大肠杆菌BL21(DE3)磷酸转乙酰基酶缺陷变株的发酵研究

研究了E .coliBL2 1(DE3)及其磷酸转乙酰基酶 (PTA)缺陷变株FR5 5发酵过程中菌体生长和有机酸产生情况 ,并以肿瘤坏死因子 (TNF)为外源蛋白表达的模型考察了pta基因缺陷对外源蛋白表达的影响。在摇瓶培养条件下 ,pta变株TNF的表达水平比亲株提高了 2 3 %。在 5L发酵罐中进行了补料分批培养试验 ,在不限制比生长速率的条件下 pta变株能够以较长时间和较高比生长速率保持对数生长 ,最终达到 32 5 g(DCW ) /L的菌密度 ,TNF的总表达量达 2 8g/L ;而在相同条件下 ,以BL2 1(DE3)为受体菌的对照组最高菌密度为 19 5g(DCW ) /L ,TNF总表达量只有 0 84g/L。表明 pta变株对于提高工程菌外源蛋白的表达和实现高密度培养具有一定应用价值。分析了补料分批培养过程中发酵液有机酸组成和含量的动态变化情况 ,发现pta变株乙酸累积水平明显降低(为亲株乙酸累积水平的 42 % )的同时 ,其他几种有机酸 (丙酮酸、乳酸、琥珀酸 )的累积有显著增加的趋势 ,使发酵液中总有机酸浓度增加了 12 3% 。

E.coliBL21(DE3)磷酸转乙酰基酶缺陷变株的筛选及特性

目的 :利用大肠杆菌磷酸转乙酰基酶 (PTA)缺陷变株减少工程菌乙酸的产生 ,以利于工程菌高密度培养及外源蛋白表达。方法 :从E .coliBL2 1(DE3)出发筛选PTA变株 ,并对变株的特性进行研究。结果 :筛选得到 5株磷酸转乙酰基酶缺陷变株 ,变株的乙酸累积水平为亲株的 1/ 5左右 ,最大比生长速率为亲株的 2 / 3左右。各种有机酸 (乙酸、乳酸、丙酮酸和琥珀酸 )对BL2 1(DE3)及其变株生长影响的考察结果显示 ,有机酸对PTA变株的生长抑制曲线发生了一定变化 ,其中以乙酸影响的变化最为显著。低浓度乙酸对PTA变株的生长不但不具抑制作用反而具有刺激作用 ,而高浓度乙酸对变株生长的抑制作用也明显减弱。

酪丁酸梭菌代谢工程菌的构建及其发酵特性

酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum可以利用葡萄糖、木糖、纤维二糖、阿拉伯糖等多种底物进行产酸发酵,主要发酵产物为丁酸和乙酸,是一种适合于木质纤维素同步糖化发酵生产丁酸的菌种。将酪丁酸梭菌乙酸发酵关键基因取代为丁酸发酵关键基因来构建突变株,可使突变株丁酸发酵量增多,乙酸发酵量减少。分别获得来源于丙酮丁醇梭菌的丁酸代谢关键酶基因——乙酰乙酰辅酶A转移酶基因(thl)、来源于酪丁酸梭菌本身的乙酸代谢关键酶基因片段——磷酸转乙酰基酶基因片段(pta)和来源于质粒pIMP1的红霉素抗性基因(em)。将它们与质粒pUC19相连构建为非复制性质粒pUC19-EPT。通过电转化将其导入酪丁酸梭菌中。利用红霉素抗性平板筛选获得转化子,通过PCR验证发现,获得的突变株染色体上pta被thl替换。在以葡萄糖为底物的发酵中,突变株丁酸得率为0.47,较野生型增大了34%,乙酸得率为0.05,较野生型下降了29%。