重组人尼克酰胺磷酸核糖转移酶及其活性位点突变体蛋白的制备及体外酶活性检测

目的:制备和纯化重组人NAMPT和NAMPT(H247A)蛋白,并对其体外酶活性进行检测。方法:以pcDNA3.1-hnampt为模板,通过PCR扩增获得两端分别为BamHⅠ和NdeⅠ酶切位点的hnampt片断,将该片断与pET-11a(+)表达型载体连接,通过点突变获得pET-11a(+)-hnampt(H247A),以测序鉴定构建质粒。将野生型和突变型分别转化至BL21star大肠杆菌,以IPTG诱导蛋白表达,以镍柱和分子筛纯化目标蛋白,以SDS凝胶电泳和质谱鉴定目标蛋白,以核磁共振的方法检测两个重组蛋白在体外酶活性。结果:测序结果表明,pET-11a(+)-hnampt(野生型)及pET-11a(+)-hnampt(H247A)(突变型)表达载体构建成功,突变位点正确。两种蛋白均在BL21star大肠杆菌获得表达,裂解后为可溶性蛋白,通过镍柱、分子筛获得纯化蛋白,SDS凝胶电泳和质谱鉴定证明重组蛋白为分子量约56 kD的NAMPT。核磁共振体外酶活性检测发现野生型NAMPT具有酶活性,而NAMPT(H247A)的酶活性降低了约5～10倍。结论:成功获得了有体外酶活性的人NAMPT蛋白和酶活性较低的人NAMPT(H247A)蛋白,为NAMPT蛋白作用研究提供了基础。

重组人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶2B7三个功能性突变体的构建、表达及活性比较

目的构建人尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶(UGT)2B7重组酶的3个功能性突变体UGT2B7*71S(A71S,211G>T),UGT2B7*2(H268Y,802C>T)和UGT2B7*5(D398N,1192G>A),以进一步研究该酶野生型和其突变体在对底物作用过程中的功能差异。方法应用细菌/杆状病毒系统,将构建的pFastBac-UGT2B7*71S,pFastBac-UGT2B7*2和pFastBac-UGT2B7*5重组质粒转化E.coli DH10Bac大肠杆菌,通过转座作用获得各自的重组粘粒(bac-mid),然后将其转染草地夜蛾(Sf)9细胞后,产生重组杆状病毒。这些病毒再感染Sf9细胞,即可获得野生型UGT2B7*1及其突变体的重组酶。野生型及突变体酶的活性以7-羟基-4-三氟甲基香豆素(7-HFC)为底物,用荧光法测定并分析比较。结果利用杆状病毒/昆虫细胞系统,成功地构建人UGT2B7重组酶的3个功能性突变体。UGT2B7*1对7-HFC的Km值为(0.331±0.018)mmol·L-1,Vmax值为(2.14±0.04)μmol·min-1·g-1蛋白;UGT2B7*71S对7-HFC的Km值为(0.260±0.026)mmol·L-1,Vmax值为(1.36±0.05)μmol·min-1·g-1蛋白;UGT2B7*2对7-HFC的Km值为(0.53±0.06)mmol·L-1,Vmax值为(9.5±0.5)μmol·min-1·g-1蛋白;UGT2B7*5对7-HFC的Km值为(0.59±0.05)mmol·L-1,Vmax值为(7.52±0.28)μmol·min-1·g-1蛋白。结论应用细菌/杆状病毒系统,成功构建了UGT2B7的3个功能性突变体,这些突变体可进一步用于对其他底物的代谢活性比较。

siRNA抑制弓形虫次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的表达

目的探讨小干扰RNA(siRNA)在弓形虫体内的对目的基因的表达调节作用。方法以弓形虫嘌呤代谢过程中的关键酶——次黄嘌呤、黄嘌呤、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPRT)编码基因为靶标,合成3对siRNA,以电穿孔的方式将不同的浓度的siRNA转染弓形虫。采用荧光定量PCR及[3H]-次黄嘌呤摄入量分别检测弓形虫HXGPRT mRNA及酶合成量。结果在针对HXGPRT编码基因设计的3对21nt的siRNA中,有1对(siRNA415)能明显降低HXGPRT mRNA水平及酶合成量。在转染后24h,4μmol/LsiRNA415电转弓形虫的HXGPRT mRNA水平及[3H]-次黄嘌呤摄入量分别降为模拟电转弓形虫的0.36±0.04及0.51±0.03倍(P<0.05)。结论21nt的siRNA在弓形虫体内能有效抑制目的基因的表达。siRNA在弓形虫体内的应用将为阐明未知基因的功能和抗弓形虫药物的筛选提供有力的工具。

烟酰胺磷酸核糖转移酶及其与肿瘤关系研究进展

烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)是哺乳动物细胞合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的限速酶;Nampt也是一种细胞因子,如作为一种新的具有结合并激活胰岛素受体、模拟胰岛素作用的脂肪细胞因子,调控B细胞分化、延缓中性粒细胞凋亡、参与炎症和免疫应答。本文就Nampt的结构、功能及其与肿瘤关系的研究进展作一综述。

尿苷二磷酸葡醛酸转移酶的研究进展

尿苷二磷酸葡醛酸转移酶(UGT)是体内最重要的Ⅱ相代谢酶,它可以参与许多内源性物质如胆红素、甾体激素、甲状腺激素、胆汁酸和脂溶性维生素等的代谢,在许多药物如阿片类药物、镇痛药、非甾体抗炎药和抗惊厥药等的代谢中也发挥着重要的作用。UGT在药物的吸收、分布、代谢和排泄中发挥重要作用。研究UGT特别是其基因多态性及其介导的药物-药物相互作用不仅可以指导临床用药,也可以揭示内源性物质代谢紊乱的机制。本文就UGT的分类、组织分布、对药物吸收的影响、基因多态性及其所介导的药物-药物相互作用进行综述。

大肠癌中乳清酸磷酸核糖转移酶的表达与临床病理特征关系的研究

有研究显示,肿瘤内氟尿嘧啶类药物代谢酶水平是决定5-Fu化疗有效性的重要因素[1]。而病理分级、组织类型、转移情况、Duke′s分期是影响结直肠癌患者预后的独立因素。

紫杉醇生物合成相关酶类的研究进展

紫杉醇(Taxus)是一种从红豆杉植物中提取出来的天然抗癌药物。笔者简要介绍了紫杉醇的化学结构和生物合成途径, 重点介绍了紫杉二烯合成酶、细胞色素P450单加氧酶、酰基转移酶和苯丙氨酸氨基变位酶等紫杉醇生物合成相关酶类的研究进展。

套筒冠式固定桥基牙龈沟液中碱性磷酸酶和天冬氨酸转氨酶的检测分析

目的探索套筒冠固位式固定桥对于牙周维护的作用。方法选择16例患者共64颗基牙,分为实验组和对照组,每组32颗基牙。在修复前以及修复后6、12个月,对基牙进行牙龈指数(GI)和龈沟出血指数(SBI)的检测,利用全自动生化分析仪检测基牙龈沟液中碱性磷酸酶(ALP)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性水平。结果在修复前与修复后12个月实验组与对照组之间GI、SBI比较差异有统计学意义(P<0.05),ALP、AST活性水平差异也有统计学意义(P<0.05)。结论套筒冠式固定桥有利于基牙牙周组织的保护。

微波对慢性牙周炎患者龈沟液中天冬氨酸转氨酶和碱性磷酸酶的影响

目的:观察慢性牙周炎的病人龈沟液(gingival crevicular fluid,GCF)中天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)及弹性蛋白酶(elastase,EA)在牙周基础治疗结合微波治疗后的变化。方法:用滤纸条的袋内取样法取34例患者一侧104个位点的基础治疗结合微波治疗的GCF样本,同时取对侧104个位点的基础治疗的GCF样本作为对照组,用全自动生化分析仪测定GCF-AST、GCF-ALP,用底物法检测GCF-EA。结果:基础治疗结合微波治疗后的AST、ALP及EA水平较单纯的基础治疗显著下降(P<0.01),各临床指标显著改善。结论:微波治疗可以降低慢性牙周炎病人的GCF-AST、GCF-AST和GCF-EA水平,对牙周炎有确切的治疗作用,可以在临床推广应用。

植物中的异戊烯基转移酶

介绍了近年来植物中异戊烯基转移酶(又称异戊烯基二磷酸合酶,IPPS)的研究进展,着重讨论IPPS的链长决定机制,同时分析了有待解决的问题。

CREB丝氨酸129位点磷酸化提高miR-132的水平

目的通过磷酸化的环磷酸腺苷效应元件结合蛋白(CREB)的激活,使表达记忆的相关蛋白获得长时记忆,探讨CREB丝氨酸(Ser)129位点的磷酸化对微小RNA-132(miR-132)的影响。方法采用长时程增强作用(LTP)电刺激,尾静脉注射方法给予糖原合成酶激酶3β抑制剂SB216763,应用蛋白质印迹法检测大鼠脑内海马区CREB的磷酸化水平,逆转录-聚合酶链反应检测miR-132的表达情况。结果高频刺激CA3-CA1神经环路可成功诱导LTP,使大鼠海马的CREB Ser129位点的磷酸化水平和miR-132的表达明显升高;SB216763可抑制糖原合成酶激酶3β的活性,从而抑制CREB Ser129的磷酸化,使LTP的斜率增幅明显降低,CREB Ser129的磷酸化水平及miR-132的表达明显降低。结论CREB Ser129位点的磷酸化通过调节miR-132的表达促进LTP形成,LTP形成过程中CREB Ser129位点的磷酸化可调节miR-132的表达,从而影响长期记忆形成。

人源瞬时受体电位M2型通道Nudix水解酶9同源结构域的提取和纯化

目的:摸索人源瞬时受体电位M2型通道(TRPM2)羧基端Nudix水解酶9(NUDT9)同源结构域(NUDT9-H)的蛋白提取和纯化方法。方法:异丙基硫代半乳糖苷诱导表达的Rosetta(DE3)大肠埃希菌菌株经超声破碎和离心后,将收集到的上清液与GST磁珠结合并用还原型谷胱甘肽洗脱以抽提GST-NUDT9-H融合蛋白,浓缩离心后再经分子排阻色谱层析纯化,最后经凝血酶酶切并与GST磁珠结合即得NUDT9-H蛋白。结果:含有0.5%的十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)裂解溶液体系和0.025%的DDM分子排阻层析色谱溶液体系能够提高GST-NUDT9-H融合蛋白的稳定性,再按每2 mg融合蛋白加入1 U凝血酶切割24 h,即获得高纯度NUDT9-H蛋白。结论:NUDT9-H蛋白稳定性较差,提取和纯化体系中需添加DDM以稳定其构象从而提高目的蛋白的产量和纯度。

非心源性疾病患者MB型肌酸激酶活性假性升高原因分析

目的:探讨非心源性疾病患者血清中MB型肌酸激酶(CK-MB)活性假性升高的原因及其与疾病的关系。方法:对日常采用免疫抑制法检测的CK-MB活性高于正常参考值(0～25U/L)、与肌酸激酶(CK)比值>0.38的55例标本进行CK同工酶琼脂糖凝胶电泳分析;1周后重取标本检测CK-MB,并与开始的CK-MB值进行比较,结合临床诊断进行分析。结果:55例患者根据临床诊断,其中恶性肿瘤41例(肝癌16例、肺癌11例、前列腺癌7例,其他肿瘤7例),肝硬化12例,其他2例;CK-MB含量百分比均<5%,其中34例恶性肿瘤检出线粒体型肌酸激酶(m acro-CK2),23例恶性肿瘤检出BB型CK(CK-BB),16例恶性肿瘤同时检出巨CK2和CK-BB。12例肝硬化患者均检出巨CK2。前后2次CK-MB活性浓度进行比较,变化差异无统计学意义(P>0.05)。结论:血清CK-MB活性的假性升高,主要是由于血液中出现了异常升高的CK-BB或巨CK(巨CK1、巨CK2);它们的出现与肝硬化及某些恶性肿瘤密切相关。

酪氨酸激酶B在涎腺腺样囊性癌中的表达及意义

目的探讨酪氨酸激酶B(TrkB)与涎腺腺样囊性癌(SACC)的关系。方法采用免疫组化链亲和素法分析45例SACC的TrkB表达,并统计分析TrkB与SACC病理学分型、临床分期、区域淋巴结转移和神经侵犯的关系。结果TrkB表达与SACC病理学分型无明显相关(P>0.05),而与临床分期、区域淋巴结转移和神经侵犯呈正相关(P<0.05)。结论TrkB能促进SACC区域淋巴结转移和神经侵犯的发生,并可作为指标来预测SACC的区域淋巴结转移和神经侵犯。

血清酶谱测定在颅脑损伤诊疗中的意义

目的:探讨血清酶的测定对判断颅脑外伤患者病情及预后的临床价值。方法:将患者分为轻型、重型颅脑外伤组,并与健康人做对照分析。结果:50例患者血清酶值较对照组差异有非常显著性(P<0.01)。结论:测定血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(ALP)、谷胺酰转肽酶(GGT)、淀粉酶(AMY)能辅助判断病情和预后,为临床诊疗提供快速、准确、有效的依据。

高脂饲料对细鳞鱼稚鱼刷状缘膜水解酶发育的影响

试验评价了蛋白质含量为48%时,脂肪含量分别为15%、20%、25%、30%的饲料对开口后20～60 d的细鳞鱼稚鱼肠道水解酶-γ-谷氨酰肽转移酶、碱性磷酸酶活性发育的影响。结果表明,适度的饲料脂肪含量可以提高水解酶活性,并强于生物饵料,促进了肠道对营养物质的消化。饲料脂肪为20%～30%的水平时,水解酶的活性相对较高。

非强心苷类正性肌力药作用机制及其应用研究进展

综述磷酸二酯酶抑制剂、钙增敏荆、β受体激动剂及其它非强心苷类正性肌力药的作用机制及其应用进展。

整合素连接激酶基因敲降和黑色素瘤分化相关基因过表达慢病毒载体构建和鉴定

目的：建立整合素相关激酶（ ILK）基因敲降和黑色素瘤分化相关基因（ mda7）过表达慢病毒包装表达系统。方法：针对人ILK基因序列，设计基因敲降靶点序列（A、B、C），通过限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接，将ILK插入慢病毒载体pSicoR-eGFP，构建siILK-pSicoR-eGFP重组质粒；根据人mda7基因序列，设计引物扩增mda7全长，并插入慢病毒载体pLVX-Puro，构建mda7-pLVX-Puro重组质粒。经双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染人胚肾细胞系293 T细胞，进行慢病毒包装并测定病毒滴度、观察感染效率。各组病毒载体转染PC-3细胞后，用定量PCR和蛋白质印迹法检测ILK基因和mda7 mRNA转录水平及蛋白表达水平。通过MTT法和Transwell实验考察ILK和mda7对PC-3细胞增殖和迁移的影响。结果：成功构建ILK基因敲降及mda7过表达的慢病毒载体，四质粒系统共转染293 T细胞后可见大量绿色荧光染色阳性细胞。浓缩病毒后293 T细胞的感染效率在90％以上，并能高效率感染PC-3前列腺癌细胞。 ILK-A-pSicoR-eGFP和ILK-B-pSicoR-eGFP组ILK干扰效果最佳（P＜0．05），mda7的表达水平远高于对照组（P＜0．05），且持续稳定表达至少1个月。 ILK和mda7对PC-3细胞的增殖在96 h内有明显抑制作用，并对其迁移亦有显著抑制（均P＜0．05）。结论：成功构建并鉴定人ILK 基因敲降和mda7过表达慢病毒载体，可为探讨ILK和mda7基因在肿瘤细胞中的生物学功能提供良好工具，也为探索安全、高效的肿瘤治疗途径奠定实验基础。

微生物来源的Aurora-B激酶抑制剂的分离、结构鉴定和抗肿瘤活性研究

目的从微生物代谢产物中分离和纯化Aurora-B激酶抑制剂并检测其抗肿瘤活性。方法以野生型酵母菌Y300和ipl1-321温度敏感型突变株为模式菌跟踪活性组分;从阳性放线菌I07A-01038发酵产物中分离纯化活性化合物并进行结构鉴定;体外酶学实验验证阳性化合物对Aurora-B激酶的抑制活性;MTT法检测阳性化合物对肿瘤细胞增殖的抑制活性;AnnexinV-FITC/PI双染法检测活性化合物对肿瘤细胞早期凋亡的诱导作用。结果从阳性放线菌I07A-01038发酵产物中得到活性化合物酒渣碱甲酯(flazinmethylester),酒渣碱甲酯对ipl1-321突变株具有特异性抑制作用,其在野生型酵母菌株Y300和突变株ipl1-321的IC50分别为48μmol/L和24μmol/L;体外酶学实验证实其对Aurora-B激酶具有抑制作用,其IC50为10μmol/L(ATP=50μmol/L);酒渣碱甲酯对HepG2、A549、Hela肿瘤细胞均具有杀伤活性,IC50分别为13、11和10μmol/L。并能够诱导Hela细胞发生早期凋亡。结论得到一个微生物来源的具有抗肿瘤活性的Aurora-B激酶抑制剂—酒渣碱甲酯。

PGM5-AS1抑制miR-4728-5p对宫颈癌细胞侵袭、转移的影响

目的 研究长链非编码RNA(lncRNA)葡萄糖磷酸变位酶样蛋白5反义(PGM5-AS)1对微小RNA(miRNA)-4728-5p的靶向调控及对宫颈癌细胞侵袭、转移的影响。方法 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测宫颈癌组织中PGM5-AS1表达。在宫颈癌SiHa细胞中转染pcDNA3.1-PGM5-AS1或anti-miR-4728-5p。采用噻唑蓝(MTT)法检测SiHa细胞的增殖,平板克隆形成实验分析细胞的克隆形成,Transwell小室法评估细胞的侵袭迁移,Western印迹测定细胞中细胞增殖抗原Ki67、E钙黏蛋白(E-cadherin)、N钙黏蛋白(N-cadherin)蛋白表达。生物信息学预测与双荧光素酶报告实验验证PGM5-AS1对miR-4728-5p的靶向调控。qRT-PCR检测miR-4728-5p的表达。结果 宫颈癌组织中PGM5-AS1的表达量明显减少(P<0.05)。转染pcDNA3.1-PGM5-AS1显著降低SiHa细胞的细胞存活率、克隆形成数、迁移细胞数、侵袭细胞数、Ki67和N-cadherin蛋白水平,并明显提高E-cadherin蛋白水平(P<0.05)。PGM5-AS1靶向抑制miR-4728-5p的表达。转染anti-miR-4728-5p明显减少SiHa细胞的细胞存活率、克隆形成数、迁移细胞数、侵袭细胞数、Ki67和N-cadherin蛋白表达量,而显著增加高E-cadherin蛋白表达量(P<0.05)。结论 PGM5-AS1通过靶向miR-4728-5p,抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭、转移。