三磷酸鸟苷环化水解酶1去磷酸化突变体对食管癌放射敏感性的影响及机制研究

目的:探讨体内从头合成四氢生物蝶呤(BH4)过程中的限速酶三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1),关键磷酸化位点突变体(GCH1-S81A)对食管癌放射敏感性的影响及机制。方法:构建不同磷酸化水平的GCH1稳定过表达食管鳞癌(KYSE-150)细胞系,按照GCH1磷酸化水平及照射剂量,将实验分为空白对照组、空载病毒组、空载+照射组、野生GCH1组、GCH1磷酸化组、GCH1去磷酸化组、GCH1去磷酸化+照射组、回补验证组、回补验证+照射组。通过Western blot验证感染效率,CCK-8法检测各组肿瘤细胞存活率,克隆形成实验检测肿瘤细胞放射敏感性变化,流式细胞术检测各组肿瘤细胞凋亡率、活性氧(ROS)及脂质过氧化物含量变化,Western blot检测铁死亡相关蛋白表达变化。结果:GCH1去磷酸化组感染48 h后细胞内GCH1-S81磷酸化蛋白表达水平明显降低(t=9.35、16.57,P<0.05)。与空载+照射组相比,GCH1去磷酸化+照射组细胞在10 Gy X射线照射24 h后存活率明显降低(t=26.97,P<0.05)。在10 Gy X射线照射8 h后KYSE-150细胞中ROS含量,以及照射48 h后细胞凋亡率和脂质过氧化物水平,均上升明显(t=17.89~131.10,P<0.05),且在加入GCH1-S81A突变体后进一步加剧(t=157.06~97.81,P<0.05),这一现象能被补充野生型GCH1后抑制(t=66.38~23.08,P<0.05)。与空载+照射组相比,去磷酸化+照射组在各个X射线剂量(2、4、6和8 Gy)照射下克隆形成能力均有所降低(t=7.31~8.16,P<0.05)。GCH1-S81A突变能够降低铁死亡相关蛋白GPX4的表达(t=4.55,P<0.05),且在10 Gy的X射线照射后表达量进一步降低(t=12.98,P<0.05)。结论:GCH1突变为GCH1-S81A去磷酸化后,可抑制食管癌细胞KYSE-150的生长并提高其放射敏感性,GCH1-S81A突变体有望为提高食管癌放疗疗效提供新的方式。

过表达多巴胺脱羧酶、酪氨酸羟化酶和三磷酸鸟苷环化水解酶1重组慢病毒构建及其在帕金森病大鼠模型治疗作用的研究

目的构建同时表达3种多巴胺(DA)合成相关酶的重组慢病毒(rLV),验证其在6-羟基多巴胺(6-OHDA)帕金森病(PD)大鼠模型中治疗作用,为PD临床基因治疗提供实验基础。方法构建过表达多巴胺脱羧酶(DDC)、酪氨酸羟化酶(TH)和三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)rLV及对照rLV。6-OHDA制备的PD模型大鼠,随机分为生理盐水组(n=6)、阴性病毒组(n=6)和阳性病毒组(n=12),分别经立体定向向大鼠纹状体注射生理盐水、对照rLV和DDC+TH+GCH1-rLV。观察构建病毒对PD大鼠旋转行为的影响,免疫荧光法检测病毒转染情况,同时使用高效液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)检测纹状体内DA及其代谢产物改变情况。结果 PD大鼠纹状体注射后,阳性病毒组行为改变与生理盐水组、阴性病毒组比较,差异有显著统计学意义(P<0.01);阳性病毒组呈现显著的旋转行为改善。免疫荧光显示阳性病毒转染表达有TH活性的阳性细胞。阳性病毒组纹状体内DA及其代谢产物与生理盐水组、阴性病毒组比较,显著增高(P<0.01)。结论成功构建过表达DDC+TH+GCH1-rLV,并且在PD模型大鼠中呈现显著的行为改善及DA水平增加,为PD的基因治疗提供实验基础。

三磷酸鸟苷环化水解酶1调控的小胶质细胞环状RNA的表达

目的分析三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)在体外调控小鼠小胶质细胞(BV2)中环状RNA的相关表达。方法将BV2培养传代后转染病毒,分为低表达GCH1病毒载体组(Ad-shGCH1,n=3)与对照病毒载体组(Ad-NC,n=3)两组样本。孵育48 h观察转染效率并利用TRIzol试剂提取总RNA。使用第二代环状RNA(circRNA)高通量测序分析Ad-shGCH1与Ad-NC两组样本,筛选差异表达的环状circRNA。circRNA测序数据使用R包edge R计算基于负二项分布模型的fisher精确检验来确定差异显著性。应用编码-非编码基因共表达(CNC)网络分析对表达差异显著的circRNAs进行生物信息学分析,最后通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)验证。结果与对照组比较,Ad-shGCH1中mmucirc0001322(实验组CPM值:10.40,对照组CPM值:7.63,P<0.05)、mmucirc0000454(实验组CPM值:10.84,对照组CPM值:8.20,P<0.05)、mmucirc0001383(实验组CPM值:10.76,对照组CPM值:8.53,P<0.05)、mmucirc0000898(实验组CPM值:11.22,对照组CPM值:9.32,P<0.05)发生高于对照组,差异有统计学意义,mmucirc0000652低于对照组(实验组CPM值:7.94,对照组CPM值:10.83,P<0.05)(倍数变化>1.2倍),差异有统计学意义。CNC分析表明mmucirc0000652可能通过参与特定的网络或生物学过程参与调控丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)而发挥作用。结论GCH1调控的circRNA可能参与体外小胶质细胞的炎症过程。

三磷酸鸟苷环化水解酶1和四氢生物蝶呤与神经性疼痛的研究进展

神经性疼痛是临床最常见的慢性疼痛之一,针对其治疗一直以来都是全球的难点,主要原因是其发病机制不明.三磷酸鸟苷环化水解酶1（GCH1）通过调节相关炎性因子介导神经性疼痛的发生,除此之外GCH1也是四氢生物蝶呤（BH4）合成过程中最主要的限速酶.BH4是各种炎性因子和神经递质合成必需的辅因子.在研究其与疼痛的关系时,发现当沉默GCH1基因后伴随疼痛缓解,BH4表达降低.结果提示GCH1和BH4与神经性疼痛有一定的关系.

人三磷酸鸟苷酸环化水解酶Ⅰ基因的克隆与表达

目的 研究人三磷酸鸟苷酸环化水解酶Ⅰ (GCHⅠ )基因在多巴胺代谢过程中的作用。 方法 从人胚胎肝脏中提取总RNA ,以RT PCR法扩增GCHⅠcDNA ,克隆于PGEM T easy载体中 ,测序正确后再构建真核表达载体 ,转染猴肾成纤维细胞系COS7,原位杂交检测其表达。 结果 RT PCR扩增出 90 4bp的cDNA ,并成功构建真核表达载体pCI neo GCHⅠ ,原位杂交证实其在COS7表达阳性率为 70 %～ 80 %。 结论 GCHⅠ有望用于帕金森病的基因治疗。

非诺贝特通过上调三磷酸鸟苷环化水解酶Ⅰ促进eNOS复偶联

目的探讨非诺贝特发挥降脂外血管内皮保护作用的机制。方法体外培养人脐静脉内皮细胞(HU-VECs),非诺贝特预处理HUVECs 2 h,再与脂多糖(LPS)共孵育24 h。采用Western blot检测三磷酸鸟苷环化水解酶Ⅰ(GTPCH-Ⅰ)的表达水平,高效液相色谱法检测四氢生物蝶呤(BH4)的表达水平,ELISA检测细胞上清一氧化氮(NO)浓度,利用Confocal方法检测细胞活性氧(ROS)产生水平。结果非诺贝特预处理后,较单纯LPS刺激组,细胞内BH4表达水平及细胞上清NO产生增多,伴有细胞内ROS产生减少(P均<0.05);此外,单独给予非诺贝特处理内皮细胞后,可见浓度依赖性上调细胞GTPCH-Ⅰ的表达,非诺贝特(10μmol/L)上调GTPCH-Ⅰ的表达在12 h达到高峰。结论非诺贝特通过上调内皮细胞GTPCH-Ⅰ的表达而增加BH4的水平,进而促进内皮型一氧化氮合酶的复偶联,改善血管内皮功能。

I型三磷酸鸟苷环化水解酶在2型糖尿病大鼠主动脉表达的改变

目的:探讨血管内皮功能异常状态下,I型三磷酸鸟苷环化水解酶(GTPCH I)mRNA在2型糖尿病及硫辛酸干预大鼠主动脉中的表达。方法:选择雄性Wistar大鼠35只,随机选择10只作为正常对照组(NC组),25只采用高脂饲料喂养8周后,小剂量链脲佐菌素注射诱导建立2型糖尿病大鼠模型(成模21只),其中10只给予硫辛酸50 mg/kg腹腔注射,作为硫辛酸干预组(LA组),其余11只作为2型糖尿病组(T2DM组)。所有大鼠饲养16周后均处死测定其主动脉舒张功能,并用半定量RT-PCR检测主动脉GTPCH ImRNA表达。结果:T2DM组和LA组主动脉的内皮依赖性血管舒张(EDVR)明显减弱,而LA组较T2DM组有明显改善(P<0.05)。主动脉GTPCH I mRNA的表达在T2DM组下降70.28%,LA组下降26.88%,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:T2DM大鼠离体主动脉EDVR减弱时,主动脉GTPCH I mRNA表达显著下降。硫辛酸可改善EDVR,此作用可能与改善GTPCH I mRNA表达有关。

亚砷酸钠对Chang肝细胞鸟苷三磷酸环化水解酶及6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶的mRNA表达水平的影响

目的研究亚砷酸钠(NaAsO2)对Chang肝细胞鸟苷三磷酸环化水解酶I型(GTPCH)及6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(PTPS)的mRNA表达水平的影响。方法分别以不同浓度NaAsO2(0、50、200及400μmol/L)染毒人类Chang肝细胞株12h。以MTT法测定细胞活力,以RT-PCR法测定GTPCH和PTPS mRNA的表达水平。结果50μmol/L剂量组细胞活力与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),其他两组细胞活力均显著低于对照组(P<0.05);50、200及400μmol/L剂量组GTPCH和PTPS的mRNA表达水平与对照组相比均显著下降(P<0.05),且呈剂量-效应关系。结论NaAsO2暴露引起Chang肝细胞四氢生物蝶呤(BH4)合成酶GTPCH和PTPS的mRNA表达水平下降可能与砷致色素代谢异常有关。

电针足三里、太冲穴对功能性消化不良大鼠胃肠动力及NO/sGC/cGMP/PKG1通路的影响

目的探讨电针对功能性消化不良大鼠胃肠动力及一氧化氮(nitric oxide,NO)/可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylate cyclase,sGC)/环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)/蛋白激酶G1(protein kinase G1,PKG1)通路的影响。方法将40只SPF级雄性SD大鼠分为正常组、模型组、电针组、抑制剂组和电针+抑制剂组,每组8只。多因素干预法造模后,电针组选择足三里、太冲穴电针30分钟,每天1次,共10天。抑制剂组每天腹腔注射抑制剂ODQ溶液(2 mg/kg),共10天;电针+抑制剂组腹腔注射等量抑制剂后进行电针;正常组与模型组不进行特殊干预。干预结束后检测胃残留率、小肠推进率,苏木素—伊红染色观察胃窦组织形态,蛋白免疫印迹法及实时荧光定量PCR检测胃窦组织sGC、cGMP、PKG1蛋白及mRNA表达水平。结果各组大鼠胃窦组织未见明显器质性改变。与正常组相比,模型组胃残留率明显升高,肠推进率显著降低,胃窦组织sGC、cGMP、PKG1蛋白和mRNA的表达量相较于正常组降低(均P<0.01)。相对于模型组,电针组、抑制剂组和电针+抑制剂组的胃残留率明显降低,小肠推进率明显提高,sGC、cGMP、PKG1蛋白和sGC、cGMP的mRNA表达量升高(均P<0.05)。电针组与电针+抑制剂组胃窦组织sGC、cGMP、PKG1蛋白和sGC、cGMP的mRNA表达量比抑制剂组有所增加(均P<0.05)。结论电针可通过调控NO/sGC/cGMP/PKG1通路改善功能性消化不良大鼠胃肠动力障碍。

GCH1基因突变致多巴反应性肌张力不全一例

多巴反应性肌张力不全(DRD)是一种常染色体显性或隐性遗传运动障碍疾病,病理特征为黑质纹状体多巴胺含量减少,主要表现为儿童期肌张力障碍,小剂量左旋多巴可以改善症状。三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)基因是其致病基因之一。该文报道1例GCH1基因突变所致的DRD患儿,其以步态异常为主诉,行走时出现肌张力不全姿势,症状晨轻暮重,经基因检测证实其GCH1基因出现杂合性突变。接受小剂量左旋多巴治疗后患儿神经系统体征基本消失,于小儿神经科门诊随诊2年,运动功能良好。临床上对于病因不明的肌张力障碍患儿,需警惕DRD的可能,尽早识别和治疗可明显改善预后,预防残疾的发生。

酪氨酸羟化酶基因新突变导致多巴反应性肌张力障碍家系分析

【目的】研究多巴反应性肌张力障碍(DRD)家系TH基因突变特点。【方法】提取先证者及其父母和两个姐姐外周血基因组DNA,使用高通量测序(NGS)的方法对已知肌张力及运动障碍相关的256个致病基因进行检测。【结果】家系中2例患者(先证者和其大姐)的酪氨酸羟化酶(TH)基因外显子14、9存在c.1481C>T(p.Thr494Met)、c.943G>A(p.Gly315Ser)复合杂合突变,父母分别携带一个杂合突变,其表型正常的二姐和50名正常对照者均未检测到该突变。【结论】TH基因c.1481C>T(p.Thr494Met)、c.943G>A(p.Gly315Ser)突变导致了该DRD家系的基因异常,并且发现了新的TH基因突变,扩展了DRD基因型与临床表型的关系谱,对DRD的早期精准诊断和治疗是改善预后的关键。

汉族多巴敏感性肌张力障碍三个家系的分子遗传学研究(英文)

背景:多巴敏感性肌张力障碍(dopa-responsivedystonia,DRD)的基本病因为遗传的缺陷,自1990年以来,中国有关本病的临床报道已有40余例,但相关的分子遗传研究报道较少。目的:分析国人DRD患者发病与三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH-1)基因突变的关系。设计:典型调查。地点和对象:来自3个家庭的5例于2000-10/2001-07在解放军第二军医大学长海医院神经内科确诊的DRD患者及其亲属共12个成员。方法:经静脉采血2mL,常规提取基因组DNA,以PCR扩增GCH-1基因,反应产物用自动DNA测序仪直接测序。主要观察指标:三个家系中是否有基因突变。结果:在A家系,先证者母亲为正常个体,基因测序显示无基因突变,其中3例患病个体DNA测序发现第2个外显子142号碱基由鸟嘌呤转换为腺嘌呤(G→A),导致半胱氨酸被替换为酪氨酸;估计其突变基因来自已故父系一方。在B家庭,先证者第一个外显子71号碱基由胸腺嘧啶转换为胞嘧啶(T→C),导致亮氨酸被替换为脯氨酸;而其父母及弟均为正常个体。C家庭无GCH-1基因突变。结论:GCH-1基因突变只是部分DRD患者的发病原因。

国人多巴敏感性肌张力障碍的分子遗传学研究

目的:分析国人多巴敏感性肌张力障碍(DRD)患者发病与三磷酸鸟苷环化水解酶Ⅰ(GCH-I)基因突变的关系。方法:来自3个家庭的5例临床确诊的DRD患者及其亲属共12名成员,经静脉采血2 ml,常规提取基因组DNA,以PCR扩增GCH-I基因,反应产物用自动DNA测序仪直接测序。结果:在A家系,先证者母亲为正常个体,基因测序显示无基因突变,其中3例患病个体DNA测序发现第2个外显子142号碱基由鸟嘌呤转换为腺嘌呤(G→A),导致半胱氨酸被替换为酪氨酸;估计其突变基因来自已故父系一方。在B家系,先证者第1个外显子71号碱基由胸腺嘧啶转换为胞嘧啶(T→C),导致亮氨酸被替换为脯氨酸;而其父母及弟均为正常个体。丙家庭无GCH-I基因突变。结论:GCH-1基因突变只是部分DRD患者的发病原因。

四氢生物蝶呤合成通路在神经病理性疼痛方面的研究进展

慢性疼痛是临床中最常见的症状之一,严重威胁着人类的健康,日益受到医务人员的重视。神经病理性疼痛(NP)是最常见的慢性疼痛之一,目前仍缺乏有效的治疗措施,主要原因是其发病机制不明。大量研究表明,四氢生物蝶呤(BH4)合成通路在NP中扮演着重要角色,极有望成为NP治疗的新靶点。本文就BH4合成通路在NP方面的研究进展作一综述。

四氢生物蝶呤与血管内皮功能异常

血管内皮功能异常突出表现为内皮依赖性血管舒张功能障碍 ,主要由NO减少及氧自由基增加所致。四氢生物蝶呤 (tetrahydrobiopterin ,BH4 )是NO合酶 (NOS)的必要辅助因子 ,影响NO和氧自由基生成。BH4充足时 ,NOS催化底物L 精氨酸和O2 生成L 胍氨酸和NO ;BH4缺乏时 ,NOS则发生脱偶联 (uncoupling) ,主要催化超氧阴离子产生。BH4缺乏是高血压、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病中内皮功能异常的重要原因 ,用BH4替代治疗提高内皮细胞内BH4水平可有效改善内皮功能 。

Segawa病基础研究最新进展

Segawa病的发病与黑质多巴胺神经元轴突末端酪氨酸羟化酶活性下降有关,在儿童的生长发育阶段,多巴胺活性随年龄而逐渐下降,本病的发病年龄多在多巴胺活性急剧下降的阶段(10左右),症状进行性加重,至30岁以后趋于稳定。最可靠和最有诊断意义的实验室检查是测定脑脊液中生物喋呤和新喋呤的含量,以及外周血单核细胞内三磷酸鸟苷环化水解酶(GTPcyclohydrolase,GCH-1)活性。本病患者黑质神经细胞数量正常。迄今在GCH-1基因的6个外显子已经发现各种形式的突变。

Gch在蝶啶代谢通路中参与鱼类体色形成

鸟苷三磷酸环化水解酶(GTP cyclohydrolase,Gch)是具有GTP-cyclohydro结构域的蛋白酶,广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物中。哺乳动物和鸟类中只具有Gch1,硬骨鱼类和两栖动物中Gch1存在旁系同源的Gch2和Gch3,且功能存在差异。Gch是以鸟苷三磷酸为底物,最终形成四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)的限速酶,而BH4是芳香族氨基酸羟化酶必须的辅助因子,参与多种激素和神经递质的合成。Gch是催化各种蝶呤生物合成的起始步骤,例如皮肤色素、眼色素、甲氨蝶呤、叶黄酸和BH4等,在体内一系列生理病理过程中发挥重要作用。Gch的生理功能与BH4的生物合成有着不可分割的联系,作为BH4生物合成的唯一限速酶,其活性可作为神经元和色素细胞的发育指示物,也是研究色素形成和神经递质生物合成的重要标志。目前,Gch在肿瘤和心血管等疾病的发病机制方面已获得广泛关注和解析,而色素合成和体色调控的作用研究多集中在昆虫方面,在硬骨鱼类中较少。因此,本文将重点对Gch基因、蛋白质、功能以及在鱼类体色方面中的作用进行总结归纳,对深入分析Gch在鱼类体色形成中的作用及后期鱼类体色改良具有重要的指导意义。

中英文对照名词词汇(八)

三核苷酸重复序列 trinucleotide repeat sequence（TRS） 三环类抗抑郁药 tricyclic antidepressant（TCA） 三磷酸鸟苷环化水解酶 guanosine triphosphate cyclohydrolase I（GCH I）

带状疱疹后神经痛危险因素及GCH1基因多态性

目的探讨带状疱疹后神经痛(PHN)危险因素及三磷酸鸟苷环化水解酶1(GCH1)基因多态性。方法选择南阳市第一人民医院皮肤科2016年1月-2020年3月收治带状疱疹患者103例为研究对象,根据是否发生PHN分为PHN组(n=31)和非PHN组(n=72)。采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性对GCH1基因rs3783641位点多态性进行检测。结果单因素分析结果显示,PHN与应用激素史、初治时间、抑郁程度、焦虑程度存在关联(P<0.05),与年龄、皮损面积、性别、发病部位、治疗疗程无关;多元Logistic回归分析结果显示,无应用激素史、抑郁程度较高、焦虑程度较高是带状疱疹发生PHN的独立危险因素(P<0.05);PHN组患者与非PHN组患者GCH1基因rs3783641位点基因型分布总体差异具有统计学意义(Z=1.646,P=0.009);PHN组AT基因型频率低于非PHN组,TT基因型、T等位基因频率高于非PHN组,差异具有统计学意义(P<0.05);不同基因型AA、AT、TT视觉模拟评分(VAS)分别为(3.18±1.09)分、(4.12±1.34)分、(5.75±1.62)分,总体差异具有统计学意义(P<0.05)。结论PHN与应用激素史、初治时间、抑郁程度、焦虑程度存在关联,GCH1基因多态性与PHN发生及疼痛程度存在关联,可作为筛查指标。

GCH1基因变异致儿童多巴反应性肌张力障碍21例临床和遗传学分析

目的总结GCH1基因变异致儿童多巴反应性肌张力障碍(DRD)临床和遗传学特征,以提高对疾病的认识,正确诊治改变预后。方法回顾性分析2011年5月至2020年1月首都医科大学附属北京儿童医院神经内科确诊的21例GCH1基因变异致DRD患儿的临床表现、治疗及基因突变谱,并随访。结果女17例,男4例;起病年龄0~8岁。首次就诊时病程0.1~7.6年。起病诱因:感染后起病1例,无诱因起病20例。临床表现:经典型18例,非经典型3例;首发症状为尖足行走伴下肢僵硬18例、运动发育落后或倒退伴肢体软弱3例、眼睑下垂2例、震颤3例;部分逐渐出现躯干僵硬3例、上肢僵硬9例、肢体活动减少5例、面部表情减少3例、震颤7例、尖足行走19例、马蹄内翻足9例、眼睑下垂3例、动眼危象1例、流涎3例、吞咽困难2例、构音障碍2例、出汗多4例、睡眠增多2例、情绪淡漠1例。症状呈波动性,晨轻暮重18例,感染加重7例,疲劳加重20例。左侧肢体受累严重12例,右侧肢体受累严重3例。下肢受累严重18例,无上下肢受累优势3例。起病前运动发育落后4例,智力发育落后1例。家族史阳性3例。所有患儿均给予左旋多巴治疗后症状消失或明显缓解,2例出现异动症副反应。截止2020年1月随访,1例失访,20例随访年龄11月龄至16岁7月龄,随访时疗程0.1~8.6年,随访时16例症状基本消失,4例症状明显缓解。本组共发现21种不同的GCH1基因变异,其中10种未见文献报道的新变异(c.304A>T,c.257C>T,c.277A>T,c.478A>T,c.481C>T,exon 1 duplication,exon 2+3 deletion,c.726727insC,c.51delG,c.151166del)。结论 GCH1基因变异致儿童DRD是一种可治疗的先天遗传代谢病,婴儿及儿童期均可起病,可早至新生儿起病,临床表现以经典型为主,误诊率高,经典型亦可出现非经典型表现,需加强早期识别。DRD患者需注意GCH1基因非编码区变异及大片段缺失重复变异的筛查。