工作记忆能力。与sham组相比,TBI组大鼠海马AQP-4在蛋白质水平上的表达和脑含水量持续升高,15 d恢复正常;在12 h[(3.78±0.74),(83.78±0.35)%]和72 h[(3.49±0.85),(82.28±0.63)%]均形成两个波峰,n=5,P均<0.01,表明继发性脑损伤与持续脑水肿和海马AQP-4在蛋白质上的高表达有关。与sham组相比,NeuN标记和免疫荧光检测发现,TBI后24 h致大鼠海马神经元丢失严重[(198.2±8.002)vs.(297.2±6.866)cells/mm2,n=5,P<0.01],表明TBI动物的海马功能受损。与sham相比,TBI组海马神经元树突标志物微管结合蛋白2(microtubule associated proein 2,MAP2)和突触前终末特异性标记物突触素(synaptophysin,SYN)在蛋白质水平均伤后逐步降低(n=5,P均<0.01),72 h[(0.55±0.05)vs.(1.27±0.08),(0.52±0.14)vs.(1.06±0.16),n=5,P均<0.01]降低最明显;TBI组形成神经元纤维缠结主要成分的过度磷酸化tau(ser404),伤后逐步升高,72 h[(1.25±0.11)vs.(0.33±0.07),n=5,P<0.01]升高最明显。MAP2、SYN和过度磷酸化的tau(ser404)检测指标的改变,表明脑损伤致神经元受损,神经元生长和损伤修复能力减弱,最终导致神经元骨架破环,TBI损害了动物的海马空间记忆能力。与sham组相比,TBI组大鼠海马环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)和磷酸化CREB ser133(phosphorylated CREB Ser133,pCREB Ser133)含量降低明显(n=5,P均<0.05),表明脑损伤动物海马的存储记忆能力减弱;TBI组大鼠海马一般调控阻遏蛋白激酶2(general control nonderepressible 2 kinase,GCN2)蛋白质升高明显(n=5,P均<0.05),表明脑损伤动物海马将新信息转化成长期记忆能力下降。本研究提示,创伤性脑损伤可使大鼠海马神经元骨架破坏,进而导致在学习记忆过程中起重要作用的分子蛋白质下调,抑制记忆储存的蛋白质(GCN2)上调,促使学习记忆功能障碍。

熊果酸通过ROS/AMPK/STAT3信号通路抑制胃癌细胞COX-2表达

目的探讨胃癌细胞中活性氧(ROS)/单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)/信号转导与转录活化因子3(STAT 3)信号通路在熊果酸抑制环氧化酶2(COX-2)表达中的作用。方法在人胃腺癌细胞株SGC-7901中加入不同浓度熊果酸(0、10、20、30μmol/L)培养24h,或用抗氧化剂N-乙酰-L半胱氨酸(NAC 2.5mmol/L)预处理30min后熊果酸再干预培养24h。采用荧光探针2′,7′-二氯荧光素(DCFH-DA)检测细胞内ROS水平,Western blot检测AMPK、STAT 3磷酸化水平和COX-2蛋白表达。结果熊果酸明显增加SGC-7901细胞内ROS生成和AMPK磷酸化水平,抑制STAT3磷酸化和COX-2蛋白表达(P<0.01或P<0.05);而NAC能有效逆转上述各指标的变化过程(P<0.01或P<0.05)。结论熊果酸可能通过ROS/AMPK/STAT3信号转导通路抑制胃癌细胞COX-2表达。

双黄连冻干粉成分分析及其与头孢拉定合用对人肝细胞功能的影响

目的检测双黄连冻干粉中的成分含量并探讨双黄连冻干粉及其成分与头孢拉定合用对人肝细胞(HL-7702)功能的影响。方法应用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测双黄连冻干粉主要成分黄芩苷、汉黄芩素、绿原酸、连翘苷的含量。取双黄连冻干粉以及双黄连冻干粉中各主要成分单独或与头孢拉定合用对HL-7702分别分组进行培养。酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测培养后细胞上清液中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)的含量;HPLC检测细胞中二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的含量;琼脂糖凝胶电泳检测HL-7702细胞环氧化酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)的表达水平。结果注射用双黄连冻干粉中,黄芩苷含量最高,汉黄芩素含量最低。与对照组相比,高剂量黄芩苷组、连翘苷组、汉黄芩素组人肝细胞(HL-7702)中AST、ALT表达下降(P<0.05,P<0.01),绿原酸+头孢拉定组(0.046 mg/mL)与连翘苷+头孢拉定组(0.046 mg/mL)中ALT表达增加(P<0.05,P<0.01),AST表达差异无统计学意义(P>0.05);低剂量组与高剂量组中各组实验结果相似。与对照组相比,高剂量组中绿原酸组、绿原酸+头孢拉定组(0.046 mg/mL)与连翘苷+头孢拉定组(0.046 mg/mL)中ATP表达下降(P<0.05,P<0.01),ADP表达差异无统计学意义(P>0.05);低剂量组中黄芩苷组ATP、ADP表达增加(P<0.05),汉黄芩素组、黄芩苷+头孢拉定组(0.046 mg/mL)与汉黄芩素+头孢拉定组(0.046 mg/mL)中ATP、ADP表达下降(P<0.05,P<0.01)。与对照组相比,头孢拉定组HL-7702细胞COX-2、HO-1的表达差异无统计学意义(P>0.05),双黄连不同剂量组以及与头孢拉定合用组HO-1、COX-2表达均增加且差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论注射用双黄连冻干粉中各成分对肝细胞存在影响,其中黄芩苷影响显著,与头孢拉丁合用时增加头孢拉定对肝细胞的影响。

2-氯乙醇经NMDAR/cAMP/PKA信号通路致星形胶质细胞AQP4蛋白表达增强

目的探讨N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)/环磷酸腺苷(cAMP)/cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)信号通路在2-氯乙醇上调星形胶质细胞(AS)表达水通道蛋白-4(AQP4)中的作用。方法①取对数生长期的AS予剂量为0.0、7.5、15.0和30.0 mmol/L 2-氯乙醇(设为相应剂量组)刺激12 h后,收集细胞进行检测。②取对数生长期的AS为空白对照组、抑制剂(MK-801或H89)对照组、2-氯乙醇组、抑制剂(MK-801或H89)干预组。空白对照组不予任何处理;抑制剂对照组仅予浓度为10.0μmmol/L MK-801或15.0μmmol/L H89处理;MK-801干预组以浓度为10.0μmmol/L的MK-801提前干预30 min,H89干预组以浓度为15.0μmmol/L的H89提前干预1 h;干预结束后,2-氯乙醇组和MK-801、H89干预组AS均予浓度为30.0 mmol/L的2-氯乙醇刺激12 h。③收集各组AS,采用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量聚合酶链式反应法检测AS内AQP4、NMDAR受体主亚基(NR1)、NMDAR受体2B亚基(NR2B)、钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的蛋白和mRNA的表达,采用蛋白免疫印迹法检测磷酸化CaMKⅡ(p-CaMKⅡ)和PKA的表达;采用比色法检测AS内钙离子(Ca^(2+))浓度,采用酶联吸附试验检测腺苷酸环化酶(AC)活力和cAMP水平。结果①30.0 mmol/L剂量组AS内AQP4、NR1、NR2B的蛋白与mRNA,PKA蛋白、CaMKⅡmRNA的相对表达水平以及p-CaMKⅡ/CaMKⅡ蛋白比值、Ca^(2+)浓度、AC活力、cAMP水平均高于0.0 mmol/L剂量组(P<0.05)。PKA蛋白相对表达水平和Ca^(2+)浓度均随着2-氯乙醇剂量的增加而增加(P<0.05)。②2-氯乙醇组AS内AQP4蛋白相对表达水平、Ca^(2+)浓度均高于空白对照组和MK-801对照组(P<0.05),MK-801干预组AS内AQP4蛋白相对表达水平和Ca^(2+)浓度均低于2-氯乙醇组(P<0.05);2-氯乙醇组AS内AQP4和PKA蛋白相对表达水平均高于空白对照组和H89对照组(P<0.05),H89干预组AS内AQP4和PKA蛋白相对表达水平均低于2-氯乙醇组(P<0.05)。结论 2-氯乙醇可通过激活NMDAR/cAMP/PKA信号通路诱导AS中AQP4的表达增强。

一种新的转录因子TORC2在脂联素抑制肝糖异生过程中的作用及机制研究

目的:探讨环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)辅激活物-活性调节2传感器(TORC2)在脂联素抑制肝糖异生过程中的作用及机制。方法:实验室前期已构建的人脂联素真核表达质粒,并成功转染人肝细胞系L-02细胞。在此基础上采用蛋白免疫印迹试验、免疫组织化学等方法,对比不同葡萄糖浓度处理后的脂联素转染组和转染空质粒对照组L-02细胞中TORC2细胞内定位,以及磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、CREB、p-CREB蛋白表达差异,同时监测各组葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)活性。结果:与对照组相比,转染组p-AMPK蛋白表达量显著增高(P<0.05),CREB、p-CREB蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)。定位分析显示转染组TORC2主要位于细胞质,而对照组TORC2主要位于细胞核内。葡萄糖关键酶检测发现转染组G-6-Pase活性显著低于对照组(P<0.05)。结论:脂联素抑制糖异生的机制可能与活化p-AMPK、抑制TORC2去磷酸化、阻止TORC2进入细胞核以及抑制糖异生关键酶基因表达有关。

基于VIP-cAMP-PKA-AQP3信号通路探讨枳实-白芍药对调控C-IBS的作用及机制

目的:研究不同配伍比例的枳实-白芍药对对便秘型肠易激综合征(C-IBS)大鼠的影响,探讨其对C-IBS的作用及机制。方法:取SPF级Wistar成年雄性大鼠60只,随机留取10只大鼠作为空白组。其余50只大鼠为实验组,均采用冰0.9%氯化钠溶液灌胃的方法制备C-IBS模型,造模成功后将50只实验组大鼠随机分为模型对照组、匹维溴铵组、枳实-白芍药对1∶1组、枳实-白芍药对1∶2组、枳实-白芍药对2∶1组,每组10只。经过14 d治疗后,计算粪便含水量,ELISA法检测血清血管活性肠肽(VIP)、环磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶A(PKA)、水通道蛋白3(AQP3)的含量,荧光定量PCR检测结肠组织VIP、PKA、AQP3 mRNA的表达,Western Blot检测结肠组织cAMP、PKA、AQP3蛋白的表达。结果:与模型对照组比较,枳实-白芍药对1∶1组、枳实-白芍药对1∶2组、枳实-白芍药对2∶1组均可升高粪便含水量(P<0.05),枳实-白芍药对2∶1组可显著升高血清VIP、cAMP、PKA、AQP3含量(P<0.01),枳实-白芍药对1∶1组可升高血清VIP含量(P<0.05),枳实-白芍药对1∶2组可显著升高血清VIP、cAMP、AQP3含量(P<0.01,P<0.05),枳实-白芍药对1∶1组、枳实-白芍药对1∶2组、枳实-白芍药对2∶1组均可显著升高结肠组织VIP、PKA、AQP3 mRNA和cAMP、PKA、AQP3蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),且各组之间差异无统计学意义,说明枳实和白芍配伍时以经典名方枳实芍药散的原方剂量即可。结论:枳实-白芍药对配伍比例为1∶1时即可发挥治疗C-IBS的作用,其机制可能与调控VIP-cAMP-PKA-AQP3信号通路有关。