大肠杆菌磺胺类抗生素耐药基因二重PCR技术的建立

为建立一种一次性检测多个磺胺类抗生素耐药基因的检测方法,用磺胺类抗生素耐药大肠杆菌作为受试生物,根据磺胺类抗生素耐药基因Sul1和dfrA1设计一对引物进行二重PCR检测。结果发现:本方法能有效检测出大肠杆菌Sul1和dfrA1两种磺胺类抗生素耐药基因,检出限为4.5 cfu/μL,对于Sul1和dfrA1两种磺胺类抗生素耐药基因具有较强的检出特异性。此方法对检测大肠杆菌磺胺类抗生素耐药基因提供了有力的技术支撑。

牛、羊源大肠杆菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性及其耐药基因检测

为研究陕西榆林地区牛、羊源大肠杆菌的流行特点及其对氨基糖苷类抗生素的耐药情况,采集746份牛、羊粪便样本进行细菌分离纯化和大肠杆菌特异性引物phoA PCR鉴定,并对鉴定得到的大肠杆菌进行氨基糖苷类抗生素耐药性试验,对5种钝化酶基因AadA1、AbdB、Aph(3′)-Ⅰ、Aac(6′)-Ⅰb、Aac(3′)-Ⅱ进行PCR检测和同源性序列分析。结果显示,榆林地区大肠杆菌总检出率为42.49%;牛、羊源大肠杆菌对6种氨基糖苷类药物的耐药率从高到低依次为链霉素(70.7%)、卡那霉素(64.3%)、阿米卡星(47.9%)、庆大霉素(45.1%)、新霉素(39.4%)和妥布霉素(30.3%);多重耐药率(耐3种及3种以上药物)为67.0%;耐药基因AadA1和Aph(3′)-Ⅰ的检出率分别为79.5%和83.0%。综上表明,榆林地区检出的牛、羊大肠杆菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性比较强,耐药基因以AadA1、Aph(3′)-Ⅰ为主。

雏鸭腹泻大肠埃希菌耐药性和氨基糖苷类抗生素耐药基因检测与分析

目的 研究雏鸭腹泻大肠埃希菌的耐药性和氨基糖苷类抗生素耐药基因的存在情况。方法 采取山东济宁某养鸭场腹泻雏鸭粪便病料,通过实验室分离培养,对雏鸭腹泻大肠埃希菌进行药敏试验,比较雏鸭腹泻大肠埃希菌分离株对抗菌药物的敏感性,并采用PCR法对氨基糖苷类抗生素耐药菌株进行氨基糖苷类抗生素耐药基因aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6’)-Ⅰb、aac(6’)-Ⅱ、ant(3”)-Ⅰ和aph(3’)-Ⅱ的检测。结果 在24种药物敏感性试验中,雏鸭腹泻大肠埃希菌对头孢他啶、头孢哌酮、头孢吡肟和阿米卡星4种药物敏感,对氧氟沙星、头孢曲松、头孢噻肟和大观霉素4种药物中度敏感;对青霉素、链霉素、庆大霉素和四环素等16种药物耐药。在20株菌株中,检测的氨基糖苷类抗生素耐药基因中5株细菌检测出aac(3)-Ⅰ,10株细菌检测出aac(3)-Ⅱ,5株细菌检测出aac(6’)-Ⅰb,6株细菌检测出aac(6’)-Ⅱ,8株细菌检测出ant(3”)-Ⅰ,17株细菌检测出aph(3’)-Ⅱ。结论此次试验分离培养出的雏鸭腹泻大肠埃希菌呈现普遍耐药性,普遍检测出氨基糖苷类抗生素耐药基因aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(6’)-Ⅰb、aac(6’)-Ⅱ、ant(3”)-Ⅰ和aph(3’)-Ⅱ,其中aph(3’)-Ⅱ检出率高达85%。

铜绿假单胞菌耐消毒剂-磺胺基因及β-内酰胺类抗生素耐药相关基因研究

目的了解临床分离的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)耐消毒剂-磺胺基因(qacE△1-sulⅠ)及β-内酰胺类抗生素耐药相关基因存在状况。方法自临床分离40株Pa,采用聚合酶链反应(PCR)检测qacE△1-sulⅠ基因及12种β-内酰胺类抗生素耐药相关基因(TEM、SHV、OXA-10群、CTX-M-1群、PER、VEB、GES、CARB、IMP、VIM、DHA和oprD2)。结果40株中qacE△1-sulⅠ基因阳性19株(47.5%),CARB基因阳性18株(45.0%),oprD2基因缺失35株(87.5%),其余基因均阴性。结论临床分离的铜绿假单胞菌多重耐药严重,qacE△1-sulⅠ基因及CARB基因携带率高,oprD2基因缺失严重。

铜绿假单胞菌耐消毒剂-磺胺基因及β内酰胺类抗生素耐药相关基因研究

目的了解临床分离的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)耐消毒剂-磺胺基因(qacEΔ1-sul I)及β内酰胺类抗生素耐药相关基因存在状况。方法自临床分离的40株PA,采用聚合酶链反应(PCR)检测qacEΔ-su1I基因及12种β内酰胺类抗生素耐药相关基因(TEM、SHV、OXA-10群、CTX-M-1群、PER、VEB、GES、CARB、IMP、VIM、DHA和oprD2)。结果40株中qacEΔ1-su1I基因阳性19株(47.5%),CARB基因阳性18株(45.0%),oprD2基因缺失35株(87.5%),其余基因均阴性。结论临床分离的铜绿假单胞菌多重耐药严重,qacEΔ1-su1I基因及CARB基因携带率高,oprD2基因缺失严重。

肺炎支原体对大环内酯类抗生素耐药机制的研究进展

大环内酯类抗生素是治疗儿童肺炎支原体(MP)感染的一线药物,但随着此类药物在临床中的广泛使用,对大环内酯类抗生素耐药的MP菌株检出率迅速增高。耐药机制相关研究中,对药物作用靶点的研究最多见,其中23S rRNA基因突变相关研究尤为广泛和深入。耐药性会影响药物治疗效果,探讨菌株对药物的耐药机制并合理调整药物治疗方案,可获得更好的治疗效果,现将大环内酯类抗生素的作用机制和MP对大环内酯类抗生素的耐药机制综述如下。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐消毒剂基因及β-内酰胺类抗生素耐药相关基因检测

目的 了解临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA)中耐消毒剂基因(qacA)及β 内酰胺类抗生素耐药相关基因(mecA、TEM)存在状况。方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术检测20 株 MRSA中 qacA、mecA和 TEM基因。结果 20 株 MRSA中,qacA、mecA和 TEM基因PCR扩增均阳性。结论 临床分离的MRSA中qacA、mecA和TEM基因携带率均很高;在 MRSA中发现 qacA基因为我国首次报道。

辽宁地区猪源大肠埃希菌氨基糖苷类抗生素耐药基因的检测与分析

为了解辽宁地区猪源大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药情况,采用K-B纸片法对65株猪源大肠埃希菌菌株进行6种氨基糖苷类抗生素的药敏试验,同时采用PCR方法对耐药菌株rpsl基因和4种氨基糖苷类钝化酶基因aac(3)-Ⅳ、aad A、aac(6')-Ⅰb-cr、aac C4进行检测及序列分析,并将阳性样品与Gen Bank中登录的序列进行同源性比较。结果显示,辽宁地区猪源大肠埃希菌对链霉素、妥布霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素的耐药率分别为26.2%、15.4%、18.5%、29.2%、4.6%、21.5%;23株耐药菌株rpsl基因检出率为100%;4种氨基糖苷类钝化酶基因aac(3)-Ⅳ、aad A、aac(6')-Ⅰb-cr、aac C4检出率分别为13.0%、8.7%、69.6%、4.3%。以上结果表明,在氨基糖苷类抗生素中耐药性最低的是丁胺卡那霉素,rpsl基因及氨基糖苷类钝化酶基因普遍存在于辽宁地区猪源大肠埃希菌中。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌氨基糖苷类抗生素耐药基因的检测

为研究河南省及临近周边地区的规模化猪场猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia)放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)氨基糖苷类抗生素药物的耐药情况,调查了河南省及周边地区56个规模化猪场,对猪的肺脏和气管中分离鉴定的85株APP进行了研究。血清型鉴定结果显示,分离菌株为1、3、7、8、9、10、12、15型APP,采用纸片扩散法对分离株进行了耐药表型鉴定和采用PCR方法对氨基糖苷类抗生素药物耐药基因(aac3-Ⅳ、aac3-Ⅱc、ant2-Ⅰa)进行了检测。药敏试验结果显示,APP对氨基糖苷类抗生素药物耐药基因(aac3-Ⅱc)和(aac3-Ⅳ)的耐药率分别为57.6%(49/85)、81.2%(69/85);未检测出ant2-Ⅰa耐药基因。

多重PCR快速检测金黄色葡萄球菌中氨基糖苷类抗生素耐药基因及其临床应用

目的建立金葡菌氨基糖苷类抗生素耐药基因的多重PCR快速检测体系,了解耐药基因acc(6′)-Ie+aph(2″)、aph(3′)-Ⅲat ant(4′)-Ia在广州地区的流行分布。方法采用VITEK-60或PHOENIX-100微生物自动鉴定系统鉴定菌株及药敏试验,利用琼脂扩散法检测4种氨基糖苷类抗生素的耐药表型。通过优化PCR体系建立多重PCR并应用于检测金葡菌氨基糖苷类抗生素耐药基因。结果构建了四重PCR快速检测体系,124株金葡菌临床分离株中,acc(6′)-Ie+aph(2″)、aph(3′)-Ⅲa和ant(4′)-Ia的检出率分别为62.1%、32.3%和1.6%;所有庆大霉素、奈替米星以及阿米卡星耐药的金葡菌菌株均检测到上述3个耐药基因中的1个或1个以上基因;74株mecA阳性菌株中72株(97.3%)检测到acc(6′)-Ie+aph(2″)基因。结论所构建的多重PCR检测体系为临床实验室提供快速而有效的菌株耐药基因检测手段。编码AAC(6′)-APH(2″)双功能酶的acc(6′)-Ie+aph(2″)基因是金葡菌最重要的氨基糖苷类抗生素耐药基因,其次为aph(3′)-Ⅲa,ant(4′)-Ia则少见。

耐碳青霉烯类抗生素大肠埃希菌的耐药基因检测及传播机制探讨

目的检测耐碳青霉烯类抗生素大肠埃希菌的耐药基因,并探讨其传播机制。方法临床分离的耐碳青霉烯类抗生素大肠埃希菌3株,分别编码为DC10、DC44、DC52。用PCR法扩增筛查DC10、DC44、DC52的耐药基因,对扩增产物测序确定基因型别;通过接合实验得到DC10、DC44、DC52与耐叠氮钠的大肠埃希菌J53的接合子,对接合子进行菌种鉴定、药敏试验、耐药基因检测及测序;采用多位点序列分析(MLST)确定DC10、DC44、DC52的基因序列型(ST型),并利用e BURST软件进行亲缘性分析。结果 DC10、DC44、DC52中bla NDM基因均阳性,其它碳青霉烯类耐药基因、喹诺酮类耐药基因均阴性。经测序确认DC10、DC52均携带bla NDM-1基因,其中DC52同时携带bla TEM-1基因; DC44携带bla NDM-3基因,同时携带bla TEM-1基因和bla CTX-M-15基因。DC10、DC44、DC52均与J53接合成功,接合子为大肠埃希菌。接合子除对替加环素、阿米卡星敏感外,对β-内酰胺酶类和碳青霉烯类抗生素均耐药,接合子均含有与DC10、DC44、DC52相同的碳青霉烯酶基因。DC10的MLST分型为ST744、DC44为ST7219、DC52为ST167。ST744和ST167同属于CC10克隆群,ST7219属于CC131克隆群。结论耐碳青霉烯类抗生素大肠埃希菌的耐药基因为bla NDM基因,耐药基因bla NDM均能通过质粒水平传播。

猪源大肠埃希菌氯霉素类抗生素主要耐药基因的检测与分析

为查明辽宁地区猪源大肠埃希菌氯霉素类耐药菌株主要耐药基因的流行及分布情况,为猪大肠埃希菌病的防控提供科学依据,采用聚合酶链反应(PCR)对25株氯霉素类耐药菌株进行cat1、cmlA基因检测,并对cat1和cmlA基因进行序列分析。通过对耐药基因的检测发现,cat1、cmlA基因的检出率分别为32%和84%,8株同时检出cat1和cmlA基因。因此,在辽宁地区cmlA基因在猪源大肠埃希菌耐药菌株中普遍存在,cmlA介导的泵出机制是辽宁地区氯霉素类抗生素产生耐药性的主要原因;其次为cat1基因,与氯霉素乙酰转移酶的灭活有关。

空肠弯曲杆菌中喹诺酮类抗生素耐药基因检测与耐药性研究

目的：建立一种检测人粪便样本中，空肠弯曲杆菌含喹诺酮类抗生素耐药基因情况的实时荧光 PCR 方法，并对空肠弯曲杆菌对喹诺酮类抗生素耐药性与耐药基因的相关性进行初步研究。方法根据空肠弯曲杆菌对喹诺酮类抗生素耐药基因 gyrA 和 gyrB 序列设计引物，建立对应的实时荧光 PCR 方法，对79例空肠弯曲杆菌进行检测，基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。以药敏试验结果作为参照标准，对两种检测方法的结果进行统计学分析，计算实时荧光 PCR 的主要技术指标。结果22例（27.8％）空肠弯曲杆菌的实时荧光 PCR 出现特异性扩增曲线，扩增产物电泳结果显示其中13例携带 gyrA 基因（59.1％），7例携带 gyrB 基因（31.8％），2例同时携带 gyrA 和 gyrB 基因（9.1％）。药敏试验显示26例空肠弯曲杆菌为环丙沙星耐药型（32.9％）。统计学分析显示，两种方法的检测结果差异无统计学意义（χ^2＝1.125，P ＞0.05），一致性较好。实时荧光 PCR 法的灵敏度和特异度分别为76.9％和96.2％，总符合率为89.9％。结论实时荧光PCR 法能够检测空肠弯曲杆菌耐药基因 gyrA 和 gyrB。耐药基因与耐药型之间有所关联，需要进一步研究。

区域性耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌耐药基因型的分析

目的:分析区域耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌(carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae,CR-KPN)的耐药性及耐药基因型。方法:筛选黑龙江省医院2018年1月—2020年12月临床分离的菌株,通过BD Phoenix~(TM)-100全自动细菌鉴定、药敏系统细菌鉴定和药敏试验,改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)表型筛查CR-KPN36株,分析CR-KPN的临床分布特点、耐药特性及耐药基因型。结果:医院分离的CR-KPN主要来源于神经外科、ICU、康复科等,除氨基糖苷类和四环素类抗生素有一定抑制作用外,一、二、三、四代头孢菌素和碳青霉素类抗生素等β-内酰胺类抗生素耐药率接近100%,主要携带blaKPC基因型(97.22%)。结论:CR-KPN临床检出逐年增加,其耐药性强,临床抗感染难道大,需加强病原菌监测,并进行耐药基因检测,指导区域临床合理使用抗菌药物,做好院感防控。

大肠杆菌ydiB基因敲除和过表达对氨基糖苷类抗生素的耐受性分析

为了寻找新靶点解决抗生素滥用所造成的细菌耐药问题,通过比较氨基糖苷类抗生素(庆大霉素、妥布霉素、链霉素、阿米卡星、新霉素)、喹诺酮类抗生素(氧氟沙星、环丙沙星)和β-内酰胺类抗生素(氨苄西林、羧苄西林)对大肠杆菌野生型BW25113(WT)和ydiB基因敲除菌株(△ydiB)杀菌表型的差异,并且通过进一步测试以庆大霉素为代表的氨基糖苷类抗生素对过表达菌株BW25113-pCA24N和BW25113-pCA24N(ydiB)的杀菌表型,以此来确认ydiB基因对细菌耐药的重要性。结果表明:与大肠杆菌野生型BW25113(WT)相比,ydiB基因敲除菌株(△ydiB)仅对氨基糖苷类抗生素耐受,并且发现过表达菌株BW25113-PCA24N(ydiB)能恢复对庆大霉素的敏感性。因此,证明ydiB基因是氨基糖苷类抗生素作用的关键基因,有望成为氨基糖苷类抗生素作用的新靶点。

大肠杆菌四环素类抗生素主要耐药基因PCR检测方法的建立

本研究通过对tet(A)、tet(B)、tet(C)和tet(M)基因的序列分析,利用Primer Premier 5.0软件设计并合成了4对特异性引物,建立了四环素类抗生素主要耐药基因的PCR检测方法。通过反复试验确定这4对特异性引物的最佳退火温度均为55℃。灵敏性试验和特异性试验表明这4对特异性引物能够在核酸浓度分别为1.36、10.8、0.206和136 pg/μL时扩增出清晰地目的基因,并具有较高的特异性。稳定性与重复性试验表明本方法具有良好的稳定性。应用所建立的方法对25株辽宁地区猪源大肠杆菌中四环素类耐药菌株主要耐药基因进行检测分析,辽宁省猪源大肠杆菌中对四环素类的耐药性可能主要与tet(A)、tet(B)介导的主动外排机制有关,其次与tet(M)介导的核糖体保护机制有关。

革兰氏阳性菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制及基因同源性的分析

简述了几种常见革兰氏阳性菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制,利用DNAMAN软件分析革兰氏阳性菌间β-内酰胺类抗生素耐药基因的同源性,发现耐药基因在同属不同种的阳性菌间同源性高,但也有不同属间同源性高达95%的情况,为筛选细菌不同种属间具有代表性的耐药基因和后续研制耐药基因检测芯片奠定了基础。

基于全基因组测序的耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌耐药基因、毒力因子及同源性分析

目的通过应用全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)技术分析某三级医疗机构耐碳青霉烯类抗生素鲍曼不动杆菌(carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii,CRAB)的耐药基因、毒力因子及同源性。方法收集该院2020年1月至3月重症监护病房(Intensive care unit,ICU)、神经外科分离的11株医院感染CRAB菌株,通过二代测序平台进行全基因组测序,应用基因组流行病学中心(Center for genomic epidemiology,CGE)ResFinder 4.0软件分析其耐药基因型,并应用MORPHEUS在线制作热图,应用毒力因子数据库(virulence factors of pathogenic bacteria,VFDB)VFanalyzer软件筛选毒力因子,应用MLST软件检测菌株的ST型,应用Kaptive软件检测荚膜型,应用CSI Phylogeny 1.4软件及FigTree v1.4.4软件构建最大似然树(maximum likelihood tree,MLT)以分析其同源性。结果11株CRAB对亚胺培南、美罗培南、头孢菌素、环丙沙星均呈现耐药,而对阿米卡星、左氧氟沙星耐药的菌株株数较少。11株CRAB共检测出18种耐药基因,11株同时携带碳青霉烯酶耐药基因bla_(OXA-23)和bla_(OXA-66),β-内酰胺酶耐药基因以bla_(TEM-1D)和bla_(ADC-25)为主,大部分菌株携带多种外排泵相关耐药基因及抗菌药物修饰酶耐药基因。11株CRAB均携带多种毒力因子,包括外膜孔蛋白、脂多糖、生物膜、外排泵、磷脂酶和效应蛋白等,如OmpA、Lps、Csu、Pga、Ade、Plc、Bas、Bau、Ent、Hem、Aba、Bfm、Pbp和Kat等。11株CRAB均为ST2-K22型,同源性分析结果显示C组内同源性关系相近,存在院内传播的可能。结论该院CRAB的耐药性、毒力特征复杂多样,同源性分析显示该院存在1种优势克隆株,该克隆株有医院内传播的风险。

金霉素胁迫下室内粪土模型中菌群多样性与四环素类抗生素耐药基因丰度研究

【目的】探究金霉素在粪土环境中对土壤微生物群落结构多样性和四环素类耐药基因(TRG)丰度的影响。【方法】分别设置金霉素质量0(对照)、10、100、1 000μg作为胁迫剂量,在处理后第1、7、14、28、56天采集样品,使用高通量测序和q PCR技术研究群落结构多样性和TRG丰度的变化。【结果】厚壁菌门能耐受低剂量(10μg)金霉素的毒害作用,对中、高剂量(100、1 000μg)敏感;放线菌门能耐受中、高剂量的毒害作用,生存繁殖具有一定优势;变形菌门的相对丰度除第28天各剂量组均显著低于对照组外,其余时间多显著高于对照组。金霉素–猪粪–土壤模型样品中共检测出3种四环素类抗生素耐药基因(TRGs):tet O、tet T和tet W,3个基因丰度变化趋势相似:与第1天相比,第56天各组TRGs相对含量均显著减少;低剂量组TRGs相对含量的日消减率在Ⅱ期高于对照组和中、高剂量组,第7天TRGs相对含量显著高于对照组以及中、高剂量组;中剂量组TRGs相对含量的日消减率在Ⅳ期低于其余组,第56天TRGs相对含量显著高于其余组。【结论】在猪粪–土壤环境中,不同菌群对金霉素敏感程度不同,金霉素可改变优势菌群的相对丰度,从而引起菌群群落结构的变化。金霉素可改变TRGs相对含量的日消减率,从而影响TRGs相对含量。本研究可为下一步养殖源性抗菌药物残留的生态风险评估提供一定依据。

纤维结合蛋白基因在儿科A族β溶血性链球菌的分布及与大环内酯类抗生素耐药的关系

目的研究纤维结合蛋白基因在我国儿科A族β溶血性链球菌(GAS)中的分布及与大环内酯类耐药之间的关系。方法收集3所儿童医院191株病原菌株,48株健康携带株,采用琼脂稀释法测定5种大环内酯类抗生素的MIC值,确定其药物敏感性;PCR扩增及测序对菌株进行emm分型;PCR检测纤维结合蛋白基因prtF1、prtF2和大环内酯类抗生素耐药基因ermB、ermTR和mefA。结果分离株的ermB阳性的有186株,ermTR阳性的有11株,prtF1、prtF2及两者同为阳性的菌株携带率分别为67.36%、66.11%和59.00%,prtF1在病原菌株和健康携带株中没有差别,prtF2在健康分离株携带率高于病原菌株,prtF1、prtF2两者集中在emm12,emm22型菌株中阳性率高,而在emm1、emm4型中很少存在。prtF1和prtF2同时阳性在ermB阳性大环内酯类抗生素耐药菌株中更为常见。结论在我国儿科GAS分离株中,以共同携带prtF1/prtF2基因的emm12型菌株为主,多存在于健康儿童中,这可能是造成我国的GAS感染耐药水平高,而侵袭性不高的原因之一。