通瘀开窍与滋阴潜阳法对局灶性脑缺血再灌注后神经上皮干细胞巢蛋白表达的影响

目的:探讨通瘀开窍与滋阴潜阳对局灶性脑缺血再灌注后神经上皮干细胞巢蛋白(Nestin)表达的不同影响。方法:采用大脑中动脉线栓法造成局灶性脑缺血再灌注模型.应用免疫组织化学技术检测Nestin的表达,观察通瘀开窍方牛珀至宝微丸与滋阴潜阳药龟甲对脑缺血后Nestin的不同影响。结果:脑缺血再灌注后,通瘀开窍方与滋阴潜阳药缺血侧室管膜、室管膜下区、皮层和纹状体Nestin阳性细胞数显著多于缺血对照组(P<0.05),通瘀开窍方药对皮层和纹状体影响明显(P<0.05),而滋阴潜阳药对室管膜、室管模下区影响明显(P<0.05),两组方药神经病学评分明显低于缺血对照组(P<0.05),而以通瘀开窍方起效较早。结论:通瘀开窍方药治疗缺血性脑血管病的机理之一主要与其对脑缺血再灌注后皮层和纹状体Nestin的表达相关(P<0.05),而滋阴潜阳药治疗缺血性脑血管病的机理之一主要与其对脑缺血再灌注后室管膜、室管膜下区影响Nestin的表达相关。

EphA5介导胚胎中脑神经上皮干细胞向纹状体投射的实验研究

目的探讨轴突导向分子EphA5在胚胎中脑神经上皮干细胞向靶组织纹状体特异性投射中的作用。方法自孕11d大鼠取材胚胎中脑神经上皮干细胞并进行体外培养,应用免疫细胞化学的方法检测EphA5在神经上皮干细胞中的表达情况;取材鼠脑纹状体组织,应用冰冻切片、RT-PCR及Western-blot等方法检测EphA5的配体Ephrin-A5的特异表达情况;将胚胎中脑神经上皮干细胞与新生鼠纹状体组织块联合培养,观察细胞的靶向生长情况。结果体外培养的胚胎中脑神经上皮干细胞可明显向纹状体生长并呈EphA5阳性,靶区纹状体组织中可检测到其配体Ephrin-A5高表达。结论轴突导向分子EphA5受体及其配体Ephrin-A5可介导胚胎中脑神经上皮干细胞向纹状体组织的靶向生长。

神经上皮干细胞的分离培养及其体外分化特性的观察

目的探讨大鼠胚胎神经管神经上皮干细胞的分离培养条件,并观察其在体外的分化特性。方法采用显微解剖、机械吹打、无血清悬浮培养方法分离培养神经上皮干细胞,采用巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色技术检测神经上皮干细胞,用NSE和GFAP免疫组化染色检测并计数神经细胞和神经胶质细胞。结果大鼠胚胎神经管神经上皮干细胞在无血清培养基中可形成大量呈nestin抗原阳性细胞构成的神经球,经传代有血清培养后分化为NSE阳性和GFAP阳性细胞,其中NSE阳性细胞占细胞总数的47.7%,GFAP阳性细胞占细胞总数的39.8%。结论胎鼠神经管神经上皮干细胞在无血清培养中可增殖和传代,在有血清培养中可分化为神经细胞和神经胶质细胞,两者之比为47.7∶39.8。

神经上皮干细胞蛋白

1 概述 神经上皮干细胞蛋白(neuroepithelial stem cell protein )又名Nestin 蛋白,属于中间丝( intermediate filament, IF )的一种, 为第Ⅵ族,其相对分子质量是240 000,与神经丝密切相关,是胚胎中枢神经系统(CNS)主要的中间丝蛋白,主要表达于发育中的CNS 和骨骼肌,已经被广泛用作CNS中增殖前体细胞的标记物1～3,它对于神经干细胞的研究具有重要的意义.

血清浓度对雪旺细胞诱导神经上皮干细胞分化的影响

目的:探讨血清对雪旺细胞诱导神经上皮干细胞分化的影响。方法:从新生鼠坐骨神经及臂丛神经分离纯化雪旺细胞,从孕11.5 d大鼠胚胎分离培养神经上皮干细胞,含0%、1%、5%、10%胎牛血清的培养液联合培养雪旺细胞与神经上皮干细胞,收集上清作为条件培养液诱导神经上皮干细胞分化,1周后MAP-2和GFAP细胞免疫化学染色,显微镜下观察统计神经上皮干细胞分化为神经元与星形胶质细胞的比例。结果:条件培养液促进神经上皮干细胞存活和分化,分化形成的神经元大体形态与成熟神经元相似,0%、1%、5%、10%血清条件培养液组神经元与星形胶质细胞比例分别为1.53:1、1.13:1、1.03:1、0.75:1。结论:血清影响雪旺细胞诱导神经上皮干细胞向神经元分化,血清浓度增加,神经上皮干细胞分化形成的神经元减少。

离子通道蛋白在果蝇大脑神经上皮干细胞发育中的功能研究

离子通道蛋白作为神经系统的重要组成部分,在早期神经细胞发育中的作用却没有被研究过。基于神经发育在果蝇与小鼠间的保守性,果蝇幼虫大脑视觉中心可作为很好的模型来筛选参与神经干细胞行为调节的基因。文章通过体内RNA干扰和失活突变体来研究重要的钙离子通道和钾离子通道蛋白对神经干细胞的调节作用。结果表明,这些蛋白表达水平降低和shaker蛋白完全失活均对果蝇幼虫大脑神经干细胞的发育无影响。

携带绿色荧光蛋白基因的神经上皮干细胞移植治疗帕金森病

背景:神经干细胞异体移植的细胞替代疗法是治疗帕金森病的热点,但先前的研究重点关注移植细胞的形态学信息和动物的行为改变,作用机制尚未明确。目的:通过检测神经上皮干细胞脑内移植后帕金森病模型大鼠的旋转行为改变与其脑内多巴胺含量变化的关系,分析神经上皮干细胞移植治疗帕金森病的作用机制。方法:建立帕金森病大鼠模型,造模后分为2组,实验组将携带绿色荧光蛋白基因的胚胎神经上皮干细胞克隆后移植到帕金森病模型大鼠的纹状体内,对照组注射等量的生理盐水。取材后检测移植细胞的存活与分化,对比分析大鼠行为改变与其脑内多巴胺含量变化的关系。结果与结论:移植后实验组大鼠的旋转行为明显改善,移植细胞在宿主脑内存活良好,并分化出TH阳性细胞。实验组大鼠脑内多巴胺的含量明显高于对照组。提示携带绿色荧光蛋白基因的神经上皮干细胞脑内移植后帕金森病模型大鼠的旋转行为改善与其脑内多巴胺含量的变化成正比,分化出有功能的TH阳性细胞可能是神经干细胞移植治疗帕金森病的基本机制。

胚胎神经上皮干细胞脑内移植治疗大鼠帕金森病

背景:研究表明胚胎干细胞移植可改善血管性痴呆大鼠的学习记忆功能,增强神经的可塑性,诱导自身定向迁移并分化为成熟神经元。目的:观察胚胎神经上皮干细胞脑内移植治疗帕金森病大鼠及移植细胞的迁徙情况。方法:将绿色荧光蛋白转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞分别移植到帕金森病大鼠的黑质、纹状体和侧脑室内,移植后检测移植细胞的存活、迁徙与分化;利用高效液相色谱法检测实验动物脑内多巴胺神经递质的含量;对比实验动物旋转行为的改变,评估胚胎神经上皮干细胞移植对帕金森病大鼠的治疗作用。结果与结论:移植细胞存活良好且分化出了酪氨酸羟化酶阳性细胞,向黑质纹状体环路迁徙趋势明显;脑内多巴胺含量增加,动物旋转行为改善明显。表明移植到帕金森病大鼠脑内的神经上皮干细胞多向黑质纹状体环路迁徙,且可增加脑内多巴胺神经递质的含量治疗帕金森病。

胚胎神经上皮干细胞PD大鼠模型脑内移植的比较

目的观察胚胎神经上皮干细胞分别植入PD大鼠模型两侧纹状体内的存活、分化及对疾病的治疗情况。方法将GFP转基因鼠的胚胎神经上皮干细胞体外克隆增殖后,分别立体定向移植到PD模型鼠的毁损侧纹状体和健康侧纹状体内,术后观察动物的行为改变,分期取材后检测移植细胞的存活与分化状况,比较两种移植方式的治疗作用。结果移植后实验动物的旋转行为明显改善,移植细胞在宿主脑内存活良好,并分化出TH阳性神经元,损伤侧移植组效果更好。结论神经上皮干细胞植入损伤侧纹状体内的治疗效果更好。

诱导神经上皮干细胞的临床转化前景及挑战

诱导神经上皮干细胞(induced neuroepithelial stem cells,i NESCs)具有很强的增殖能力和分化潜能,具有重要的科学和临床应用价值。通过i NESCs自体移植产生功能性神经元,在治疗神经性疾病和神经损伤中具有广阔的前景。然而,当前只能通过外源基因过表达的方法获得灵长类i NESCs,这存在未知的安全风险。因此,通过小分子化合物、3D微环境、压力刺激等非外源基因导入法获得灵长类i NESCs显得重要而迫切。长期以来,大量的研究使用啮齿类动物模型来探索药物和细胞在体内的安全性和有效性,然而啮齿类动物与人存在的巨大物种差异导致很多研究在临床试验中失败。因此,借助与人类亲缘关系相近的非人灵长类动物进行研究,进而评估和测试i NESCs在体内的安全性和有效性,是推动人i NESCs进入临床转化更有效的方法。

鞘内注射黄芪注射液对大鼠局灶性脑缺血后神经干细胞的影响研究

目的探讨鞘内注射黄芪注射液对大鼠局灶性脑缺血后神经干细胞的影响。方法将80只健康SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、黄芪注射液鞘内注射组以及黄芪注射液腹腔注射组,每组20只。除假手术组外,其余组均建立大脑中动脉永久梗死性模型;黄芪注射液鞘内注射组和黄芪注射液腹腔注射组分别给予黄芪注射液鞘内注射和腹腔注射,假手术组和缺血再灌注组鞘内注射生理盐水,采用免疫组化法检测各组大鼠脑组织神经上皮干细胞蛋白(Nestin)表达情况。结果假手术组术后1 h、2 h、8 h、24 h神经功能评分均为0分,而缺血再灌注组、黄芪注射液鞘内注射组、黄芪注射液腹腔注射组随着术后时间的延长神经功能评分呈现降低的趋势,其中黄芪注射液鞘内注射组术后2 h、8 h、24 h神经功能评分均明显低于其他2组(P均<0.05),黄芪注射液腹腔注射组术后8 h、24 h神经功能评分均明显低于缺血再灌注组(P均<0.05);假手术组术后1 d、3 d、7 d脑组织Nestin阳性细胞数比较差异均无统计学意义(P均>0.05);缺血再灌注组术后3 d、7 d脑组织Nestin阳性细胞数明显少于假手术组(P均<0.05),黄芪注射液鞘内注射组、黄芪注射液腹腔注射组术后1 d、3 d、7 d脑组织Nestin阳性细胞数均显著多于缺血再灌注组(P均<0.05),且黄芪注射液鞘内注射组明显多于黄芪注射液腹腔注射组(P均<0.05)。结论鞘内注射黄芪注射液能够有效减轻局灶性脑缺血大鼠神经功能缺损程度,促进神经干细胞增殖。

左归丸对视神经夹伤大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的:观察左归丸对视神经夹伤大鼠视网膜神经节细胞的保护作用。方法:建立大鼠单侧视神经部分损伤模型。模型大鼠分别给予左归丸液4.0g/(kg·d)(治疗组)和等量生理盐水(损伤对照组)灌胃,采用免疫组织荧光技术于损伤后第1、2、4、8和16周检测受损眼视网膜神经节细胞数目及神经上皮干细胞蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达情况。结果:视神经夹伤后,大鼠视网膜节细胞数目减少,细胞排列疏松紊乱,在内、外网层和内核层可见裂隙形成,视网膜厚度较正常组变薄,以伤后第4周最为严重,神经节细胞减少约50%,至第8周后神经节细胞减少缓慢。视神经夹伤第2周时,nestin和GFAP表达明显升高,持续至损伤后第8周。Nestin和GFAP在视网膜全层均有表达,但在神经节细胞层、内网层和内核层表达最强,呈条带状弯曲或蛇样匍行;伤后第4周时表达最强,此后二者表达下降,至伤后第16周时,GFAP先于nestin蛋白降至正常水平。各时间点左归丸组神经节细胞存活数比损伤对照组增加,且细胞排列相对整齐;nestin和GFAP表达强度较损伤对照组增加(P<0.05)。结论:左归丸可能通过促进大鼠视网膜Mller细胞nestin和GFAP的表达,维持损伤后视网膜结构的完整性,从而间接减少节细胞凋亡,有效保护受损视网膜节细胞。

不同厚度神经球冰冻切片免疫荧光细胞化学染色结果的比较

目的探索适合免疫荧光细胞化学染色的神经球最佳冰冻切片厚度。方法选取悬浮培养10～12 d的神经球,制作厚度分别为4、7、10μm的冰冻切片。采用免疫荧光细胞化学染色比较神经球神经上皮干细胞蛋白(nestin)的表达和定位。结果培养10～12 d的神经球直径为200～250μm,状态良好,折光性强,呈圆球状,周边有毛刺。4μm的神经球冰冻切片制作较难,容易卷片,但细胞层次清楚,染色均匀,密疏适宜,可较清楚计数细胞。成像清楚。胞核清晰,可见较多nestin染色阳性的完整胞质包绕4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色阳性的胞核,能观察更多的细胞间细节。7μm切片较4μm切片制作容易,切片较平整,细胞层次不如4μm切片清楚,染色较均匀。所含细胞数较4μm多,可粗略计算细胞数。荧光拍照不能完全对焦,可见部分完整细胞形态。10μm的冰冻切片制作相对容易,切片平整,但细胞层次不清楚,堆叠严重,成像不清楚,难以看到完整细胞形态。结论 4μm厚度的神经球冰冻切片较适合进行免疫荧光细胞化学染色和分析。

大脑中动脉闭塞大鼠神经功能可塑性物质基础及电针作用的研究

目的探讨高血压大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）及电针对不同时间点神经功能影响及可能机制。方法采用易卒中型肾性高血压大鼠（RHRSP）,电凝法制备MCAO模型。随机分为MCAO假手术组、模型组、电针组。MCAO后各组分别于1d、7d、14d、28d进行神经前体细胞（NPCs）标记、神经功能缺损评分及电针治疗,在相应时间点处死取脑行病理学处理及免疫组化检查,并观察各组各时间点病灶周围5-溴脱氧核苷尿嘧啶（BrdU）、神经上皮干细胞蛋白（Nestin）、胶原纤维酸性蛋白（GFAP）及生长相关蛋白43（GAP-43）的阳性细胞数。结果电针组7d、14d神经功能评分均高于模型组（P〈0.05）,两组均于28d恢复正常。急性脑梗死灶周增殖细胞数目明显增加,且梗死灶边缘Nestin、GAP-43及GFAP细胞在7d为高峰期。各时间点电针组BrdU、Nestin及GAP-43细胞数明显增加（P〈0.05）,1周末达到高峰。MCAO后各时间点病灶周围GFAP细胞数均增加（P〈0.05）,7d时电针组明显低于模型组（P〈0.05）,仍在1周时细胞数最多。结论急性脑梗死大鼠神经功能障碍在4周可恢复,电针治疗1～2周有促进作用。脑梗死及电针治疗后神经前体细胞、神经干细胞及生长相关蛋白以及星形胶质细胞发生相应变化,构成神经功能可塑性的物质基础,可能是各种治疗措施发挥作用的前提。

ICR小鼠神经干细胞的诱导分化及鉴定

目的建立一种小鼠神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)的快速诱导分化方法并鉴定诱导分化后的细胞类型。方法将消化后的单细胞在经Matrigel铺底的盖玻片上进行接种,使用倒置显微镜观察诱导分化后不同时间点的细胞形态变化,并采用神经上皮干细胞蛋白(neuroepithelial stem cell protein,Nestin)、微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫细胞化学鉴定分化后的细胞类型。结果(1)Nestin阳性细胞在神经球中数量较多,随着诱导分化时间的延长,Nestin阳性细胞逐渐减少,各组间阳性细胞率和各组间两两比较差异均有统计学意义(F=663.680,P<0.05);(2)MAP2阳性细胞仅在神经球中央少量存在,随着诱导分化时间的延长,MAP2阳性细胞逐渐增多。各组间MAP2阳性细胞率的差异有统计学意义,两两比较,2 d组和3 d组间的差异无统计学意义,其他各组间差异均有统计学意义(F=135.049,P<0.05);(3)GFAP阳性细胞在神经球中较多,随着诱导分化时间的延长,GFAP阳性细胞逐渐减少。各组间阳性细胞率和各组间两两比较,差异均有统计学意义(F=36.915,P<0.05)。结论本研究所采用的诱导方法可诱导NSCs快速向神经元分化。

抗炎治疗促进脑梗死后脑内神经发生和功能恢复的实验研究

目的探讨米诺环素对大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠的神经保护作用及潜在的促神经发生作用。方法电凝法制备MCAO模型。实验大鼠随机分为假手术组、MCAO模型组及抗炎组后分别给予相应处理,于2周行转子杆、爬梯实验以及水迷宫测试评价运动及认知功能,并通过病理学处理及免疫组化检测对比各组各时间点梗死灶周5-溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)、神经上皮干细胞蛋白(Nestin)、胶原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞计数。组间比较用单因素方差分析,两两比较用t检验。结果与模型组相比,急性期米诺环素短期治疗并不能明显减小梗死面积,但运动功能、空间学习及记忆能力均有所恢复(P<0.05)。抗炎组BrdU、Nestin以及GFAP阳性细胞数较对照组增加(P<0.05),BrdU、GFAP阳性细胞呈增加趋势,2周时增加最为明显;Nestin阳性细胞1周达高峰,之后逐渐下降。结论脑梗死急性期米诺环素治疗可能通过促进神经发生过程补偿、修复局部病灶的功能损伤与缺失,从而促进脑梗死大鼠神经功能恢复。

Chop及Grp78基因在先天性脊柱裂大鼠胚胎12天神经管中的异常表达

目的探讨Chop及Grp78基因在先天性脊柱裂大鼠胚胎12d神经管及神经上皮干细胞中的表达情况。方法取畸形大鼠12d胚胎神经管组织，荧光实时定量PCR考察Chop及Grp78基因表达。另取12d正常大鼠胚胎，分离消化神经管行神经上皮干细胞培养。荧光实时定量PCR考察Chop及Grp78基因表达。结果先天性脊柱裂大鼠胚胎12d神经管内Chop基因及Grp78基因表达异常增高。神经上皮干细胞分化为神经元后Chop及Grp78基因的表达上调。结论Chop及Grp78基因在先天性脊柱裂大鼠胚胎12d神经管中表达异常增高，二者在神经上皮干细胞分化为神经元后表达上调，可能与内质网应激相关的凋亡有关。神经上皮干细胞培养培养体系稳定、高效，可以为胚胎早期发育提供实验模型。

OAZ在果蝇大脑发育中的功能研究

OAZ基因编码在进化上保守的C2H2型O/E相关锌指蛋白,参与基因转录的调控。TGF-β信号传导通路中OAZ通过与SMAD4/R-SMAD结合形成转录复合物发挥作用;Olf1/EBF作为转录因子与OAZ相互作用来调控嗅觉上皮细胞和B淋巴细胞的分化。此外,OAZ是JAK/STAT信号通路的下游候选靶基因。但是迄今为止OAZ在果蝇大脑发育的功能还没有研究。果蝇大脑视叶作为一个相对简易操作的模型为我们揭示早期神经干细胞的增殖和转化机制创造了条件,为加快理解哺乳动物早期神经发生过程以及进一步开展神经干细胞治疗提供可能。本研究通过RNA干扰来研究OAZ在果蝇大脑发育中的作用。我们的初步实验结果表明,OAZ对果蝇大脑视叶神经上皮细胞的维持可能不是必需的,OAZ对果蝇大脑视叶神经板和脑髓神经节的发育也可能不是必需的。