神经上皮干细胞蛋白

1 概述 神经上皮干细胞蛋白(neuroepithelial stem cell protein )又名Nestin 蛋白,属于中间丝( intermediate filament, IF )的一种, 为第Ⅵ族,其相对分子质量是240 000,与神经丝密切相关,是胚胎中枢神经系统(CNS)主要的中间丝蛋白,主要表达于发育中的CNS 和骨骼肌,已经被广泛用作CNS中增殖前体细胞的标记物1～3,它对于神经干细胞的研究具有重要的意义.

鞘内注射黄芪注射液对大鼠局灶性脑缺血后神经干细胞的影响研究

目的探讨鞘内注射黄芪注射液对大鼠局灶性脑缺血后神经干细胞的影响。方法将80只健康SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、黄芪注射液鞘内注射组以及黄芪注射液腹腔注射组,每组20只。除假手术组外,其余组均建立大脑中动脉永久梗死性模型;黄芪注射液鞘内注射组和黄芪注射液腹腔注射组分别给予黄芪注射液鞘内注射和腹腔注射,假手术组和缺血再灌注组鞘内注射生理盐水,采用免疫组化法检测各组大鼠脑组织神经上皮干细胞蛋白(Nestin)表达情况。结果假手术组术后1 h、2 h、8 h、24 h神经功能评分均为0分,而缺血再灌注组、黄芪注射液鞘内注射组、黄芪注射液腹腔注射组随着术后时间的延长神经功能评分呈现降低的趋势,其中黄芪注射液鞘内注射组术后2 h、8 h、24 h神经功能评分均明显低于其他2组(P均<0.05),黄芪注射液腹腔注射组术后8 h、24 h神经功能评分均明显低于缺血再灌注组(P均<0.05);假手术组术后1 d、3 d、7 d脑组织Nestin阳性细胞数比较差异均无统计学意义(P均>0.05);缺血再灌注组术后3 d、7 d脑组织Nestin阳性细胞数明显少于假手术组(P均<0.05),黄芪注射液鞘内注射组、黄芪注射液腹腔注射组术后1 d、3 d、7 d脑组织Nestin阳性细胞数均显著多于缺血再灌注组(P均<0.05),且黄芪注射液鞘内注射组明显多于黄芪注射液腹腔注射组(P均<0.05)。结论鞘内注射黄芪注射液能够有效减轻局灶性脑缺血大鼠神经功能缺损程度,促进神经干细胞增殖。

左归丸对视神经夹伤大鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的:观察左归丸对视神经夹伤大鼠视网膜神经节细胞的保护作用。方法:建立大鼠单侧视神经部分损伤模型。模型大鼠分别给予左归丸液4.0g/(kg·d)(治疗组)和等量生理盐水(损伤对照组)灌胃,采用免疫组织荧光技术于损伤后第1、2、4、8和16周检测受损眼视网膜神经节细胞数目及神经上皮干细胞蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达情况。结果:视神经夹伤后,大鼠视网膜节细胞数目减少,细胞排列疏松紊乱,在内、外网层和内核层可见裂隙形成,视网膜厚度较正常组变薄,以伤后第4周最为严重,神经节细胞减少约50%,至第8周后神经节细胞减少缓慢。视神经夹伤第2周时,nestin和GFAP表达明显升高,持续至损伤后第8周。Nestin和GFAP在视网膜全层均有表达,但在神经节细胞层、内网层和内核层表达最强,呈条带状弯曲或蛇样匍行;伤后第4周时表达最强,此后二者表达下降,至伤后第16周时,GFAP先于nestin蛋白降至正常水平。各时间点左归丸组神经节细胞存活数比损伤对照组增加,且细胞排列相对整齐;nestin和GFAP表达强度较损伤对照组增加(P<0.05)。结论:左归丸可能通过促进大鼠视网膜Mller细胞nestin和GFAP的表达,维持损伤后视网膜结构的完整性,从而间接减少节细胞凋亡,有效保护受损视网膜节细胞。

不同厚度神经球冰冻切片免疫荧光细胞化学染色结果的比较

目的探索适合免疫荧光细胞化学染色的神经球最佳冰冻切片厚度。方法选取悬浮培养10～12 d的神经球,制作厚度分别为4、7、10μm的冰冻切片。采用免疫荧光细胞化学染色比较神经球神经上皮干细胞蛋白(nestin)的表达和定位。结果培养10～12 d的神经球直径为200～250μm,状态良好,折光性强,呈圆球状,周边有毛刺。4μm的神经球冰冻切片制作较难,容易卷片,但细胞层次清楚,染色均匀,密疏适宜,可较清楚计数细胞。成像清楚。胞核清晰,可见较多nestin染色阳性的完整胞质包绕4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色阳性的胞核,能观察更多的细胞间细节。7μm切片较4μm切片制作容易,切片较平整,细胞层次不如4μm切片清楚,染色较均匀。所含细胞数较4μm多,可粗略计算细胞数。荧光拍照不能完全对焦,可见部分完整细胞形态。10μm的冰冻切片制作相对容易,切片平整,但细胞层次不清楚,堆叠严重,成像不清楚,难以看到完整细胞形态。结论 4μm厚度的神经球冰冻切片较适合进行免疫荧光细胞化学染色和分析。

大脑中动脉闭塞大鼠神经功能可塑性物质基础及电针作用的研究

目的探讨高血压大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）及电针对不同时间点神经功能影响及可能机制。方法采用易卒中型肾性高血压大鼠（RHRSP）,电凝法制备MCAO模型。随机分为MCAO假手术组、模型组、电针组。MCAO后各组分别于1d、7d、14d、28d进行神经前体细胞（NPCs）标记、神经功能缺损评分及电针治疗,在相应时间点处死取脑行病理学处理及免疫组化检查,并观察各组各时间点病灶周围5-溴脱氧核苷尿嘧啶（BrdU）、神经上皮干细胞蛋白（Nestin）、胶原纤维酸性蛋白（GFAP）及生长相关蛋白43（GAP-43）的阳性细胞数。结果电针组7d、14d神经功能评分均高于模型组（P〈0.05）,两组均于28d恢复正常。急性脑梗死灶周增殖细胞数目明显增加,且梗死灶边缘Nestin、GAP-43及GFAP细胞在7d为高峰期。各时间点电针组BrdU、Nestin及GAP-43细胞数明显增加（P〈0.05）,1周末达到高峰。MCAO后各时间点病灶周围GFAP细胞数均增加（P〈0.05）,7d时电针组明显低于模型组（P〈0.05）,仍在1周时细胞数最多。结论急性脑梗死大鼠神经功能障碍在4周可恢复,电针治疗1～2周有促进作用。脑梗死及电针治疗后神经前体细胞、神经干细胞及生长相关蛋白以及星形胶质细胞发生相应变化,构成神经功能可塑性的物质基础,可能是各种治疗措施发挥作用的前提。

ICR小鼠神经干细胞的诱导分化及鉴定

目的建立一种小鼠神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)的快速诱导分化方法并鉴定诱导分化后的细胞类型。方法将消化后的单细胞在经Matrigel铺底的盖玻片上进行接种,使用倒置显微镜观察诱导分化后不同时间点的细胞形态变化,并采用神经上皮干细胞蛋白(neuroepithelial stem cell protein,Nestin)、微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫细胞化学鉴定分化后的细胞类型。结果(1)Nestin阳性细胞在神经球中数量较多,随着诱导分化时间的延长,Nestin阳性细胞逐渐减少,各组间阳性细胞率和各组间两两比较差异均有统计学意义(F=663.680,P<0.05);(2)MAP2阳性细胞仅在神经球中央少量存在,随着诱导分化时间的延长,MAP2阳性细胞逐渐增多。各组间MAP2阳性细胞率的差异有统计学意义,两两比较,2 d组和3 d组间的差异无统计学意义,其他各组间差异均有统计学意义(F=135.049,P<0.05);(3)GFAP阳性细胞在神经球中较多,随着诱导分化时间的延长,GFAP阳性细胞逐渐减少。各组间阳性细胞率和各组间两两比较,差异均有统计学意义(F=36.915,P<0.05)。结论本研究所采用的诱导方法可诱导NSCs快速向神经元分化。

抗炎治疗促进脑梗死后脑内神经发生和功能恢复的实验研究

目的探讨米诺环素对大脑中动脉闭塞(MCAO)大鼠的神经保护作用及潜在的促神经发生作用。方法电凝法制备MCAO模型。实验大鼠随机分为假手术组、MCAO模型组及抗炎组后分别给予相应处理,于2周行转子杆、爬梯实验以及水迷宫测试评价运动及认知功能,并通过病理学处理及免疫组化检测对比各组各时间点梗死灶周5-溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)、神经上皮干细胞蛋白(Nestin)、胶原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞计数。组间比较用单因素方差分析,两两比较用t检验。结果与模型组相比,急性期米诺环素短期治疗并不能明显减小梗死面积,但运动功能、空间学习及记忆能力均有所恢复(P<0.05)。抗炎组BrdU、Nestin以及GFAP阳性细胞数较对照组增加(P<0.05),BrdU、GFAP阳性细胞呈增加趋势,2周时增加最为明显;Nestin阳性细胞1周达高峰,之后逐渐下降。结论脑梗死急性期米诺环素治疗可能通过促进神经发生过程补偿、修复局部病灶的功能损伤与缺失,从而促进脑梗死大鼠神经功能恢复。