磷酸酶张力蛋白同源物基因/磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路在肝纤维化发生及治疗中的作用研究进展

肝纤维化是最常见的肝脏病理变化,是慢性肝损伤发展为肝硬化或肝癌的重要过渡阶段,有效控制肝纤维化是防治晚期肝病的主要途径。第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因/磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PTEN/PI3K/AKT)信号通路能够有效调控肝纤维化进程,是肝纤维化发生的重要分子机制,也是防治肝纤维化的重要调控靶点。本文对PTEN/PI3K/AKT信号通路在肝纤维化中的作用机制及以该通路为靶点的抗肝纤维化药物研究进行综述。

脑胶质瘤中磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B及同源磷酸酶-张力蛋白表达水平

目的探讨PI3K、AKT、PTEN在脑胶质瘤中的表达。方法选择2017年1~12月在我院及华山医院手术治疗的脑胶质瘤患者66例的病理标本进行分析,另选择50例患者的正常脑组织病理标本为参照。应用免疫组化方法检测磷脂酰肌醇3-激酶、蛋白激酶B及同源磷酸酶-张力蛋白表达,比较脑胶质瘤组织中以及正常脑组织中三者的表达水平,分析脑胶质瘤组织中三者阳性表达的相关性。结果 PI3K及AKT在正常脑组织的阳性表达率显著低于低级别脑胶质瘤及高级别脑胶质瘤,差异有统计学意义(P<0.05);低级别脑胶质瘤显著低于高级别脑胶质瘤,差异有统计学意义(P<0.05)。正常脑组织PTEN蛋白阳性率100.0%,显著高于低级别脑胶质瘤与高级别脑胶质瘤,差异有统计学意义(P<0.05);低级别脑胶质瘤显著高于高级别脑胶质瘤,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PI3K、AKT在脑胶质瘤中呈高表达,PTEN呈低表达,且与恶性程度有关。

磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸依赖的Rac交换因子2在肿瘤中的研究进展

磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸依赖的Rac交换因子2(PREX2)属于Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子家族成员,可通过与磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)相互结合抑制PTEN的活性,从而激活磷脂酰肌醇3-羟激酶(PI3K)信号通路,促进肿瘤细胞的增殖、转移及侵袭。已有研究表明,PREX2在黑色素瘤、胃癌、骨肉瘤、胶质瘤、肝细胞癌、肺癌及胰腺癌中过表达,PREX2在肿瘤的发生发展过程中具有重要作用,可能成为肿瘤诊断和靶向治疗的生物标志物。本文主要对PREX2在肿瘤中的研究进展作一综述。

miR-19b对冠心病大鼠血管内皮细胞损伤的影响及PTEN/PI3K/AKT信号通路的作用

目的探讨微小RNA(miR)-19b对冠心病大鼠血管内皮细胞损伤的影响及磷酸酶及张力蛋白同源物/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PTEN/PI3K/AKT)信号通路的作用。方法选取72只大鼠随机分为正常组、模型组、模拟对照物(NC)组、miR-19b组、miR-19b+质粒互补DNA(pcDNA)3.1组、miR-19b+PTEN组。采用高脂饲料+垂体后叶素建立冠心病模型,尾静脉注射miR-19b mimic、pcDNA3.1-PTEN慢病毒液构建miR-19b、PTEN过表达大鼠。采用荧光定量聚合酶链反应检测冠状动脉组织miR-19b和PTEN信使RNA(mRNA)水平,测定大鼠心功能,观察大鼠冠状动脉病理变化,检测心肌组织细胞凋亡情况、血管内皮功能、冠状动脉中PTEN/PI3K/AKT信号通路、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved Caspase)-3、cleaved Caspase-9水平。分离培养冠心病大鼠冠状动脉内皮细胞,根据转染方式分为野生型质粒(WT)+NC组、WT+miR-19b mimic组、突变型质粒(MUT)+NC组、MUT+miR-19b mimic组,采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-19b与PTEN的靶向关系。将冠心病大鼠冠状动脉内皮细胞分为正常细胞组、NC细胞组和miR-19b细胞组,检测PTEN mRNA和PTEN蛋白水平。结果miR-19b组左心室射血分数(LVEF)、miR-19b、血清血管内皮生长因子(VEGF)、一氧化氮(NO)、磷酸化磷脂酰肌醇-3激酶(p-PI3K)/PI3K蛋白、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)/AKT蛋白水平高于模型组,左心室收缩末期容积(LVESV)、舒张末期容积(LVEDV)、细胞凋亡率、cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9、PTEN mRNA、内皮素-1(ET-1)、PTEN蛋白水平低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-19b+PTEN组LVESV、LVEDV、细胞凋亡率、PTEN mRNA、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、ET-1、VEGF、PTEN蛋白水平高于miR-19b组,LVEF、NO、p-PI3K/PI3K蛋白和p-AKT/AKT蛋白水平低于miR-19b组,差异均有统计学意义(P<0.05)。模型组LVEF、miR-19b、VEGF、NO、p-PI3K/PI3K蛋白、p-AKT/AKT蛋白水平低于正常组,LVESV和LVEDV、细胞凋亡率、PTEN mRNA、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、ET-1、PTEN蛋白水平高于正常组,差异均有统计学意义(P<0.05)。与正常组比较,模型组大鼠冠状动脉内皮细胞排列紊乱,并伴有明显的水肿。与模型组比较,miR-19b组冠状动脉组织病理损伤明显减轻。WT+miR-19b mimic组细胞中荧光素酶相对活性低于WT+NC组、MUT+NC组、MUT+miR-19b mimic组,差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-19b mimic细胞组PTEN mRNA和PTEN蛋白水平低于正常细胞组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论miR-19b靶向抑制PTEN,激活PI3K/AKT信号通路,保护冠心病大鼠心功能和血管内皮功能,减少心肌细胞凋亡。

磷脂酰肌醇-4-磷酸酯代谢酶及抑制剂研究进展

目的了解磷脂酰肌醇-4-磷酸酯(PI4P)代谢酶及抑制剂的研究进展,为PI4P信号通路相关靶点药物的研发提供参考。方法对作用于PI4P的6种代谢酶的基本情况、对疾病的影响及典型抑制剂的应用进行总结,并分析现有研究中仍待解决的问题,探讨PI4P代谢酶及抑制剂作为相关疾病治疗靶点的可能性。结果PI4P是一种膜甘油磷脂,由磷脂酰肌醇(PtdIns)4位羟基磷酸化生成;是高尔基体膜的关键功能成分,在囊泡运输和信号传导中不可或缺。尽管对PI4P的生理作用已有深入研究,但对PI4P的代谢调控知之甚少。PI4P代谢酶在肿瘤方面的研究较多,发现磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)高表达与多种肿瘤的恶化有关,目前已有4种PI3K抑制剂作为抗肿瘤药物被批准上市。结论PI4P代谢酶除了能调控肿瘤的进展外,还参与炎症激活、病毒及疟疾感染、阿尔茨海默病等临床常见疾病的发生与发展,但相关研究多停留在基础实验阶段,相关抑制剂可能是治疗上述疾病的有效方法。

微RNA-181靶向磷酸酶张力蛋白基因调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶信号通路在高尿酸血症大鼠肾损伤中的作用

目的探讨微RNA(miRNA)-181靶向磷酸酶张力蛋白基因(PTEN)调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/Akt)信号通路在高尿酸血症大鼠肾损伤中的作用。方法选择雄性Wistar大鼠40只,随机分为对照组10只、模型组10只、阴性对照组10只和miRNA-181抑制组10只,检测大鼠血清尿酸、肌酐、尿素氮;采用苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察各组大鼠肾脏组织病理形态学改变;实时荧光定量(qRT)-PCR检测各组大鼠肾组织miRNA-181和PTEN、PI3K、Akt mRNA表达水平;蛋白质印迹法检测各组大鼠肾组织PTEN、PI3K、Akt、磷酸化(p)-Akt蛋白表达水平;双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-181与PTEN的靶向关系。多组间比较采用单因素方差分析,方差齐,进一步组间两两比较采用LSD-t检验;若方差不齐,进一步组间两两比较采用Tamhane′s T2检验;2组间比较采用独立样本t检验。结果与对照组尿酸(135±21)mmol/L、肌酐(27.8±2.1)μmol/L、尿素氮(6.8±0.5)μmol/L相比,模型组和阴性对照组大鼠尿酸[(213±28)mmol/L,(214±23)mmol/L;肌酐(49.2±2.3)μmol/L,(48.6±2.2)μmol/L;尿素氮(11.5±2.7)μmol/L,(11.7±2.5)μmol/L]含量显著升高(F尿酸=26.739,F肌酐=259.055,F尿素氮=12.921,均P<0.05);与阴性对照组相比,miRNA-181抑制组大鼠尿酸(169±21)mmol/L、肌酐(33.7±1.8)μmol/L、尿素氮(9.1±1.7)μmol/L含量降低(LSD-t尿酸=4.356,LSD-t肌酐=15.773,LSD-t尿素氮=2.858,均P<0.05)。模型组和阴性对照组大鼠肾组织miRNA-181表达水平(1.88±0.16、1.84±0.18)显著高于对照组(0.53±0.08)(F=193.554,P<0.05),而PTEN蛋白(0.18±0.02、0.16±0.02)和mRNA表达水平(0.48±0.08、0.44±0.07)均低于对照组(1.27±0.06、1.27±0.16)(F蛋白表达水平=515.116,FmRNA表达水平=141.470,均P<0.05);抑制miRNA-181后,大鼠肾组织肾组织miRNA-181表达水平(1.35±0.58)显著降低(LSD-t=10.341,P<0.05),PTEN蛋白(0.84±0.05)和mRNA表达水平(0.90±0.08)均升高(LSD-t蛋白表达水平=20.471,Tamhane′s T2 mRNA表达水平=13.881,均P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验分析结果显示,PTEN是miRNA-181的靶基因。与对照组(0.18±0.02、0.09±0.01、0.05±0.02、1.06±0.07、0.96±0.06)相比,模型组和阴性对照组大鼠肾组织PI3K(1.01±0.06、1.00±0.06)、Akt(0.90±0.05、0.95±0.04)、p-Akt蛋白表达水平(0.99±0.07、0.97±0.05)和PI3K(3.63±0.18、3.68±0.22)、Akt mRNA表达水平(2.38±0.05、2.34±0.12)均显著升高(FPI3K蛋白表达水平=169.979,FAkt蛋白表达水平=393.411,Fp-Akt蛋白表达水平=164.201,FPI3K mRNA表达水平=563.944,FAkt mRNA表达水平=141.470,均P<0.05);抑制miRNA-181表达后,大鼠肾组织PI3K(0.69±0.06)、Akt(0.42±0.03)、p-Akt蛋白表达水平(0.50±0.05)和PI3K(2.40±0.09)、Akt mRNA表达水平(1.40±0.12)均降低(LSD-tPI3K蛋白表达水平=7.432,LSD-tAkt蛋白表达水平=18.291,LSD-tp-Akt蛋白表达水平=9.595,Tamhane′s T2PI3K mRNA表达水平=17.070,Tamhane′s T2Akt mRNA表达水平=17.357,均P<0.05)。结论抑制miRNA-181表达,可靶向PTEN抑制PI3K/Akt信号通路保护高尿酸血症大鼠肾损伤。

微小RNA-486-5p通过调控缺氧诱导因子-1α/人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶A信号通路影响结肠癌的发生发展

目的探讨微小RNA-486-5p(miR-486-5p)通过调控缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶A(Akt)信号通路影响结肠癌的发生发展。方法脂质体Lipofectamine™3000将miR-486-5p模拟物NC(对照),miR-486-5p模拟物转入SW480结肠癌细胞中,细胞购自上海细胞库。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-486-5p表达,噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,Transwell实验检测细胞侵袭,蛋白质印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)、bcl-2相关蛋白X(bax)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、p27、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、HIF-1α、PTEN、PI3K及磷酸化Akt(p-Akt)蛋白表达。组间比较采用t检验进行分析。结果miR-486-5p模拟物组细胞miR-486-5p表达量(1.87±0.09比1.00±0.10,t=5.589,P<0.05)、细胞早期凋亡率[(15.48±0.97)%比(1.47±0.09)%,t=4.327,P<0.05],细胞晚期凋亡率[(27.46±1.54)%比(3.24±0.13)%,t=5.652,P<0.05],细胞周期G1期[(60.32±4.43)%比(24.08±1.96)%,t=4.578,P<0.05]、bax(0.96±0.08比0.18±0.01,t=5.373,P<0.05)、p27(0.86±0.06比0.32±0.01,t=5.762,P<0.05)及PTEN(1.64±0.09比0.46±0.02,t=4.874,P<0.05)蛋白表达量高于对照组,miR-486-5p模拟物组细胞活力(0.33±0.01比0.54±0.03,t=4.582,P<0.05)、细胞侵袭数目[(37.59±2.64)个比(179.93±6.96)个,t=4.147,P<0.05],bcl-2(0.21±0.01比1.04±0.09,t=5.287,P<0.05)、Cyclin D1(0.14±0.00比0.85±0.07,t=4.642,P<0.05)、MMP-9(0.28±0.02比0.84±0.06,t=4.643,P<0.05)、HIF-1α(0.45±0.03比1.53±0.09,t=5.562,P<0.05)、PI3K(0.38±0.01比1.78±0.10,t=5.468,P<0.05)及p-Akt(0.38±0.02比1.10±0.08,t=4.129,P<0.05)蛋白表达量低于对照组。结论上调miR-486-5p表达量可诱导结肠癌细胞SW480凋亡、抑制细胞侵袭、使细胞周期发生阻滞,可能与抑制HIF-1α/PTEN/PI3K/Akt信号通路有关。

中风活心软胶囊通过PPARγ受体上调STAT3磷酸化激活PI3K/AKT通路抑制脑缺血再灌注损伤内质网应激的作用机制研究

目的探讨中风活心软胶囊介导过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)受体上调信号传导转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)磷酸化诱导磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(BAKT serine/threonine kinase,AKT)信号通路参与脑缺血再灌注损伤内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激和神经保护的作用机制研究,阐明中风活心软胶囊对脑缺血后神经损伤修复的调控机制。方法选取30只SPF级雄性SD大鼠,随机分为对照组、模型组和治疗组,采用Zea Longa法建立右侧大脑中动脉缺血(middle cerebral artery ischemia,MCAI)大鼠模型,采用改良神经功能损伤评分(modified neurological severity score,mNSS)评估大鼠神经功能缺损情况,以mNSS评分2~18分为造模成功。仅治疗组给予中风活心软胶囊。Western blot法分别检测缺血半暗区皮质PPARγ受体蛋白、STAT3磷酸化蛋白、PI3K/AKT信号通路蛋白的表达,检测ER应激标记分子葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)及真核翻译起始因子2α激酶3(PKR-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)-激活转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)-C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein,CHOP)通路蛋白表达水平。结果模型组大鼠神经功能缺损情况,透射电镜观察缺血半暗区皮质神经元显著减少,提示右侧MCAI大鼠模型构建成功。模型组、治疗组mNSS评分均高于对照组,但治疗组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组大鼠缺血区PPARγ受体蛋白、STAT3磷酸化蛋白、PI3K及AKT蛋白表达均低于对照组与治疗组,差异有统计学意义(P<0.05);治疗组与对照组各指标比较差异无统计学意义。治疗组、模型组大鼠缺血区GRP78、PERK、ATF4和CHOP蛋白表达均高于对照组,但治疗组均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论中风活心软胶囊可显著提高脑缺血大鼠缺血半暗区皮质PPARγ受体蛋白、STAT3磷酸化蛋白、PI3K/AKT信号通路蛋白表达,其作用机制可能是通过介导PPARγ受体上调STAT3磷酸化诱导PI3K/AKT信号通路参与脑缺血再灌注损伤ER应激和神经保护,从而发挥脑保护效应。

miR-489-3p靶向PTEN/PI3K/Akt信号通路对膀胱癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

目的探讨微小RNA(miR)-489-3p靶向第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)/磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路对膀胱癌(BC)细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法2021年1-7月于河北北方学院附属第一医院进行细胞实验,利用火山图从癌症基因组图谱(TCGA-BLCA)数据库筛选BC差异表达miRNA。以110例BC患者的癌组织及其癌旁组织和购买的人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1及人BC细胞系5637、J82、T24为研究对象,采用实时荧光定量PCR测定miR-489-3p和PTEN mRNA的表达。根据miR-489-3p的相对表达量均值将BC患者分为低表达组(≤0.36)70例和高表达组(>0.36)40例,并分析miR-489-3p表达在BC患者不同临床病理特征中的变化。双荧光素酶实验验证miR-489-3p和PTEN的靶向关系。选择miR-489-3p表达最低的T24细胞进行转染实验,T24细胞随机分组为对照组、miR-NC(阴性对照)组、miR-489-3p mimics(模拟物)组、miR-489-3p mimics+pcDNA组、miR-489-3p mimics+pc-PTEN组。MTT和克隆形成实验、Transwell实验、流式细胞术分别检测细胞增殖、侵袭和凋亡;Western-blot检测PTEN、PI3K、Akt蛋白表达。结果通过火山图筛选出BC组织中显著下调的miR-489-3p。BC癌组织中miR-489-3p表达低于癌旁组织,PTEN mRNA表达高于癌旁组织(t=186.168,510.107,P均<0.001);BC细胞系miR-489-3p表达低于SV-HUC-1细胞,PTEN mRNA表达高于SV-HUC-1细胞(F=883.826,807.220,P均<0.001)。miR-489-3p低表达组患者TNM分期T_(3~4)、有淋巴结转移、肿瘤低分化比例高于高表达组(P<0.05)。双荧光素酶实验显示,miR-489-3p靶向负调控PTEN表达。miR-489-3p mimics组凋亡率及PI3K、Akt蛋白表达水平高于miR-NC组,PTEN蛋白表达水平、OD值(24 h、48 h、72 h)、克隆数目和细胞侵袭数低于miR-NC组(P均<0.01);miR-489-3p mimics+pc-PTEN组凋亡率及PI3K、Akt蛋白表达水平低于miR-489-3p mimics组,PTEN蛋白表达水平、OD值(24 h、48 h、72 h)、克隆数目和细胞侵袭数高于miR-489-3p mimics组(P<0.01)。结论miR-489-3p可能通过靶向下调PTEN表达,激活PI3K/Akt信号通路,进而抑制BC细胞增殖、侵袭,促进凋亡。

直肠癌中磷酸酶和张力蛋白同源基因及磷脂酰肌醇3激酶的表达与临床病理特征的相关性

目的探讨磷酸酶和张力蛋白同源基因（PTEN）及磷脂酰肌醇3激酶（P13K）在直肠癌中的表达与临床病理特征的相关性。方法应用免疫组织化学染色MaxVisionTM法检测60例直肠癌、30例直肠腺瘤和10例正常直肠黏膜组织标本中PTEN及P13K的表达情况，并对其表达水平与直肠癌临床病理特征之间的关系进行相关性分析。结果直肠癌组织PTEN阳性表达率明显低于正常直肠黏膜组织和直肠腺瘤组织[43．3％（26／60）比100．0％（10／10）和93．3％（28／30），P〈0．05]，直肠癌组织P13K阳性表达率明显高于正常直肠黏膜组织和直肠腺瘤组织[75．0％（45／60）比30．O％（3／10）和33．3％（10／30），P〈0．05]。PTEN及P13K在直肠癌组织中的表达水平与患者术前癌胚抗原、分化程度、TNM分期、淋巴结转移和远处转移有关（P〈0．01或〈0．05），而与患者年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤形态无明显相关性（P〉0．05）。相关分析结果表明，P13K与PTEN阳性表达呈显著负相关（r=-0．269，P=0．023）。结论直肠癌中P13K高表达及PTEN低表达，与直肠癌的侵袭和转移密切相关，监测两者的表达对判定直肠癌生物学行为有一定的价值。

PP2C蛋白磷酸酶调控的细胞信号通路研究进展

2C类蛋白磷酸酶是蛋白磷酸酶家族的重要成员,可以对丝/苏氨酸残基特异性脱磷酸。近来研究表明,2C类蛋白磷酸酶控制着大量关键的细胞功能,如增殖、细胞周期阻滞、衰老和细胞程序性死亡、凋亡和自噬等,因而在介导机体免疫反应、衰老、神经发育及肿瘤发生发展中发挥重要的生物学作用。总结PP2C基因各亚型参与介导的重要细胞信号通路,如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)、转化生长因子-β(TGF-β)/Smads、核转录因子-κB(NF-κB)及DNA损伤应答通路,以期为阐明上述生理病理过程的分子基础和调控机制提供新的思路。

miR-214靶向PTEN介导PI3KAKT信号通路对糖尿病肾病大鼠的保护机制

目的探讨微小RNA(miR-214)靶向磷酸酶与张力蛋白同源物(PTEN)介导磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路减轻糖尿病肾病(DN)大鼠的氧化应激和肾间质纤维化的作用和机制。方法将40只SD雄性大鼠分为对照组(control组)、模型组(DN组)、miR-214阴性对照组(DN+miR-NC组)和miR-214模拟物组(DN+miR-214 mimics组),每组10只;qRT-PCR检测各组大鼠肾组织中miR-214的表达;电子天平称量各组大鼠体质量和肾质量,计算肾指数;血糖仪测定各组大鼠的空腹血糖(FPG);双缩脲法测定各组大鼠24 h尿蛋白(UP)水平;全自动生化分析仪检测各组大鼠血清肌酐(Scr)和血清尿素氮(BUN)的水平;HE染色观察各组大鼠肾组织病理变化;Masson染色观察各组大鼠肾组织间质纤维化;ELISA检测各组大鼠血清中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的表达;免疫组织化学法检测各组大鼠肾组织中转化生长因子β1(TGF-β1)的表达;生物信息学工具预测靶基因;双荧光素酶报告基因检测基因或蛋白之间的相互作用;Western blot检测各组大鼠肾组织中PTEN、p-PI3K、p-AKT和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)的表达。结果miR-214在DN大鼠肾组织中呈低表达,在DN+miR-214 mimics组大鼠肾组织中表达显著上调(均P<0.001);miR-214 mimics使大鼠的体质量升高,肾指数、FPG、UP、Scr及BUN水平下调(均P<0.05);DN+miR-214 mimics组大鼠肾组织中肾间质中的炎性细胞浸润减少,胶原纤维沉积减少(P<0.01);miR-214 mimics使大鼠血清中MDA的水平降低,SOD、GSH、GSH-PX的水平升高(均P<0.05),大鼠肾组织中TGF-β1的表达水平下降(P<0.05);miR-214与PTEN存在靶向关系;miR-214 mimics使大鼠肾组织中PTEN蛋白表达下调,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达上调(均P<0.05)。结论miR-214在DN大鼠肾组织中低表达,过表达miR-214对DN大鼠的肾组织有保护作用,可能与降低肾组织的氧化应激水平、TGF-β1蛋白表达和抑制PI3K/AKT通路激活有关。

酰基甘油激酶通过影响PTEN/PI3K/Akt/Gsk3β信号通路调控血小板活化

目的:探究酰基甘油激酶(AGK)在血小板活化中的作用及可能的调控机制。方法:分别提取野生型小鼠(WT)和AgkG126E点突变(AGK激酶活性丧失)小鼠(PM)的血小板。将等体积、等浓度的WT或PM小鼠的血小板放入聚集仪,分别利用3种刺激剂(α-Thrombin、ADP、U46619)刺激,检测每种刺激剂作用下相应的血小板聚集水平;每管聚集曲线达到最大稳定值后,加入等体积的ATP荧光检测剂,检测相应血小板活化过程中释放的ATP水平。分别在静息态WT或PM小鼠血小板(不加α-Thrombin刺激)、活化态WT或PM小鼠血小板(加入α-Thrombin刺激)中加入等量荧光偶联的纤维蛋白原(Fg),利用流式细胞仪检测血小板的Fg结合水平。Western blot法分别检测静息态(不加刺激剂)和活化态(加入α-Thrombin、ADP、U46619刺激)WT或PM小鼠血小板中关键信号通路蛋白的磷酸化水平。结果:在刺激剂作用于血小板后,PM小鼠血小板的聚集程度、ATP释放水平及Fg结合能力均明显低于WT小鼠的血小板(P均<0.01)。与WT小鼠相比,PM小鼠的血小板在活化过程中张力蛋白同源性磷酸酶(PTEN)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt-Thr308)和糖原合成激酶3β(Gsk3β-Ser9)的磷酸化水平均明显降低(P均<0.01)。结论:酰基甘油激酶可能通过影响PTEN/PI3K/Akt/Gsk3β信号通路,参与调控血小板的活化。

金丝桃苷调控胰岛素受体底物1/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路对糖尿病肾病大鼠肾组织损伤的保护作用

目的 探索金丝桃苷对糖尿病肾病(DN)大鼠胰岛素受体底物1(IRS-1)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响,及其对肾组织损伤的保护作用。方法 用腹腔注射链脲佐菌素的方法建立DN大鼠模型,并随机分为模型组、对照组和低、中、高剂量实验组,每组12只;另取12只SD大鼠设为假手术组。低、中、高剂量实验组按10 mL·kg^(-1)的剂量分别灌胃给予12.5,25.0和50.0 g·kg^(-1)金丝桃苷,qd;对照组按10 mL·kg^(-1)的剂量灌胃给予7.0 mg·mL^(-1)二甲双胍溶液,qd;假手术组与模型组大鼠均灌胃给予等量0.9%NaCl。6组大鼠连续给药21 d。检测大鼠血糖、尿微量白蛋白(UMA)水平,用蛋白质印迹法检测肾组织IRS-1/PI3K/Akt通路蛋白的表达水平。结果 低、高剂量实验组和对照组、模型组、假手术组的血糖分别为(21.04±2.65),(5.86±0.82),(5.72±0.93),(28.23±3.17)和(5.12±0.73)mmol·L^(-1),UMA分别为(100.76±20.49),(10.02±1.71),(9.97±1.78),(145.82±32.07)和(8.26±1.13)mmol·L^(-1),p-PI3K/PI3K值分别为0.32±0.05,0.97±0.17,0.96±0.16,0.10±0.02和0.99±0.19,p-Akt/Akt值分别为0.27±0.04,0.84±0.14,0.83±0.15,0.07±0.02和0.87±0.13,p-IRS-1/IRS-1值分别为0.76±0.15,0.18±0.05,0.17±0.04,1.02±0.23和0.12±0.02。低、高剂量实验组的上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 金丝桃苷可降低IRS-1磷酸化水平,激活PI3K/Akt通路,减轻DN大鼠肾组织病理损伤。

微小RNA-137调控乳腺癌细胞生物学行为的作用及机制研究

目的探讨微小RNAU(miRNA)-137通过抑制靶基因磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B (AKT)信号通路对乳腺癌细胞生物学行为的调控作用。方法采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测不同组织和细胞中miRNA-137的表达水平,Transwell实验检测MCF-7和MDA-MB-231细胞的侵袭能力。通过生物信息学软件预测miRNA-137与靶基因的相互作用并进行验证,检测不同细胞和组织中PTEN mRNA及蛋白的表达水平,以及miRNA-137与PTEN通过PI3K/AKT通路对乳腺癌生物学行为的调控作用。结果乳腺癌组织中miRNA-137的表达水平明显高于癌旁正常组织(P<0.01)。发生远端转移乳腺癌组织中miRNA-137的表达水平明显高于未发生远端转移的乳腺癌组织(P <0.01)。MCF-7、MDA-MB-231细胞中miRNA-137的表达水平均明显高于MCF-10A细胞(P<0.01)。乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭细胞数目明显高于MCF-7细胞(P <0.01)。生物信息学软件预测发现,PTEN mRNA 3TUTR的碱基存在与miRNA-137可能互补结合的位点。乳腺癌组织中PTEN mRNA及蛋白的表达水平均明显低于癌旁正常组织(P <0.01)。miRNA-137mimics转染组的OD值、S期细胞比值、侵袭细胞数目、迁移细胞数目均高于miRNA-NC组,细胞迁移距离长于miRNA-NC组,而miRNA-137 mimics+PTEN转染组的上述各指标均低于miRNA-137 mimics转染组(P <0.05)。miRNA-137 mimics转染组中PTEN、p-AKT 308、p-AKT 473蛋白的表达水平均高于miRNA-NC组(P <0.05);miRNA-137 mimics+PTEN转染组中PTEN、p-AKT 308、p-AKT 473蛋白的表达水平均低于miRNA-137 mimics转染组(P <0.05)。结论 miRNA-137通过抑制PTEN调节PI3K/AKT信号通路促进乳腺癌生物学行为可能会成为乳腺癌诊断及治疗新靶点。

微小RNA-1269a靶向调控PTEN对肝癌细胞迁移、侵袭和PI3K/Akt信号通路的影响

目的探讨微小RNA-1269a(miR-1269a)对肝癌细胞侵袭、迁移和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的影响及可能机制。方法采用Ualcan数据库分析肝癌组织中miR-1269a的水平;采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测人正常肝细胞HL-7702和人肝癌细胞(Huh-7、HCCLM6、Hep3B和SMMC-7721)的miR-1269a水平。将SMMC-7721细胞分为4组:空白对照组、阴性对照组、抑制物(Inhibitor)组(转染miR-1269a inhibitor)和Inhibitor+LY294002组(转染miR-1269a inhibitor+PI3K抑制剂LY294002),MTT法、划痕实验和Transwell小室实验检测细胞增殖活力、划痕愈合率和穿膜细胞数,Western blotting检测PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、Akt1和磷酸化Akt1(p-Akt1)水平,在线预测miR-1269a与靶基因第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白(PTEN)的潜在结合序列并经荧光素酶报告基因实验验证两者的靶向关系。结果369例原发性肝癌组织的miR-1269a水平高于49例正常肝组织(P<0.05)。肝癌细胞的miR-1269a水平均高于HL-7702细胞(P<0.05)。与空白对照组和阴性对照组相比,Inhibitor组的增殖活力减弱且p-PI3K和p-Akt1水平降低(P<0.05);空白对照组、阴性对照组、Inhibitor组和Inhibitor+LY294002组的划痕愈合率依次为(70.235±3.484)%、(75.269±6.245)%、(44.376±3.174)%和(21.812±0.968)%,穿膜细胞数依次为(192.453±10.324)、(201.288±5.873)、(129.197±8.485)和(47.839±9.037)个,Inhibitor组的划痕愈合率和穿膜细胞数均少于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。空白对照组和阴性对照组上述指标的差异无统计学意义(P>0.05),而Inhibitor+LY294002组的上述指标均低于Inhibitor组(P<0.05)。PTEN野生型载体和miR-1269a模拟物共转染细胞的荧光素酶活性较PTEN突变型载体和miR-1269a模拟物共转染细胞降低(P<0.05)。结论miR-1269a在肝癌组织和细胞中高表达,且可能通过靶向PTEN来激活PI3K/Akt信号通路来促进肝癌细胞的迁移和侵袭,miR-1269a可能通过调控PI3K/Akt/PTEN轴来发挥促癌作用。

miR-30a对卵巢癌细胞PTEN/PI3K/AKT/mTOR自噬通路及顺铂耐药性的影响

目的:探究miR-30a对人卵巢癌SKOV3细胞自噬及顺铂耐药性的影响,并初步研究其作用机制。方法:体外培养人卵巢癌SKOV3细胞和人卵巢癌细胞(耐药)细胞(SKOV3/DDP);将SKOV3/DDP细胞随机分为对照组、miR-30a阴性对照(NC)组和miR-30a模拟(mimics)组,SKOV3细胞作为正常组。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组细胞miR-30a表达情况;CCK-8法检测各组细胞顺铂耐药性;Annexin V-FITC/PI法检测各组细胞凋亡情况;蛋白印迹分析法检测各组细胞微管相关蛋白轻链3 I/II(LC3I/II)、p62、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)表达情况;双荧光素酶报告基因检测系统验证miR-30a与PTEN的靶向关系。结果:与对照组和miR-30a NC组相比,miR-30a mimics组SKOV3/DDP细胞miR-30a表达水平、凋亡率、p62、p-PI3K、p-AKT及p-mTOR水平显著升高(P<0.05),IC 50值、LC3II、PTEN蛋白表达水平及LC3II/LC3I比值显著降低(P<0.05);与正常组相比,对照组SKOV3/DDP细胞上述各指标变化趋势完全相反;mirbase数据库预测显示,miR-30a与PTEN mRNA 3'UTR区有结合位点,与PTEN-3'UTR-WT+miR-30a NC组比较,PTEN-3'UTR-WT+miR-30a inhibitor组荧光素酶活性降低(P<0.05)。结论:miR-30a可能通过靶向抑制PTEN表达,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路调控人卵巢癌细胞自噬,降低卵巢癌细胞的顺铂耐药性。

miR-221靶向PTEN介导PI3K/AKT信号通路调节细胞自噬参与帕金森病的机制研究

目的探讨微小RNA-221(miR-221)靶向磷酸脂酶与张力蛋白同源物基因(PTEN)介导磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB也称AKT)信号通路调节细胞自噬参与帕金森病(PD)进展的机制研究。方法采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)作用于肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞建立PD模型;转染miR-221模拟物或抑制剂来调节miR-221的表达;细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测PC12细胞存活率;电镜观察自噬体;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析确定miR-221的表达;蛋白印迹法(Western blot)检测自噬蛋白标志物(LC3-II)和PTEN/PI3K/AKT信号蛋白的表达。结果在PD细胞模型中,miR-221的表达水平下降(P<0.01),LC3-II蛋白表达水平上调(P<0.01),自噬体增加;与6-OHDA组相比,过表达miR-221降低了LC3-II蛋白的表达水平(P<0.05),并增加了细胞存活率(P<0.001),而沉默miR-221增加了LC3-II蛋白的表达水平(P<0.05),并降低了细胞存活率(P<0.001);此外,与6-OHDA组相比,过表达miR-221降低了PTEN蛋白的表达(P<0.01),增加了PI3K蛋白的表达(P<0.001)以及AKT蛋白磷酸化程度(P<0.01),而沉默miR-221增加了PTEN蛋白的表达(P<0.01),降低了PI3K蛋白的表达(P<0.05)以及AKT蛋白磷酸化程度(P<0.05)。结论 miR-221在6-OHDA诱导的PC12细胞中表达降低,上调miR-221可靶向PTEN介导PI3K/AKT信号通路来调节自噬,从而发挥对PD细胞模型的保护作用。

苦酸通调方对HepG2细胞胰岛素抵抗模型中IRS-1、PI3K、Akt蛋白表达的影响

目的观察苦酸通调方对HepG2细胞胰岛素抵抗(IR)模型中内胰岛素受体底物(IRS)-1、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)信号分子的影响并探讨相关机制。方法通过0.25 mmol/L棕榈酸联合30 mmol/L高糖孵育24 h诱导HepG2 IR细胞模型,予以不同浓度的苦酸通调方(50,100,200μg/ml)。葡萄糖试剂盒检测细胞培养液上清葡萄糖含量,肝糖原试剂盒测定HepG2细胞内肝糖原含量,蛋白免疫印迹法(Western印迹)检测细胞内IRS-1、PI3K、Akt的蛋白表达。结果与模型组相比,苦酸通调方干预后,呈剂量依赖性增加IR HepG2细胞的葡萄糖消耗量及细胞内肝糖原含量(P<0.05),上调IRS-1、PI3K、Akt蛋白磷酸活化水平(P<0.05)。结论苦酸通调方改善2型糖尿病IR作用可能与影响IRS-1、PI3K、Akt蛋白表达相关。

微小RNA-214靶向调控PTEN对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化的影响及机制研究

目的:探讨微小RNA-214(miR-214)靶向调控第10号染色体丢失性磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化的影响及机制。方法:将成骨细胞MC3T3-E1分为miR-124 mimic组(转染miR-124 mimic)、miR-124 NC组(转染miR-124 NC)、pcDNA3.1-PTEN组(转染pcDNA3.1-PTEN)、miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN组(转染miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN)。采用在线生信预测miR-124和PTEN靶向结合位点,通过双荧光素酶报告基因进行验证。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测细胞miR-124和PTEN mRNA表达。采用CCK-8法检测细胞增殖。采用碱性磷酸酶活性测定检测细胞分化能力。采用茜素红染色和骨钙素水平测定检测细胞的矿化。采用Werstern blot检测PTEN、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、骨桥蛋白(OPN)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)水平。结果:与miR-124 NC组比较,miR-124 mimic组野生型PTEN的荧光素酶活性降低(均P<0.05)。与miR-124 NC组比较,miR-124 mimic组miR-124及p-PI3K、p-AKT蛋白表达升高,PTEN mRNA和蛋白、细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、ColⅠ和OPN蛋白、细胞矿化率和骨钙素水平降低,而pcDNA3.1-PTEN组则相反(均P<0.05)。与miR-124 mimic组比较,miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN组p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低,PTEN mRNA和蛋白、细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、ColⅠ和OPN蛋白、细胞矿化率和骨钙素水平升高(均P<0.05)。结论:miR-214通过靶向下调PTEN蛋白表达激活PI3K/AKT信号通路,从而调控成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化。