丙酮酸脱氢酶磷酸酶催化亚基1在恶性肿瘤中作用机制的研究进展

近年来,恶性肿瘤的发病率及病死率呈逐年上升趋势,发病年龄趋于年轻化,因而对恶性肿瘤的早期预防、诊断和治疗已成为肿瘤临床及基础研究的热点。有研究表明,即使在供氧充足的条件下,肿瘤细胞仍需要从内环境中摄取远高于正常细胞所需的葡萄糖以产生能量,却很少通过氧化磷酸化(OXPHOS)供能,这一现象称为Warburg效应。丙酮酸脱氢酶复合体(PDC)活性的调节是关键决定点,是糖代谢途径中糖酵解向三羧酸循环转变的关键酶,丙酮酸既可以被OXPHOS进入线粒体,又可以被代谢成乳酸。而丙酮酸脱氢酶磷酸酶(PDP)主要通过增强PDC的活性,导致丙酮酸进入线粒体的浓度增加,故其极具有成为肿瘤诊断标志物及治疗靶点的潜能。本文综述丙酮酸脱氢酶磷酸酶催化亚基1(PDP1)在恶性肿瘤中作用机制的研究进展。

蛋白磷酸酶4催化亚基在肿瘤进展中的作用

蛋白磷酸酶4(protein phosphatase 4,PP4)是一种进化保守的蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,以蛋白磷酸酶4催化亚基(protein phosphatase catalytic 4,PP4C)与不同的调节亚基相结合组成多聚体的形式存在并发挥功能。PP4C主要参与包括细胞葡萄糖代谢、细胞信号传导通路、DNA损伤反应、细胞周期、细胞增殖和肿瘤发生、迁移等多种细胞生物学过程。近年来,随着对PP4C的研究越来越广泛,已证明其在多种恶性肿瘤的发展和进展中起重要作用,有望成为肿瘤生物标志物和肿瘤治疗的靶标。本文就PP4C参与多种细胞生物学过程及其在肿瘤的发生和进展过程中的作用进行综述。

生物信息学技术分析人结直肠癌中蛋白磷酸酶2A催化亚基α(PPP2CA)表达与患者预后及免疫浸润的关系

目的通过分析蛋白磷酸酶2A催化亚基α(PPP2CA)在结直肠癌(CRC)中表达水平与患者预后及免疫浸润的关系,进一步了解CRC发生和进展中的相关机制。方法基于基因芯片数据库Oncomine和肿瘤免疫评估资源(TIMER)数据库分析在CRC组织和正常组织中PPP2CA表达水平的差异性;基于阿拉巴马大学伯明翰分校癌症数据分析门户(UALCAN)和基因表达谱交互分析(GEPIA)数据库分析PPP2CA的表达水平对CRC患者预后的影响;基于LinkedOmics平台构建PPP2CA的共表达网络并进行基因本体论(GO)富集分析和京东基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析;基于TIMER和GEPIA数据库分析PPP2CA与免疫浸润之间的相关性。基于c-BioPortal平台分析结肠腺癌(COAD)中PPP2CA的基因突变情况。结果与正常结直肠组织相比,在CRC组织中PPP2CA表达下调。高表达水平的PPP2CA预示着更好的总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)。在COAD中,PPP2CA的表达水平与包括CD8^(+)T细胞、中性粒细胞和树突状细胞在内的免疫浸润细胞呈正相关。而某些免疫细胞标志物,包括B细胞的CD19和CD38、M1巨噬细胞的一氧化氮合酶2(NOS2)、M2巨噬细胞的精氨酸酶1(Arg1)和甘露糖受体C1(MRC1)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的人类白细胞抗原G(HLA-G)和CD80、单核细胞的CD14和IgG Fc段受体Ⅲa(FCGR3A),却显示出不同的PPP2CA相关免疫浸润模式:即PPP2CA表达水平与COAD和直肠腺癌(READ)中的B细胞、巨噬细胞、单核细胞、TAM、1型辅助T(Th1)细胞、Th2细胞、调节性T细胞、衰竭T细胞和中性粒细胞均显著相关。结论PPP2CA在CRC组织表达水平下调,并且与免疫浸润密切相关。

类钙调磷酸酶B亚基蛋白GhCBL3-A01调控棉花黄萎病抗性的功能分析

【目的】解析类钙调磷酸酶B亚基蛋白(calcium B-like protein,CBL)基因GhCBL3-A01在棉花抗黄萎病反应中的功能,为棉花抗病育种提供基因资源。【方法】从棉花基因组数据库获得GhCBL3-A01基因的同源序列,进行生物信息学分析。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)、茉莉酸甲酯(methyl jasminate,MeJA)和H2O2处理的棉株中GhCBL3-A01基因的表达量变化。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术研究GhCBL3-A01在棉花抗黄萎病中的功能。通过检测活性氧积累以及相关基因的表达量,初步分析GhCBL3-A01的作用机制。【结果】陆地棉中GhCBL3-A01及其3个同源蛋白均含有3个CBL家族典型的EF-hand结构域。大丽轮枝菌、MeJA和H2O2处理后,GhCBL3-A01的表达量显著升高。VIGS沉默GhCBL3-A01导致病株率和病情指数显著降低,茎秆维管束褐变程度减轻,有病菌繁殖的茎段数量明显减少,增强了棉株对黄萎病的抗性。GhCBL3-A01基因沉默棉株叶片中活性氧积累增多,防御相关基因PR1、NPR1、PR4和PDF1.2以及茉莉酸信号通路关键基因AOS1、OPR3、MYC2和LOX2的表达量增加。【结论】GhCBL3-A01通过调控防御相关基因、茉莉酸信号通路基因的表达和活性氧积累负调控棉花对黄萎病的抗性,是提高棉花黄萎病抗性的候选基因。

蛋白磷酸酶1调节亚基14B对神经母细胞瘤细胞有丝分裂进程的调控作用

目的 研究蛋白磷酸酶1调节亚基14B(PPP1R14B)对神经母细胞瘤(NB)细胞有丝分裂进程的调控作用,为其治疗提供潜在新靶标。方法 在NB细胞SK-N-BE(2)-M17中转染2条不同序列小干扰RNA(siRNA)(PPP1R14B siRNA#1和#2)敲低PPP1R14B,实时定量PCR和Western印迹法检测PPP1R14B的敲低效果。在SK-N-BE(2)-M17 GFP-H2B细胞中转染PPP1R14B siRNA#1和#2,Time-lapse活细胞成像技术动态监测敲低PPP1R14B对该细胞有丝分裂进程的影响。采用酶切克隆法构建靶向PPP1R14B的2条不同序列短发夹RNA(shRNA)(sh PPP1R14B#1或#2)慢病毒质粒,并感染SK-N-BE(2)-M17细胞建立PPP1R14B稳定敲低细胞,Western印迹法检测其敲低效果,克隆形成实验观察敲低PPP1R14B对SK-N-BE(2)-M17细胞生长的影响。基于GEO数据库的临床数据,按NB不同临床分期分组,分析各组样本中PPP1R14B mRNA表达水平及其与预后的相关性。结果 与转染对照siRNA相比,转染PPP1R14B siRNA#1和#2均可有效敲低SK-N-BE(2)-M17细胞中PPP1R14B mRNA和蛋白表达(P<0.01)。Timelapse活细胞成像结果显示,与转染对照siRNA相比,转染PPP1R14B siRNA#1和#2组SK-N-BE(2)-M17GFP-H2B细胞有丝分裂期时间延长(P<0.05),且主要是有丝分裂前中期时间显著延长(P<0.01)。Western印迹法结果显示,与转染对照shRNA相比,转染sh PPP1R14B#1和#2均可有效敲低SK-N-BE(2)-M17细胞中PPP1R14B蛋白表达(P<0.01);克隆形成实验结果表明,转染sh PPP1R14B#1或#2稳定敲低组细胞克隆形成数亦明显降低(P<0.01)。GEO数据库分析显示,PPP1R14B mRNA表达水平与NB恶性程度呈正相关,与患者预后呈负相关。结论 敲低PPP1R14B导致SK-N-BE(2)-M17细胞有丝分裂期阻滞和生长减慢,PPP1R14B在NB发生发展中发挥重要作用。

钙调蛋白磷酸酶B亚基靶向肝癌的研究

目的:基于小动物活体成像检测技术,探讨重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基(rhCNB)的肝癌靶向性。方法:采用肿瘤组织块法建立BALB/c裸小鼠荷人肝癌细胞SMMC-7721原位肝癌模型。原位肝癌模型建立第14天时,按荷瘤动物体重大小随机分为FITC标记的rhCNB(rhCNB-FITC)给药组和FITC对照组,每组12只,各取6只分别用于给药后2 h、24 h剖解取出心脏、肺、肝、胃、双侧肾脏和脾脏用小动物活体成像系统进行荧光检测。另取未接种肿瘤的正常BALB/c裸小鼠随机分为rhCNB-FITC给药组和空白对照组,rhCNB-FITC给药组12只,各取6只分别用于给药后2 h、24 h剖解取相同的脏器进行荧光检测。空白对照组6只,剖解取出相同的脏器进行荧光检测。结果:rhCNB-FITC给予未接种肿瘤的正常动物2 h时,主要分布于动物的肾脏、肝、胃、心和肺,脾脏未见明显分布;24 h时,主要分布于动物的肾脏,肝、胃、心、肺和脾脏未见明显分布。在原位肝癌模型试验中,rhCNB-FITC给药2 h时,主要分布于肝肿瘤、肾脏、肺、胃和心脏等组织器官,脾脏内未检测到明显荧光;FITC给药组只有在肝和胃组织中能检测到荧光,而且荧光强度明显弱于rhCNB-FITC给药组;rhCNB-FITC给药组与FITC对照组肝部(包括正常组织和肝肿瘤组织)的荧光强度比较,P<0.01,具有显著统计学意义。rhCNB-FITC给药24 h时,主要聚集在肝肿瘤、胃、肾脏和肺等组织器官,其中rhCNB在肝肿瘤部位的浓度最高;rhCNB-FITC给药组与FITC对照组肝肿瘤部的荧光强度比较,P<0.05,具有统计学意义。结论:重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基具有良好的肝癌靶向性。

水稻类钙调磷酸酶亚基B蛋白质在叶片生长和白叶枯病抗性反应中的表达

钙信号介导植物对多种外部刺激的反应并参与调控广泛的生理学过程。钙离子结合蛋白质,如类钙调磷酸酶亚基B蛋白质(calcineurin B-like protein,CBL),对感受和传递钙信号具有重要作用。根据基因组测序及注释分析,水稻(Oryzasativa)基因组中有10个CBL家族成员。采用基于抗体的蛋白质组学策略,利用免疫印迹方法研究了水稻CBL蛋白质在叶片生长不同时期的表达,揭示了其在正常发育过程中的表达模式。然后对Xa21介导的水稻白叶枯病抗性反应不同时间点的蛋白质表达进行检测,发现OsCBL-1、OsCBL-3、OsCBL-5、OsCBL-9和OsCBL-10这5个蛋白质的表达发生了变化;进一步比较它们在抗病、感病和对照处理中的表达情况,发现其在不同反应间的表达也有区别,提示了CBL蛋白质在水稻-白叶枯病菌互作过程中的功能。该研究为深入了解水稻CBL蛋白质的功能提供了有价值的线索。

钙调神经磷酸酶B亚基及钙调素的EPR研究

根据顺磁离子Mn^(2+)的取代特性,用EPR方法研究了钙调神经磷酸酶B亚基与其4个Ca^(2+)的结合位点,以及它们亲和力的细微差别。并同时进行了钙调素的对比研究。实验和Scatchard作图表明,B亚基有4个Ca^(2+)结合位点,2个高亲和力结合位点,其解离常数为4×10^(-6)mol/L;2个低亲和力结合位点,解离常数为9×10^(-5)mol/L。钙调素也有2个Ca^(2+)高亲和力结合位点,其解离常数为8×10^(-6)mol/L,2个低亲和力结合位点,解离常数为7×10^(-5)mol/L。钙调神经磷酸酶B亚基和钙调素Mn^(2+)结合位点的EPR研究对B亚基和钙调素在共同调节钙调神经磷酸酶中的作用提供了有用的信息。

杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白PbCBL10基因的克隆和表达特性研究

【目的】为了探明杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白（CalcineurinB—likeprotein，CBL）基因的序列特征和表达特点，【方法】以杜梨幼苗为试材，运用同源克隆和半定量RT—PCR对PbCBLIO基因进行克隆和表达分析。【结果】结果表明．PbCBLIO基因编码区cDNA长度为801bp，编码的多肽由266个氨基酸组成。该多肽预测的等电点为4．56，估计的相对分子质量为30．45ku。其对应基因组DNA序列长1983bp，包括9个外显子和8个内含子。通过PSORT进行亚细胞定位分析发现PbCBLl0蛋白位于质膜上的几率最大。PbCBLIO基因编码的多肽具有4个钙离子结合域EF手形结构和1个钙调磷酸酶A亚基结合位点。PbCBLl0与番茄S1CBLIO（NP_001239045）和拟南芥AtCBLl0（NP_195026）蛋白间的同源性较高，分别为82％和77％，并与AtCBL10亲缘关系最近。PbCBL10基因在杜梨幼苗根、茎和叶片中均为诱导型表达，50～200mmol·L^（-1）CaCl2、20μmol·L^（-1）ABA、100mmol·L^（-1）NaCl、10％（w／v）PEG6000或180mmol·L^（-1）甘露醇处理后其表达量明显上调。【结论】PbCBLIO基因具备植物CBL基因家族的固有特征，能够响应胞内钙浓度变化，对ABA、盐碱、干旱和渗透胁迫均存在转录响应。

葡萄类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶VvCIPK10的特性与表达

【目的】在葡萄中克隆丝苏氨酸蛋白激酶Vv CIPK10,分析其激酶特性和在逆境胁迫下的表达模式,为进一步研究该基因参与逆境胁迫的分子功能,探讨葡萄抗逆分子机制提供理论依据。【方法】利用电子克隆技术获得Vv CIPK10序列,设计特异引物进行RT-PCR反应,对克隆到的序列进行开放阅读框和保守结构域分析;构建原核表达载体,转化表达菌株后用IPTG进行诱导表达,收集菌体后裂解细胞,制备蛋白上样液,SDS-PAGE电泳对表达产物进行分析,同时对融合蛋白进行可溶性分析;IPTG大量诱导表达融合蛋白,收集菌体后进行超声破碎细胞,用麦芽糖结合蛋白纯化柱纯化MBP-Vv CIPK10融合蛋白,SDS-PAGE电泳进行分析;纯化后的融合蛋白与体外自磷酸化缓冲液进行自磷酸化反应,反应后SDS-PAGE电泳,压磷屏检测体外自磷酸化反应;构建重组瞬时表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10;分离拟南芥原生质体,通过PEG介导的瞬时转化方法将重组表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10转化至原生质体;通过基因枪介导的转化方法将重组表达载体p BI221-GFP/Vv CIPK10转化至洋葱表皮细胞,培养16 h后用激光共聚焦显微镜进行荧光信号检测;选择生长相对一致且健壮的葡萄植株,于干旱、低温和盐胁迫处理后不同时间取样,同时在田间取葡萄不同组织样品,实时荧光定量PCR检测Vv CIPK10在葡萄不同组织中的表达以及在不同逆境胁迫下的表达模式。【结果】PCR克隆获得葡萄Vv CIPK10全长为1 357 bp,5′端非编码区为30 bp,3′端非编码区为156 bp,开放阅读框为1 171 bp,编码436个氨基酸,理论等电点为8.59,分子量为48.7 k Da。保守结构域预测分析显示该蛋白5′端具有一个激酶结构域,3′末端具有一个PPI结构域和一个NAF结构域。BLSATP分析表明葡萄Vv CIPK10与桃树CIPK(XP_007205151)一致性最高(74%)。重组表达载体p MAL-C5X/Vv CIPK10在大肠杆菌中经诱导表达获得与理论分子量(43 k Da+48.7 k Da)相一致的融合蛋白。MBP-Vv CIPK10融合蛋白经柱纯化后获得单一的蛋白条带,Vv CIPK10的自磷酸化活性依赖于Mn^(2+),不依赖于Mg^(2+)和Ca^(2+),EDTA可以抑制Vv CIPK10的自磷酸化活性。亚细胞定位结果显示,Vv CIPK10定位在细胞核、细胞膜和细胞质。Vv CIPK10在葡萄各个组织中均有表达,主要在葡萄根和叶片中大量表达,葡萄茎、花序、果实和卷须中的表达量较低。在干旱、低温和盐胁迫处理后,Vv CIPK10呈现受诱导表达模式。Vv CIPK10的表达在低温胁迫后6 h达到峰值,干旱和盐胁迫后2 h即达到峰值。【结论】葡萄Vv CIPK10能够响应干旱、低温和盐胁迫,推测Vv CIPK10在葡萄抗非生物逆境胁迫中具有重要作用。

葡萄类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因VvCBL4的克隆与表达分析

【目的】在京秀(Vitis vinifera‘Jingxiu’)葡萄中克隆类钙调磷酸酶B亚基蛋白基因Vv CBL4及其启动子,分析Vv CBL4的表达特性与逆境胁迫的关系。【方法】用RACE技术克隆Vv CBL4的全长,实时荧光定量PCR检测Vv CBL4在不同逆境下的表达;用同源克隆技术获得Vv CBL4的启动子,在烟草叶片中瞬时表达分析Vv CBL4启动子的活性。【结果】Vv CBL4全长为959 bp,ORF为642 bp,编码213个氨基酸,具有3个EF手钙结合结构域。Vv CBL4在根部表达量最高,其次是果实。Vv CBL4的转录本能对干旱、低温和盐胁迫处理快速做出响应。Vv CBL4启动子富含与逆境响应相关的顺式作用元件。干旱、低温和盐胁迫处理能够增强启动子活性。【结论】获得Vv CBL4及其启动子序列,Vv CBL4的表达能对逆境胁迫做出响应,Vv CBL4启动子的活性受逆境胁迫诱导,说明Vv CBL4在葡萄逆境胁迫反应中具有重要的作用。

注射用重组人钙调磷酸酶B亚基稳定性的初步研究

目的：对注射用重组人钙调磷酸酶B亚基（rhCNB）的稳定性进行初步研究，以确定其贮藏条件和有效期。方法：采用毛细管区带电泳（CZE），反相高效液相色谱（RP—HPLC），十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）非还原电泳、蛋白质含量测定Bradford法、圆二色谱（CD）、pH值、生物学活性等检测方法，对rhCNB在贮藏温度条件下的稳定性进行了系统研究。结果及结论：3批注射用rhCNB于2℃～8℃贮藏24个月，各项指标：外观、pH值、蛋白含量、纯度、肽图谱、相对分子质量、CD光谱蛋白质二级结构及生物学活性均无明显变化，稳定性好，有效期可暂定为2年。

香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1的克隆及序列分析

[目的]为香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因MaCBL1调控机理的研究奠定基础。[方法]根据在香蕉果实抑制缩减文库中获得的一个CBL基因片段,采用PCR方法克隆了MaCBL1基因全长cDNA序列并对其进行了初步的生物信息学分析。[结果]MaCBL1基因cDNA序列全长1 078 bp,编码213个氨基酸残基。多重序列比对结果显示,MaCBL1推导的氨基酸序列与其他植物来源的CBL基因的氨基酸序列同源性较高。遗传进化分析表明MaCBL1与其他植物如杨树、甘蓝、沙冬青、棉花和水稻的CBL基因的亲缘关系较近,并在同一个进化枝上。[结论]该研究为进一步研究香蕉钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白对香蕉生长发育、果实的成熟调控及对各种逆境反应的调控提供了依据。

生物信息学方法筛选华支睾吸虫成虫功能基因——钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白

目的本文通过建立华支睾吸虫成虫cDNA文库,筛选其功能基因。方法应用SMART方法构建华支睾吸虫成虫cDNA文库,进行大量EST测序,然后应用生物信息学方法将EST序列与GenBank中登陆的序列进行同源性比对、序列拼接及基因完整性判断;并应用NCBI上的RPSBLAST对所筛选基因的保守域进行搜索比对,利用PredictProtein分析、预测其功能域及二级结构。结果从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选的钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白(CsCBLP)基因,经同源性分析,CsCBLP与褐家鼠钙调神经磷酸酶(CaN)同源性为53%,与尾刺耐格里原虫CaNB同源性为40%,与新小杆线虫属结合蛋白的同源性为51%;保守域的比对及功能域、二级结构的预测显示所筛选的CsCBLP是钙调神经磷酸酶B亚基的的类似物,属于钙结合蛋白家族。结论应用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫cDNA文库中筛选出钙调神经磷酸酶B亚基样蛋白基因。

HPLC和MALDI-TOF-MS法分析重组人钙调磷酸酶B亚基的纯度和肽图谱

用反相高效液相色谱 (RP HPLC)法对重组人钙调磷酸酶B亚基 (rhCNB)的纯度和肽图谱进行了测定 ,以比较不同批次产品的纯度及其一级结构的一致性 ,对其进行质量控制 .并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI TOF MS)法进行验证 .结果表明 ,运用梯度洗脱RP HPLC法能对样品进行纯度检查和肽图谱分析 ,测得 3批样品纯度均达到 98%以上 ,肽图谱能达到批间一致 .同时用MALDI TOF MS法测定 ,纯度结果二者相符 ,质谱肽图经计算机辅助分析 ,确证rhCNB一级结构与天然CNB一致 .证明该方法灵敏、准确、可靠 .

钙调神经磷酸酶B亚基的^(125)I标记及其血脑屏障的通透性

钙调神经磷酸酶与老年性痴呆密切相关 ,为了解其 B亚基的血脑屏障的通透性 ,采用 Iodogen法对钙调神经磷酸酶 B亚基 (CNB)进行 12 5I标记 ,标记率高达 85 % ,产物 12 5I- CNB比活度为 74 0 GBq· g-1,放化纯度为 95 .7%。小鼠静脉注射 12 5I- CNB结果显示血脑屏障能够阻止完整的 CNB进入脑 。

Ⅰ型磷酸酶抑制亚基-1对人宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用

PPI1(Inhibitor-1of protein phosphatase 1)是Ⅰ型磷酸酶的抑制亚基之一,其活化依赖于35位苏氨酸蛋白激酶(PKA)的磷酸化而发挥抑制作用。本研究目的在于探讨PPI1持续活化型突变体的表达对人宫颈癌细胞株增殖的影响及其可能的作用机制。利用PPI1野生型和活化型突变体表达质粒分别转染HeLa细胞,首先通过H3TdR掺入实验、迁移实验观察PPI1基因对HeLa细胞增殖能力的影响,研究结果表明:在活化型突变体表达的HeLa细胞株中,细胞3H掺入量和迁移能力明显受抑。其次通过流式细胞术、Giemsa染色法分析PPI1对HeLa细胞的细胞周期的影响;FACS分析表明HeLa细胞G2/M期比例明显升高;经脱氧胸苷同步化后,该组细胞进入有丝分裂期明显滞后。最后利用Western blot分析PPI1对MAPK信号转导通路的影响,Western blot分析显示该组细胞的ERK磷酸化水平明显下降。研究表明PPI1活化型突变体的表达可抑制人宫颈癌细胞株的增殖,这与其诱导HeLa细胞G2/M期停滞、有丝分裂的进入延缓有关,其中涉及到MAPK信号转导通路的活化受抑制。

CD和FT-IR法分析重组人钙调磷酸酶B亚基冻干前后与多批产品二级结构的一致性

目的通过测定重组人钙调磷酸酶B亚基(rhCNB)的圆二色谱(CD)和傅立叶变换红外光谱(FT-IR),来研究rhCNB冻干前、后和rhCNB多批产品之间二级结构的一致性,从而确定生产工艺是否稳定,样品是否发生变性等,达到控制产品质量的目的。方法采用CD和FT-IR光谱法分别对3批rhCNB进行蛋白质二级结构测定,并对rhCNB冻干前与冻干后样品进行了CD和FT-IR光谱法二级结构测定。结果与结论CD和FT-IR光谱测得3批样品谱图均达到批间一致,说明样品二级结构稳定,工艺过程较稳定,产品未发生变性。rhCNB冻干前与冻干后2种图谱均无明显变化,说明冻干工艺对rhCNB的二级结构并无改变。

板栗蛋白磷酸酶PP2A催化亚基基因的克隆与同源性分析

利用RACE技术从板栗雄花序中扩增得到1 347 bp的板栗蛋白磷酸酶2A的催化亚基(protein phospha-tase PP2A catalytic subunit,PP2Ac)cDNA片段。序列分析表明该片段包含基因的5′非翻译区4 bp,3′非翻译区407 bp,开放阅读框为936 bp,编码311个氨基酸,预计分子量为35.6 KD,等电点为5.94。基因序列数据库(GenBanK)登录为FJ840479(基因)和ACO57639(蛋白)。与葡萄、拟南芥、水稻等其他物种PP2Ac氨基酸序列相似性约为92%。

Ⅰ型磷酸酶抑制亚基1对大鼠心肌细胞缺氧／复氧损伤的保护作用

目的探讨Ⅰ型磷酸酶抑制亚基1（PPIl）对大鼠乳鼠心肌细胞（H／R）损伤的保护作用及其机制。方法用PPll野生型和活化型突变体表达质粒分别转染乳鼠心肌细胞，并建立乳鼠心肌细胞H／R模型，测定各组心肌细胞的存活率、丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LDH）的含量、caspase-3活性及超氧化物歧化酶（SOD）活力，此外用流式细胞术测定各组心肌细胞凋亡率，Western blot分析PPIl对凋亡相关蛋白表达及P13K／Akt信号通路的影响。结果与正常组比较，模型组LDH、MDA含量、caspase-3活性及细胞凋亡率增高（P〈0．05），细胞存活率和SOD活性降低（P〈0．05）；PPll活化型突变体转染组细胞的LDH、MDA含量、caspase-3活性和细胞凋亡率则降低，细胞存活率和SOD活性升高，与缺氧／复氧组比较各实验指标差异均具有统计学意义（P〈0．05）。Western blot表明该组细胞P53、Bax表达下调，pAkt表达上调。结论PPIl活化型突变体对H／R造成的心肌细胞损伤具有保护作用，其机制与稳定心肌细胞膜、减轻氧自由基损伤及减少细胞凋亡有关。