脑胶质瘤中磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B及同源磷酸酶-张力蛋白表达水平

目的探讨PI3K、AKT、PTEN在脑胶质瘤中的表达。方法选择2017年1~12月在我院及华山医院手术治疗的脑胶质瘤患者66例的病理标本进行分析,另选择50例患者的正常脑组织病理标本为参照。应用免疫组化方法检测磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B及同源磷酸酶-张力蛋白表达,比较脑胶质瘤组织中以及正常脑组织中三者的表达水平,分析脑胶质瘤组织中三者阳性表达的相关性。结果 PI3K及AKT在正常脑组织的阳性表达率显著低于低级别脑胶质瘤及高级别脑胶质瘤,差异有统计学意义(P<0.05);低级别脑胶质瘤显著低于高级别脑胶质瘤,差异有统计学意义(P<0.05)。正常脑组织PTEN蛋白阳性率100.0%,显著高于低级别脑胶质瘤与高级别脑胶质瘤,差异有统计学意义(P<0.05);低级别脑胶质瘤显著高于高级别脑胶质瘤,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PI3K、AKT在脑胶质瘤中呈高表达,PTEN呈低表达,且与恶性程度有关。

miR-221靶向PTEN介导PI3K/AKT信号通路调节细胞自噬参与帕金森病的机制研究

目的探讨微小RNA-221(miR-221)靶向磷酸脂酶与张力蛋白同源物基因(PTEN)介导磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB也称AKT)信号通路调节细胞自噬参与帕金森病(PD)进展的机制研究。方法采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)作用于肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞建立PD模型;转染miR-221模拟物或抑制剂来调节miR-221的表达;细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测PC12细胞存活率;电镜观察自噬体;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析确定miR-221的表达;蛋白印迹法(Western blot)检测自噬蛋白标志物(LC3-II)和PTEN/PI3K/AKT信号蛋白的表达。结果在PD细胞模型中,miR-221的表达水平下降(P<0.01),LC3-II蛋白表达水平上调(P<0.01),自噬体增加;与6-OHDA组相比,过表达miR-221降低了LC3-II蛋白的表达水平(P<0.05),并增加了细胞存活率(P<0.001),而沉默miR-221增加了LC3-II蛋白的表达水平(P<0.05),并降低了细胞存活率(P<0.001);此外,与6-OHDA组相比,过表达miR-221降低了PTEN蛋白的表达(P<0.01),增加了PI3K蛋白的表达(P<0.001)以及AKT蛋白磷酸化程度(P<0.01),而沉默miR-221增加了PTEN蛋白的表达(P<0.01),降低了PI3K蛋白的表达(P<0.05)以及AKT蛋白磷酸化程度(P<0.05)。结论 miR-221在6-OHDA诱导的PC12细胞中表达降低,上调miR-221可靶向PTEN介导PI3K/AKT信号通路来调节自噬,从而发挥对PD细胞模型的保护作用。

苦酸通调方对HepG2细胞胰岛素抵抗模型中IRS-1、PI3K、Akt蛋白表达的影响

目的观察苦酸通调方对HepG2细胞胰岛素抵抗(IR)模型中内胰岛素受体底物(IRS)-1、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)信号分子的影响并探讨相关机制。方法通过0.25 mmol/L棕榈酸联合30 mmol/L高糖孵育24 h诱导HepG2 IR细胞模型,予以不同浓度的苦酸通调方(50,100,200μg/ml)。葡萄糖试剂盒检测细胞培养液上清葡萄糖含量,肝糖原试剂盒测定HepG2细胞内肝糖原含量,蛋白免疫印迹法(Western印迹)检测细胞内IRS-1、PI3K、Akt的蛋白表达。结果与模型组相比,苦酸通调方干预后,呈剂量依赖性增加IR HepG2细胞的葡萄糖消耗量及细胞内肝糖原含量(P<0.05),上调IRS-1、PI3K、Akt蛋白磷酸活化水平(P<0.05)。结论苦酸通调方改善2型糖尿病IR作用可能与影响IRS-1、PI3K、Akt蛋白表达相关。

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨蚕沙提取物对糖尿病胃轻瘫大鼠Cajal间质细胞的影响

目的:基于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路探讨蚕沙提取物对糖尿病胃轻瘫(DGP)大鼠的治疗作用机制。方法:将105只大鼠随机选取15只作为空白组,制备DGP大鼠模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组、蚕沙提取物高、中、低剂量组(3.2、1.6、0.8 g·kg^(-1))及莫沙必利组(1.5 mg·kg^(-1)),每组12只,灌胃4周。检测大鼠胃排空率、随机血糖,苏木素-伊红(HE)染色观察胃窦部形态变化,免疫组化分析c-Kit表达,原位末端标记法(TUNEL)染色观察Cajal间质细胞凋亡,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PI3K、磷酸化(p)-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR及p-mTOR的蛋白表达。结果:与空白组比较,模型组胃排空率显著降低(P<0.01),胃窦部腺体结构破坏,c-Kit表达显著减少(P<0.01),Cajal间质细胞(ICC)凋亡增加;与模型组比较,蚕沙提取物高、中、低剂量组及莫沙必利组胃排空率均显著升高(P<0.01),胃窦腺体结构逐渐紧密,ICC凋亡减少,其中蚕沙提取物高剂量组c-Kit表达明显升高(P<0.05)。经Western blot检测,与空白组比较,模型组p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K及p-mTOR/mTOR蛋白表达均升高(P<0.01);与模型组比较,蚕沙提取物高剂量组p-Akt/Akt蛋白表达降低(P<0.01),蚕沙提取物中、低剂量组及莫沙必利组p-PI3K/PI3K蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),蚕沙提取物低剂量组p-mTOR/mTOR蛋白表达降低(P<0.05)。在随机血糖方面,与空白组比较,模型组随机血糖显著升高(P<0.01);与模型组比较,蚕沙提取物高、中剂量组随机血糖明显降低(P<0.05);与莫沙必利组比较,蚕沙提取物高剂量组p-Akt/Akt蛋白表达降低(P<0.05),蚕沙提取物高、中、低剂量组p-PI3K/PI3K蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论:蚕沙提取物可提高DGP大鼠胃排空率、减轻ICC的凋亡,同时降低随机血糖,其中蚕沙提取物高剂量组抑制ICC凋亡疗效显著,其作用机制可能与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

加味桂枝茯苓丸通过PTEN/PI3K/Akt通路调控线粒体凋亡途径预防小鼠结直肠腺瘤的作用机制

目的:探讨加味桂枝茯苓丸通过磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路调控线粒体凋亡途径预防小鼠结直肠腺瘤(CRA)的作用及机制。方法:将60只SPF级C57BL/6雄性小鼠随机分为正常组、模型组、加味桂枝茯苓丸低、中、高剂量组(13、26、52 g·kg^(-1)·d^(-1)),阳性药阿司匹林组(0.015g·kg^(-1)·d^(-1)),通过氧化偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠(DSS)化学诱导CRA小鼠模型,造模同时灌胃给予加味桂枝茯苓丸或阿司匹林。给药期间,每周检测各组小鼠体质量;9周后,观察腺瘤形成数目;酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平;苏木素-伊红(HE)染色观察腺瘤组织病理变化;免疫组织化学法(IHC)检测细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和细胞增殖核抗原(Ki67)的表达;原位末端转移酶标记法(TUNEL)检测腺瘤组织细胞凋亡情况;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)观察PTEN、PI3K、Akt、磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化Ak(p-Akt)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞色素C(Cyt C)、胱天蛋白酶-9(Caspase-9)、胱天蛋白酶-3(Caspase-3)mRNA和蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组小鼠体质量在第1周至第2周无明显变化,第3周至第9周明显降低(P<0.05,P<0.01);结直肠长度显著缩短,结直肠重量显著增加,黏膜表面可见大小不等的瘤样突起(P<0.01);血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平升高(P<0.01);小鼠肠上皮腺体结构紊乱,细胞核明显拉长且可见病理性核分裂,固有层可见大量淋巴细胞小灶性浸润;Cyclin D1、Ki67阳性表达率显著升高(P<0.01);腺瘤细胞凋亡率显著降低(P<0.01);腺瘤组织PI3K、Akt、Bcl-2 mRNA和蛋白表达显著增强(P<0.01),p-PI3K、p-Akt蛋白表达显著增强(P<0.01),PTEN、Bax、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3 mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,各给药组小鼠体质量上升(P<0.01);肠道重量减轻,结直肠长度增加,腺瘤数量明显减少(P<0.05,P<0.01);血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量显著降低(P<0.01);肠上皮腺体结构紊乱及黏膜固有层中性粒细胞浸润程度有所改善;Cyclin D1、Ki67阳性表达率显著下降(P<0.01);腺瘤组织细胞凋亡率明显增加(P<0.05,P<0.01);腺瘤组织PI3K、Akt、Bcl-2 mRNA和蛋白表达下降(P<0.05,P<0.01),p-PI3K、p-Akt蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),PTEN、Bax、Cyt C、Caspase-9、Caspase-3 mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01),以加味桂枝茯苓丸高剂量组干预效果最为显著。结论:加味桂枝茯苓丸可能通过调控PTEN/PI3K/Akt信号通路,进而诱导线粒体凋亡途径发挥预防小鼠CRA的作用。

楮实子水提物对二乙基亚硝胺诱发小鼠肝细胞癌的抑制作用及PTEN/PI3K/Akt信号通路的影响

目的:基于同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路探讨楮实子水提物对二乙基亚硝胺(DEN)诱发小鼠肝细胞癌(HCC)的抑制作用。方法:采用腹腔注射DEN的方法构建原发性HCC小鼠模型,将HCC小鼠随机分为模型组、索拉非尼组(0.01 g·kg^(-1)·d^(-1))、楮实子水提物低、中、高剂量组(0.9、1.8、3.6 g·kg^(-1)·d^(-1)),每组10只;另取10只C57BL/6小鼠作为空白组,腹腔注射等体积生理盐水。在小鼠肝脏出现肝癌样白色结节后灌胃给予不同浓度的楮实子水提物;索拉非尼组给予索拉非尼灌胃;空白组和模型组小鼠给予生理盐水灌胃。生化分析仪检测小鼠血清碱性磷酸酶(ALP)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)及γ-谷氨酰转移酶(γ-GT)活性;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测肿瘤标志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)表达水平;苏木素-伊红(HE)染色及马松(Masson)染色观察肝细胞癌变程度及肝细胞损伤情况;免疫组织化学染色观察肝癌细胞增殖情况;脱氧核苷酸末端转移介导的缺口末端标记法(TUNEL)染色观察小鼠肝癌细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PTEN/PI3K/Akt信号通路相关蛋白PTEN、PI3K、磷酸化-Akt(p-Akt)蛋白表达水平变化。结果:与空白组比较,模型组小鼠ALP、AST、ALT、γ-GT活性及AFP、CEA表达水平显著升高(P<0.01);小鼠肝组织癌变和炎症细胞浸润现象明显,可见大量蓝色胶原纤维增生;肿瘤增殖抗原(Ki67)阳性的增殖细胞数量显著增加(P<0.01);PTEN蛋白表达被抑制(P<0.01),并促进PI3K、p-Akt蛋白表达(P<0.01);与模型组比较,楮实子水提物中、高剂量组小鼠血清中ALP、AST、ALT、γ-GT活性及AFP、CEA表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01);且小鼠肝组织癌变程度和炎症细胞浸润明显减轻,胶原纤维增生明显减少;楮实子水提物中、高剂量组Ki67阳性的增殖细胞数量明显减少(P<0.05,P<0.01),楮实子水提物高剂量组TUNEL阳性的凋亡细胞数量明显增加(P<0.05,P<0.01);楮实子水提物楮实子水提物中、高剂量组促进PTEN蛋白表达(P<0.05,P<0.01),抑制p-Akt蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论:楮实子水提物对DEN诱发的小鼠原发性HCC具有显著的抑制作用,其作用机制可能与调控PTEN/PI3K/Akt信号通路中关键蛋白表达有关。

白虎汤调节IRS-1/PI3K/Akt信号通路对2型糖尿病大鼠血糖、血脂代谢及血管重构的影响

目的:研究白虎汤对2型糖尿病大鼠的血糖、血脂代谢,血管重构的影响及其对胰岛素受体底物-1(IRS-1)/胞内磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的调节作用。方法:将90只大鼠随机分为正常组、模型组、白虎汤低、中、高剂量组及二甲双胍组,15只/组,除正常组大鼠外,其余大鼠采用腹腔注射链脲佐菌素法建立2型糖尿病模型。白虎汤低、中、高剂量组大鼠根据体质量分别灌胃给予大鼠白虎汤溶液,剂量分别为5,10,20 g·kg^(-1),二甲双胍组灌胃给予大鼠二甲双胍(100 mg·kg^(-1)),正常组及模型组给予等体积生理盐水,所有大鼠每日给药1次,连续给药12周。给药结束后测定各组大鼠空腹血糖,糖化血红蛋白,血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-6(IL-6),白细胞介素-1β(IL-1β),总胆固醇(TC),甘油三酯(TG)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠肝脏固醇调节元件结合蛋白1C(SREBP1C),乙酰CoA羧化酶(ACC),脂肪酸合成酶基因(FASN)等脂质合成基因及肉毒碱棕榈酰基转移酶1A(CPT1A),酰基辅酶A氧化酶1(ACOX1),重组人中链酰基辅酶A脱氢酶(ACADM)等脂肪酸氧化基因的mRNA水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠肝脏IRS-1,PI3K,Akt蛋白水平,苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠胸主动脉血管组织病理学变化,划痕实验检测大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞迁移能力。结果:与正常组比较,模型组大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白、血清TNF-α,IL-6,IL-1β,TC,TG及LDL-C水平,肝脏脂质合成基因mRNA水平,大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞迁移能力均明显升高(P<0.05),肝脏脂肪酸氧化基因mRNA水平及IRS-1,PI3K,Akt蛋白表达明显降低(P<0.05),大鼠胸主动脉血管壁厚度明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,白虎汤各剂量组大鼠空腹血糖、糖化血红蛋白、血清TNF-α,IL-6,IL-1β,TC,TG及LDL-C水平,肝脏脂质合成基因mRNA水平,大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞迁移能力均明显降低(P<0.05),肝脏脂肪酸氧化基因mRNA水平及IRS-1,PI3K,Akt蛋白水平均明显升高(P<0.05),大鼠胸主动脉组织病理学明显改善,且血管壁厚度明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:白虎汤能够降低2型糖尿病大鼠血糖、血脂及血清炎症因子水平,调节肝脏脂质代谢相关基因的表达,改善胸主动脉血管组织病理学及血管重构,其机制可能与调节IRS-1/PI3K/Akt信号通路有关。

基于PTEN/PI3K/Akt信号通路探讨归芍运脾汤防治乳腺增生的机制

目的:基于磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路研究归芍运脾汤防治乳腺增生大鼠的作用机制。方法:将70只SPF级SD大鼠随机分为正常组(n=15)和造模组(n=55),造模组大鼠采用综合造模法(饥饱失常法+夹尾刺激法+苯甲酸雌二醇+黄体酮)复制乳腺增生模型,随后各取5只进行模型验证。模型复制成功后将造模组大鼠随机分为模型组、枸橼酸他莫昔芬组和归芍运脾汤高、中、低剂量组,共5组,每组10只。正常组和模型组大鼠给予10 mL·kg^(-1)·d^(-1)蒸馏水灌胃,归芍运脾汤高、中、低剂量组分别给予17.2、8.6、4.3 g·kg^(-1)·d^(-1)归芍运脾汤汤剂灌胃,枸橼酸他莫昔芬组给予4 mg·kg^(-1)·d-1枸橼酸他莫昔芬灌胃,治疗30 d后观察大鼠一般生存状况,采用超声诊断仪测定乳腺组织厚度,采用旷场实验阳性反应进行行为学评价,采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定乳腺组织中B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的含量,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测乳腺组织中PTEN、PI3K、Akt mRNA表达水平,采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PTEN、PI3K、Akt、磷酸化(p)-Akt蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠暴躁易激惹,扎堆蜷卧,旷场实验反应阳性,乳头肿胀明显,乳腺厚度明显增加(P<0.05);乳腺组织中Bcl-2含量明显升高、Bax含量明显降低(P<0.05),乳腺组织中PTEN mRNA表达水平明显降低,PI3K、Akt mRNA表达水平明显升高(P<0.05),PTEN、PI3K、Akt蛋白表达水平与mRNA基本一致;与模型组比较,各给药组大鼠一般生存状态、乳头肿胀程度不同程度缓解,旷场实验反应阳性不同程度改善,乳腺厚度变薄(P<0.05),乳腺组织中Bcl-2含量明显降低、Bax含量明显升高(P<0.05),乳腺组织中PTEN mRNA表达水平明显升高,PI3K、Akt mRNA表达水平明显降低(P<0.05),PTEN、PI3K和Akt蛋白表达水平与mRNA基本一致。结论:归芍运脾汤能够有效改善乳腺增生大鼠一般生存状况,减轻乳腺增生程度,其具体机制可能与归芍运脾汤有效调控PTEN/PI3K/Akt通路而实现。

过表达miR-132对糖尿病视网膜病变Müller细胞的保护作用及相关机制

目的研究过表达微小RNA(miR)-132对糖尿病视网膜病变Müller细胞的保护作用及相关机制。方法选取10只SPF级大鼠,构建糖尿病视网膜病变模型,建模成功后分离出视网膜Müller细胞,做细胞培养。将Müller细胞分为对照组、沉默组、过表达组,对照组不进行任何处理,沉默组做miR-132沉默(miR-132 inhibitor)转染,过表达组做miR-132过表达(miR-132 mimic)转染。鉴定miR-132转染效率,对比细胞存活、凋亡情况,分析细胞肿瘤抑制因子(PTEN)/磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路蛋白表达情况。结果与对照组相比,沉默组miR-132表达明显降低,过表达组miR-132表达明显升高(P<0.05)。与沉默组相比,过表达组各时间点细胞存活率明显升高,细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。与沉默组相比,过表达组p-PTEN表达量明显降低,p-PI3K、p-AKT、p-促凋亡蛋白(Bad)、Bcl-2表达量明显升高(P<0.05)。结论过表达miR-132可经抑制糖尿病视网膜病变Müller细胞凋亡,增加存活率而发挥保护作用,其作用机制可能与调控PTEN/PI3K/AKT通路相关。

基于PI3K/Akt信号通路探讨金骨莲提取物抑制脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症反应的作用及机制

目的:探讨金骨莲提取物(JGL)对炎症的抑制作用及其机制。方法:实验分为空白组(10%胎牛血清),脂多糖(LPS)模型组(0.5 mg·L^(-1)),JGL给药组(10,20,40,60,80,120,160,200,250,300 mg·L^(-1)),JGL给药组同时给予LPS刺激(0.5 mg·L^(-1)),培养24 h进行后续检测。采用细胞增殖与检测试剂盒(CCK-8)试剂检测JGL对RAW264.7细胞增殖活性的影响;采用Griess法检测一氧化氮(NO)的释放;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β),IL-6,IL-10和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)释放;采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(Real-time PCR)检测炎症相关因子诱导型一氧化氮合酶(i NOS),前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)/环氧合酶-2(COX-2)的表达及蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)途径关键蛋白的活化。结果:与空白组比较,LPS(0.5 mg·L^(-1))刺激24 h后能显著促进RAW264.7细胞增殖(P<0.01),与模型组比较,JGL对细胞增殖无显著显著影响;与空白组比较,LPS(0.5 mg·L^(-1))能显著增加NO,IL-1β,IL-6,IL-10和TNF-α的释放(P<0.01),与模型组比较,JGL(20~300 mg·L^(-1))给药24 h后能剂量依赖性显著抑制NO的释放(P<0.01);与模型组比较,JGL各剂量组IL-1β,IL-6,IL-10均明显降低(P<0.05,P<0.01),但对TNF-α的释放未见明显的抑制作用;与空白组比较,LPS(0.5 mg·L^(-1))能显著诱导i NOS,PTGS2/COX-2基因表达(P<0.05,P<0.01),与模型组比较,JGL各剂量组能下调i NOS,PTGS2/COX-2 m RNA的表达(P<0.05,P<0.01);与空白组比较,LPS(0.5 mg·L^(-1))组PI3K/Akt通路显著活化(P<0.01),JGL(10,20,40,80 mg·L^(-1))显著降低PI3K p110和p-PI3K p85蛋白及Akt磷酸化水平(P<0.01),抑制PI3K/Akt通路活化。结论:金骨莲提取物能明显抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应,减少炎症因子的释放,其抗炎作用与抑制PI3K/Akt途径有关。

参白解毒方通过调控PTEN/PI3K/Akt信号通路抑制结直肠癌细胞增殖

目的:研究参白解毒方基于磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路抑制结直肠癌细胞HCT116增殖的作用机制。方法:采用水提醇沉法提取参白解毒方有效部位进行冻干粉制备;体外培养HCT116细胞,用参白解毒方(2、4、8、16 g·L^(-1))对HCT116细胞进行处理,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测参白解毒方对HCT116细胞增殖的抑制作用;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测细胞PTEN、PI3K、Akt、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、c-核蛋白类基因(c-Myc)、生存素(Survivin)和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PTEN、磷酸化磷酸酶及张力蛋白同源物(p-PTEN)、PI3K、Akt、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、GSK-3β、磷酸化糖原合成酶激酶-3(p-GSK-3β)、c-Myc、Survivin、CyclinD1的蛋白表达水平;免疫荧光检测β-连环蛋白(β-catenin)入核情况。结果:与空白组比较,参白解毒方各质量浓度均可以显著抑制HCT116细胞的增殖(P<0.01),且具有浓度依赖性。与空白组比较,参白解毒方处理细胞后PTEN、GSK-3βmRNA表达水平均上调,PI3K、Akt、c-Myc、Survivin、CyclinD1 mRNA表达水平均下调(P<0.01);细胞PTEN、p-PTEN和GSK-3β蛋白表达水平上调,PI3K、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β、c-Myc、Survivin、CyclinD1蛋白表达水平均下调(P<0.05,P<0.01)。免疫荧光结果显示参白解毒方可以抑制结直肠癌细胞HCT116中β-catenin的入核。结论:参白解毒方可以抑制结直肠癌细胞HCT116的增殖,其作用机制可能是通过调节PTEN/PI3K/Akt信号通路。

山豆根水提物对类风湿关节炎骨破坏及PI3K/Akt信号通路的影响

目的:观察山豆根水提物对类风湿关节炎(RA)的干预影响,并基于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路研究其抗RA骨破坏的作用及机制。方法:采用高效液相色谱(HPLC)测定山豆根水提物中主要活性物质的含量,应用Ⅱ型胶原诱导法建立类风湿关节炎模型(CIA)小鼠,设正常组、模型组、甲氨蝶呤组(0.5 mg·kg^(-1))、山豆根水提物低、高剂量组(100、200 mg·kg^(-1))。观察CIA小鼠关节红肿畸形表现及关节炎临床积分;苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠关节组织病理改变;微计算机断层扫描技术(Micro-CT)检测小鼠关节骨破坏程度;抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察小鼠关节组织中破骨细胞形成情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠关节组织中PI3K/Akt信号通路关键蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组小鼠关节红肿畸形程度、关节炎临床积分、滑膜增生及炎性细胞浸润程度显著升高(P<0.01),关节组织骨破坏程度、破骨细胞形成数目及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、组织蛋白酶K(CTSK)、活化T细胞核因子1蛋白(NFATc1)、PI3K和磷酸化(p)-Akt蛋白表达均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,山豆根水提物各剂量组能明显改善CIA小鼠关节畸形程度及关节炎临床积分(P<0.05,P<0.01),缓解小鼠关节组织病理改变(P<0.01),且降低小鼠关节骨破坏程度和破骨细胞形成情况(P<0.05,P<0.01),此外还显著下调小鼠关节组织中PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达(P<0.01)。结论:山豆根水提物能够显著延缓RA炎症反应,尤其抑制骨破坏,其作用机制可能与下调PI3K/Akt信号通路有关。

桑叶调节PI3K/Akt/PPARα/CPT-1通路改善2型糖尿病大鼠肝脏糖脂代谢紊乱机制

目的:基于磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/过氧化物酶体增殖物激活受体α/肉毒碱棕榈酰基转移酶-1(PI3K/Akt/PPARα/CPT-1)信号通路探讨桑叶水提物对2型糖尿病(T2DM)大鼠肝脏糖脂代谢紊乱的作用及其机制。方法:高脂喂养联合腹腔注射链脲佐菌素(STZ)方法制备T2DM模型,按血糖、体质量将造模成功大鼠随机分为模型组、二甲双胍(0.2 g·kg^(-1))组和桑叶水提物(含生药4.0 g·kg^(-1))组,连续给药8周,每周相同时间测定空腹血糖。苏木素-伊红(HE)染色、油红O染色观察肝脏组织形态学和脂肪变化;生化分析法测定血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨基酸氨基转移酶(AST)水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肝脏磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、PI3K、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、Akt、PPAR-α、CPT-1蛋白表达。结果:给药8周后,与正常组比较,模型组大鼠血糖显著升高(P<0.01);与模型组比较,桑叶水提物组大鼠血糖显著降低(P<0.01)。HE染色显示,正常组大鼠肝组织结构完整,肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列;模型组大鼠肝细胞损伤明显;与模型组比较,桑叶水提物组大鼠空泡变性程度显著降低,未见小胆管增生等病变。油红O染色显示,正常组大鼠肝细胞无明显脂肪变性、坏死,肝细胞几乎无脂滴;模型组大鼠肝内脂滴较正常组明显增加;桑叶给药可明显减少大鼠肝脏脂滴。模型组大鼠TC、TG、LDL-C、AST、ALT水平较正常组显著升高(P<0.01);桑叶水提物组大鼠TC、TG、LDL-C、AST、ALT水平较模型组明显降低(P<0.05,P<0.01)。Western blot结果显示,与正常组比较,模型组大鼠p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、PPARα和CPT-1的蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,桑叶水提物能明显增加p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、PPARα和CPT-1的蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论:桑叶水提物可改善T2DM大鼠肝脏糖代谢紊乱,降糖机制可能与调控PI3K/Akt/PPAR-α/CPT-1信号通路有关。

基于PTEN/PI3K/Akt信号通路探讨参芪抑瘤方联合顺铂对H22肝癌荷瘤小鼠的抑瘤作用

目的:探讨参芪抑瘤方联合顺铂在磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路中对H22肝癌荷瘤小鼠的抑瘤作用。方法:建立H22肝癌荷瘤小鼠模型,随机分为模型组、顺铂组、参芪抑瘤方高、中、低剂量联合顺铂组,10只/组,另随机筛选10只健康小鼠作为正常组;干预组小鼠灌胃给予参芪抑瘤方高、中、低剂量(54.06、27.03、13.515 g·kg^(-1)·d^(-1)),腹腔注射用顺铂(2.5 mg·kg^(-1)),1周2次,正常组、模型组给予生理盐水,连续治疗13 d后处死小鼠计算抑瘤率;苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠瘤体病理形态学变化;酶联免疫吸附测定法(ELISA)和免疫荧光法检测小鼠瘤组织中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(p21),细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B(p27)含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测瘤组织中PTEN、PI3K、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白含量。结果:与模型组比较,顺铂组和参芪抑瘤方高、中、低剂量联合顺铂组移植瘤瘤质量明显降低(P<0.05),参芪抑瘤方高剂量联合顺铂组抑瘤作用更明显;各组肿瘤组织中出现不同程度的坏死,参芪抑瘤方高剂量联合顺铂组最为明显。与模型组比较,顺铂联合参芪抑瘤方高、中、低剂量及顺铂组p21、p27、PTEN表达均明显升高(P<0.05);PI3K、p-Akt蛋白相对表达量降低(P<0.05),其中参芪抑瘤方高剂量联合顺铂组最为明显。结论:参芪抑瘤方可能通过调控PTEN/PI3K/Akt信号通路中关键分子表达,从而上调下游抑增殖蛋白p21、p27蛋白表达,进而发挥对H22肝癌小鼠的显著抑瘤作用,并且增强化疗效果。

中药单体调控PI3K/Akt信号通路抑制膀胱癌的研究进展

膀胱癌是我国泌尿系发病率最高的恶性肿瘤,西医治疗疗效显著,包括长期、定期的内窥镜检查,膀胱内化疗,免疫治疗和膀胱根治术等,但其高复发率仍困扰着医患双方。在膀胱癌的形成、发展过程伴随着许多经典信号通路的参与,其中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路是重要的调控通路之一。中医药治疗是有效的的补充治疗方法,现代药理研究表明中药及其单体成分在肿瘤治疗中可以减轻患者的不适症状、延长患者生存时间以及提高生活质量。通过检索近10年的文献发现,多种天然药物来源的黄酮类、萜类、多糖、藤黄酸类、联苄类和生物碱类的研究证实了许多单体成分均具有抗膀胱癌活性,中药单体可以通过调控PI3K/Akt信号通路对膀胱癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移、逆转耐药和自噬等过程发挥着不可或缺的作用。尽管部分中药单体在膀胱癌治疗方面的一些作用靶点及潜在机制已经明确,但这些中药单体的相关研究也仅停留在体外细胞实验及动物体内研究层面,研究者们面临着“中药单体转化于临床应用中”这一巨大挑战。基于国内外目前的研究,笔者归纳总结了近年来中药单体通过调控PI3K/Akt信号通路干预膀胱癌的研究进展,希望为膀胱癌药物治疗研究开拓新的思路,同时也为后续更深入的机制研究提供有益参考。

基于网络药理学及分子对接技术探究北沙参-玉竹治疗卵巢早衰的作用机制

目的基于网络药理学及分子对接技术,预测清肺养阴药对北沙参-玉竹改善卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)的关键靶点及作用通路,并通过动物实验验证有关结果。方法通过人类在线孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)、Drugbank、GeneCards数据库收集卵巢早衰相关靶点;通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Database and Analysis Platform,TCMSP)筛选北沙参-玉竹药对的有效活性成分,SwisstargetPredicition数据库中预测作用靶点。利用STRING平台对药对-卵巢早衰交集靶点进行蛋白质相互作用分析,根据拓扑参数筛选关键靶点。基于Metascape数据库、Cluego插件进行基因本体(Gene Ontology,GO)分析和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号通路富集分析。通过Autodock vina 1.1.2软件对关键靶点和有效活性成分进行半柔性对接。使用雷公藤多苷片诱导小鼠卵巢早衰疾病模型进行实验验证。结果得到药对16个有效活性成分,协同作用于38个靶点,参与血管内皮细胞迁移、磷脂酶活性的正调控,自噬、细胞凋亡的负调控,以及肽基-丝氨酸磷酸化的调节、雌激素代谢等44个生物学过程,涉及PI3K/Akt/mTOR、Foxo、HIF-1、TNF、IL-17、MAPK、NF-κB等51条信号通路。分子对接结果显示关键靶点与有效成分间均有较强的结合能力。动物实验结果证明,北沙参-玉竹可通过上调蛋白激酶B(Akt)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),下调磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)、核转录因子-κB(NF-κB)的表达改善卵巢功能(P<0.01),验证了网络药理学部分预测结果。结论北沙参-玉竹可通过上调Akt、PI3K,下调PTEN、NF-κB的表达改善卵巢功能,初步证实北沙参-玉竹治疗卵巢早衰的部分作用靶点,为其临床应用及作用机制研究提供了思路和依据。

基于UPLC-Q-TOF-MS和网络药理学的柴胡醋制前后抗抑郁质量标志物分析

目的:基于超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱法(UPLC-Q-TOF-MS)、多元统计分析和网络药理学方法确定生柴胡、醋柴胡抗抑郁作用的质量标志物(Q-Marker)及其作用机制。方法:通过UPLC-Q-TOF-MS获得生柴胡、醋柴胡饮片的化学物质基础,采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)筛选柴胡醋制前后发生显著变化的成分作为候选Q-Marker,运用网络药理学方法构建柴胡抗抑郁的“疾病-药物-成分-靶点”网络,确定生柴胡、醋柴胡抗抑郁Q-Marker。将大鼠随机分为空白组、模型组、氟西汀组(2.67 mg·kg^(-1))和柴胡总皂苷组(0.72 mg·kg^(-1)),除空白组外,其余各组大鼠均采用慢性温和不可预知性应激法(CUMS)造模,造模开始3周后灌胃给药,各给药组给予相应剂量药物,1次/d,连续4周,空白组及模型组给予10 m L·kg^(-1)生理盐水,于造模前1天、造模21 d和给药28 d对各组大鼠进行体质量称量、糖水偏好实验和旷场实验;于给药28 d后,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组大鼠海马组织磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、叉头框转录因子O3a(Fox O3a)、β-连环蛋白(β-catenin)m RNA表达水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组大鼠海马组织PI3K、Akt、m TOR、Fox O3a蛋白表达水平。结果:共19种成分在柴胡醋制前后发生明显变化,通过S-plot差异标志物筛选确定柴胡皂苷A、柴胡皂苷B1、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷C、柴胡皂苷D等9种成分为柴胡饮片的潜在Q-Marker,结合“疾病-药物-成分-靶点”网络,确定柴胡皂苷A、柴胡皂苷B1、柴胡皂苷B2、柴胡皂苷D作为生柴胡、醋柴胡抗抑郁的Q-Marker。药效结果显示,给药28 d后,与空白组比较,模型组、氟西汀组和柴胡总皂苷组大鼠的体质量、糖水偏好指数及旷场实验总分均显著降低(P<0.01);与模型组比较,柴胡总皂苷组大鼠的体质量、糖水偏好指数及旷场实验总分均显著增加(P<0.01)。与空白组比较,模型组大鼠海马组织PI3K、Akt、m TOR、β-catenin m RNA表达水平明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05),GSK-3β、Fox O3a m RNA表达水平明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,柴胡总皂苷组大鼠海马PI3K、Akt、m TOR、β-catenin m RNA表达水平明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05),GSK-3β、Fox O3a m RNA表达水平明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较,模型组大鼠海马组织Akt、m TOR蛋白表达水平显著减少(P<0.01),PI3K和Fox O3a的蛋白表达水平显著增加(P<0.01);与模型组比较,柴胡总皂苷组大鼠海马组织Akt蛋白表达水平显著增加,差异具有统计学意义(P<0.01),m TOR表达水平增加,但差异无统计学意义,PI3K和Fox O3a的蛋白表达水平显著减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:柴胡醋制前后的化学成分发生较大变化,经物质基础、药效学、网络药理学及信号通路研究确定生柴胡、醋柴胡抗抑郁Q-Marker,为柴胡饮片质量控制、药效物质基础及炮制机制的进一步研究提供参考。

基于蛋白质组学分析参芎葡萄糖注射液拮抗H_(2)O_(2)诱导H9c2细胞氧化损伤的作用机制

目的:利用串联质谱标记(TMT)定量蛋白质组学技术探究参芎葡萄糖注射液(SGI)拮抗过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导H9c2细胞氧化损伤的作用机制。方法:体外培养H9c2细胞,H_(2)O_(2)诱导H9c2细胞建立氧化损伤模型,利用细胞增殖与毒性检测法(MTS)检测细胞存活率,高效液相色谱法(HPLC)进行肽段分级,超高效液相色谱-质谱联用技术检测H9c2细胞的蛋白表达,使用MaxQuant(v1.5.2.8)进行数据检索,高分辨质谱定量分析筛选差异表达蛋白,通过基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库对差异表达蛋白进行生物信息学分析,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞内脂质结合蛋白2(Plin2)和原肌球蛋白1(Tpm1)的蛋白表达水平进行验证。结果:通过谱图解析鉴定有48608个特异性肽段,5903个可定量蛋白。与模型组比较,SGI组有82个差异表达的蛋白,其中有22个蛋白上调,60个蛋白下调。GO分析结果显示,差异表达蛋白主要参与程序性细胞死亡调节、细胞增殖调控、心血管系统发育和细胞迁移等生物进程。KEGG分析结果表明,这些蛋白与过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR),黏着斑和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt),Ras相关蛋白1(Rap1)等通路有关。Western blot结果显示,与模型组比较,SGI能显著增加Plin2蛋白表达水平,显著降低Tpm1蛋白表达水平(P<0.01),与蛋白质组学结果一致。结论:提示SGI可能通过调控PPAR,黏着斑,PI3K/Akt和Rap1等通路抑制细胞凋亡,从而拮抗H_(2)O_(2)诱导细胞氧化损伤,但需要后续实验进一步验证研究。

黄连解毒汤对脂多糖诱导的小鼠急性肾损伤治疗作用及机制

目的研究黄连解毒汤对脂多糖诱导的小鼠急性肾损伤的作用及作用机制。方法雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组和黄连解毒汤低、中、高剂量(50、100、150 mg/kg)组,每组8只。连续ig黄连解毒汤3 d,末次给药2 h后,ip脂多糖(10 mg/kg)建立急性肾损伤模型。检测血清中肌酐和尿素氮水平;苏木素-伊红(HE)和高碘酸-席夫(PAS)染色检测肾组织病理变化;免疫组化法检测肾组织B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)表达;TUNEL染色检测肾组织细胞凋亡情况;Western blotting检测肾组织磷酸酯酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、p-PI3K和p-Akt蛋白表达。结果黄连解毒汤明显降低急性肾损伤小鼠血清中尿素氮及肌酐水平(P<0.01、0.001),改善肾脏组织病理变化,抑制肾组织细胞凋亡,上调肾组织PI3K、Akt蛋白表达(P<0.05),下调PTEN、p-PI3K、p-Akt蛋白表达(P<0.05)。结论黄连解毒汤通过调控PTEN/PI3K/Akt通路抑制细胞凋亡,进而缓解急性肾损伤。

芪玉三龙方抑制A549肺癌细胞对miRNA21“成瘾”的机制

目的:探讨芪玉三龙方(QYSL)抑制A549肺癌细胞对微小RNA21(miRNA21)"成瘾"的分子机制。方法:选择人A549肺癌细胞,常规传代培养,分别设置为空白组,空白血清组,含药血清组,干扰小RNA(siRNA)组。制备QYSL含药血清,以前期研究筛选的最佳药物浓度和作用时间进行干预。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测及实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)miRNA21及其靶向信号通路第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)相关分子的蛋白及mRNA的表达。结果:与空白血清组比较,含药血清组和siRNA组的miRNA21 mRNA表达显著降低,PTEN mRNA的表达显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。与空白血清组比较,含药血清组和siRNA组的PI3K,雷帕霉素靶蛋白(mTOR)mRNA表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01),但含药血清组蛋白激酶B(Akt)mRNA的表达无明显差异。与空白血清组比较,含药血清组和siRNA组的PTEN蛋白表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05);含药血清组磷酸化蛋白激酶B(p-Akt),磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)蛋白表达明显降低(P<0.05),总蛋白Akt,mTOR表达无明显降低,PI3K蛋白的表达降低,但差异无统计学意义。结论:QYSL可抑制miRNA21的转录,使PTEN表达有所上升,下调PI3K/Akt/mTOR信号通路关键分子表达,从而温和抑制肺癌细胞对致癌基因的"成瘾"现象,阻断肺癌细胞增殖。