大鼠视网膜缺血-再灌注损伤后视觉传导通路中神经丝蛋白200的表达

背景神经丝蛋白200（NF200）是特异性分布于神经元轴突内，维持神经元形态、反映其功能、检测轴突再生状况的一个间接指标。NF200是否参与了视网膜缺血-再灌注损伤（RIRI）后整个视觉传导通路的异常变化有待进一步研究。目的研究RIRI后各时间点大鼠视觉传导通路中视网膜、外侧膝状体、上丘脑及视皮质等部位NF200的表达。方法应用随机数字表法将40只SD大鼠随机分为RIRI1、2、3、4、6、8周组，伪手术组和正常对照组，每组5只大鼠。RIRI组采用前房灌注生理盐水法制作RIRI模型，以右眼为损伤眼；伪手术组仅行前房穿刺而不灌注生理盐水。于RIRI后1、2、3、4、6、8周处死大鼠，摘除大鼠眼球，并取外侧膝状体、上丘脑及视皮质组织制备冰冻切片，采用免疫组织化学法检测NF200在上述大鼠各部位神经元及轴突中的表达。结果大鼠RIRI1、2、3、4、6、8周组、伪手术组和正常对照组损伤眼视网膜神经节细胞（RGCs）层NF200的表达量（A值）总体比较差异有统计学意义（F=78．855，P=0．000），其中RIRI1周组NF200表达较正常对照组明显减少，差异有统计学意义（t=36．563，P〈0．01）。RIRI1周后可见损伤眼对侧外侧膝状体NF200的表达较正常对照组明显减少，差异有统计学意义（t=6．483，P〈0．01），而损伤4周、6周后对侧外侧膝状体NF200的表达较正常对照组明显增加，差异有统计学意义（t=2．904、4．313，P〈0．01）。RIRI1周可见损伤眼对侧上丘脑NF200的表达较正常对照组明显减少，差异有统计学意义（t=2．966，P〈0．05），2周对侧上丘脑NF200的表达较正常对照组明显增加，差异有统计学意义（t=7．397，P〈0．01）。RIRI2、3、4周后双侧视皮质NF200的表达较正常对照组明显增加，差异均有统计学意义（对侧：t=18．728、18．213、15．088，P〈0．01；同侧：t=8．690、5．704、7．805，P〈0．01）。结论RIRI可造成损伤眼的RGCs、对侧外侧膝状体、上丘脑及双侧视皮质神经元轴突的损伤。

脂肪来源干细胞移植促进大鼠脑梗死周边区皮质结直肠癌缺失蛋白(DCC)和神经丝蛋白200(NF-200)的表达

目的研究脂肪来源干细胞(ADSC)移植对大鼠脑梗死周边区皮质中结直肠癌缺失蛋白(DCC)和神经丝蛋白200(NF-200)表达的影响。方法 SD大鼠随机分为假手术组、模型组和ADSC组。采用改良Longa线栓法制备大鼠大脑中动脉闭塞脑梗死模型。ADSC组大鼠于造模后24 h经颈动脉注射入50μL用PKH-26标记的ADSC悬液(含约2×10^6个细胞),模型组大鼠注射等剂量的生理盐水。于造模后第7、14天,在荧光显微镜下观察脑组织中ADSC的迁移情况,采用Western blot法检测脑梗死周边区皮质DCC、 NF-200的蛋白水平,免疫荧光法检测脑梗死周边区皮质中DCC、NF-200的表达和分布。结果 ADSC组大鼠脑组织中可检测到PKH-26标记的ADSC,且大部分位于脑梗死周边区皮质中。造模后第7、14天,模型组DCC的表达均高于假手术组,而NF-200的表达均低于假手术组;ADSC组DCC和NF-200的表达在各个时间点均高于模型组。在梗死周边区皮质, DCC主要表达于NF-200阳性的神经元轴突中。结论经颈动脉移植的ADSC可以迁移至脑梗死周边区皮质,并可能通过促进该区域DCC、NF-200的表达,从而强化神经轴突的再生修复。

植入式皮质电刺激缺血性脑卒中大鼠皮质神经丝蛋白200的表达

背景:前期研究中发现单独皮质电刺激治疗16d能改善脑卒中后的运动功能障碍,增加梗死灶周围皮质微管相关蛋白2的表达。目的:观察植入式皮质电刺激对缺血性脑卒中模型大鼠皮质神经丝蛋白200表达的影响。方法:建立SD大鼠右侧大脑中动脉缺血性脑卒中模型,随机分成电刺激组和非刺激组,两组造模1周后植入电刺激器,电极放置在脑梗死区边缘皮质表面,电刺激组施加电刺激,非刺激组不施加电刺激。植入14d后终止电刺激,6周后用免疫荧光染色和免疫荧光图像分析系统定量分析梗死灶周边、梗死对侧皮质神经丝蛋白200的表达水平。结果与结论:与非刺激组比较,电刺激组梗死灶周边、梗死对侧皮质神经丝蛋白200表达水平均较高(P<0.05)。表明皮质电刺激可增加梗死灶周边及梗死对侧皮质神经丝蛋白200的表达,诱导双侧皮质神经元轴突的可塑性改变。

射频热凝对兔半月神经节神经丝蛋白200表达的影响

目的:研究不同温度与持续时间射频热凝对兔半月神经节神经丝蛋白200(neurofilament 200,NF200)的影响。方法:利用射频热凝技术,对80只兔半月神经节分别进行60、70和80℃温控热凝毁损实验,于术后第1、7、14和28天取出受损的半月神经节。HE染色阳性者,观察毁损后神经丝蛋白表达情况。结果 :同一温度下,射频持续时间相同时,随术后时间的增加,NF200阳性表达率逐渐增高;而射频持续1 min与3 min比较,该指标阳性表达率差异均无统计学意义(均P>0.05)。射频持续时间相同时,70℃与60℃比较,阳性表达率均明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);而70℃与80℃比较,阳性表达率差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论:当射频毁损温度为70℃左右时,对半月神经节杀伤力最大,神经活性明显降低;这可能是半月神经节毁损的较适宜的温度。

督脉电针对脊髓损伤大鼠脊髓神经连接蛋白1和神经丝蛋白200的影响

目的:通过观察督脉电针对脊髓损伤(SCI)大鼠脊髓中A2型星形胶质细胞(A2s)、A1型星形胶质细胞(A1s)和轴突再生标记物神经丝蛋白200(NF-200)、突触再生标记物神经连接蛋白1(NL1)表达及尼氏体生成情况的影响,探讨督脉电针治疗SCI的可能机制。方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组、中和抗体组、电针组、电针+中和抗体组,每组15只。采用无限视野撞击法建立SCI大鼠模型。中和抗体组与电针+中和抗体组在大鼠造模损伤后即刻注射白细胞介素(IL)-1α、肿瘤坏死因子(TNF)-α、C1q 3种中和抗体。电针组与电针+中和抗体组电针“大椎”“命门”,每次20 min,每日1次,连续治疗28 d。分别于第1、7、14、21、28天进行BBB评分;免疫荧光染色法检测各组大鼠脊髓组织A2s特异性标记物S100a10与GFAP共表达情况,A1s特异性标记物C3表达情况;Western blot法和免疫组织化学法检测大鼠脊髓组织NF-200及NL1表达情况;尼氏染色法观察大鼠脊髓神经元再生情况。结果:与假手术组比较,各时点模型组大鼠BBB评分下降(P<0.01);与模型组比较,造模第7、14、21、28天,中和抗体组、电针组、电针+中和抗体组BBB评分显著升高(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,中和抗体组、电针组、电针+中和抗体组脊髓组织中GFAP与A2s标记物S100a10双标荧光表达强度升高(P<0.05,P<0.01);电针组A1s标记物C3荧光强度显著降低(P<0.01)。与假手术组比较,模型组脊髓组织NF-200蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,电针组与电针+中和抗体组脊髓组织中NL1蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01),电针+中和抗体组中NF-200蛋白表达升高(P<0.01)。与假手术组比较,模型组脊髓组织NL1、NF-200阳性表达降低(P<0.01);与模型组比较,中和抗体组、电针组、电针+中和抗体组NL1、NF-200阳性表达升高(P<0.01);与中和抗体组比较,电针组和电针+中和抗体组中NF-200阳性表达升高(P<0.01)。与假手术组比较,模型组脊髓组织尼氏体数目减少;与模型组比较,中和抗体组、电针组、电针+中和抗体组尼氏体数目增加。结论:督脉电针能够促进A2s激活,这可能是其促进SCI后大鼠轴突、突触的再生的原因之一。

梓醇配伍大黄素对实验性自身性免疫性脑脊髓炎小鼠大脑内神经丝蛋白200和髓鞘碱性蛋白的影响

目的:观察梓醇配伍大黄素对实验性自身性免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠大脑内神经丝蛋白(NF)200和髓鞘碱性蛋白(MBP)表达的影响,讨论梓醇配伍大黄素减轻EAE小鼠大脑内轴突及髓鞘损伤的机制。方法:将80只6~8周龄C57BL/6j小鼠随机分为4组,正常组、模型组、激素组和配伍组各20只,除正常组外,其余3组小鼠背部脊柱旁皮下四点注射抗原髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)诱导产生EAE,观察各组小鼠神经功能缺损严重程度,于发病高峰期(第18天)及缓解期(第40天)取小鼠大脑组织。透射电子显微镜(TEM)观察小鼠大脑髓鞘、轴突微结构病理改变。免疫组化(IHC)技术检测小鼠大脑NF200和MBP表达水平。结果:与模型组比较,配伍组在第21天,27天至39天神经功能功能损伤评分降低(P<0.05)。TEM显示激素组与配伍组髓鞘环形层状结构松散变形程度均较模型组减轻;第18、40天,模型组NF200及MBP积分光密度值显著低于正常组(P<0.01),激素组及配伍组NF200及MBP积分光密度值显著高于模型组(P<0.01,P<0.05)。第40天,激素组MBP积分光密度值显著低于正常组(P<0.05)。结论:梓醇配伍大黄素能够减轻EAE小鼠神经功能缺损,增加潜伏期,减少轴突和髓鞘的损伤。

大鼠脊髓半切损伤后外源性NEP1-40对神经中丝NF200表达的影响

目的探讨外源性Nogo受体拮抗剂(NEP1-40)在脊髓损伤修复过程中的作用及机制。方法将60只雌性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组和治疗组各20只。后两组均建立大鼠T10脊髓右侧半横断损伤模型,治疗组通过损伤处置管从术后第1天开始每天予NEP1-4015μg溶于PBS缓冲液25μl,连续7d;模型组予等量的PBS缓冲液;假手术组仅去除椎板,不做脊髓半横断,术后不埋管,不用药。分别于术后7、14、21、28d采用Basso-Beattie-Bresnahan运动(BBB)评分法行大鼠行为学表现评分,免疫组化染色法检测受损节段脊髓中NF200的表达。结果治疗组各个时间点的BBB评分均高于模型组,NF200阳性细胞的数目均高于模型组(P均<0.05)。BBB评分与NF200阳性细胞数量呈明显正相关(r=0.937,P<0.01)。结论脊髓损伤后注射NEP1-40可增加NF200阳性神经元数目,促进轴突再生及运动功能恢复。

FK506对大鼠弥漫性轴索损伤后神经元凋亡及轴突再生相关蛋白表达的影响

目的研究FK506对大鼠弥漫性轴索损伤后神经元凋亡及轴突再生相关蛋白神经丝蛋白200(NF200)、神经生长相关蛋白43(GAP-43)、凋亡相关蛋白激酶1(DAPK1)表达的影响。方法通过头颅瞬间旋转损伤装置建立大鼠弥漫性轴索损伤模型,90只SD成年雄性大鼠随机分为假手术组、DAI模型组、FK506干预组(各组又分为6h、1d、7d亚组,各组n=10);各组于预定时间点采用mNSS法评估神经功能,免疫组化染色法检测DAPK1、NF200的表达变化,Western blot法检测GAP-43的表达变化、TUNEL检测神经元凋亡,实验数据以均数±标准差记录,使用统计学SPSS 18.0软件进行单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果 FK506干预组较DAI组损伤后的NF200标记轴索病理改变显示,形成轴索肿胀、轴索球数目明显降低;FK506干预组较DAI组各时间点DAPK1蛋白表达明显降低,神经元凋亡数目明显减少,GAP-43、NF200蛋白表达明显升高。结论 FK506能够在DAI后减少神经元细胞凋亡与轴索病理改变,减轻神经组织损伤;FK506能够加速神经元再生,促进脑组织损伤的修复。

HIF-1α基因修饰神经干细胞移植对大鼠损伤脊髓NF200和GFAP表达的影响

目的研究低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因修饰的神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤后神经丝蛋白200(NF200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响及意义。方法采用电控脊髓损伤打击装置制作大鼠脊髓损伤模型。按随机数字表将120只SD大鼠平均分为4组:假手术组(Sham组),单纯损伤组(SCI组),神经干细胞组(NSC组)和HIF-1α基因修饰NSC组(HIF-NSC组)。应用免疫组化法检测受伤脊髓中HIF-1α、NF200和GFAP的表达。结果HIF-NSC组中HIF-1α免疫阳性细胞平均光密度值比其他各组各时间点均高(P<0.01),且表达高峰延迟至移植后14 d;除第1天外,HIF-NSC组NF200表达比SCI组和NSC组明显增高(P<0.05),移植后28 dNF200免疫阳性轴突数目也比SCI组和NSC组明显增多(P<0.01);移植后7 d、14 d、28 dGFAP免疫阳性细胞面积均比SCI组和NSC组明显减少(P<0.01)。结论HIF-1α基因修饰NSC移植可引起HIF-1α在损伤脊髓内有效表达,且能明显的促进NF200的表达,并能在脊髓损伤的后期抑制GFAP的表达。这提示HIF-1α基因修饰的NSC移植可减少受伤脊髓中胶质细胞的增生和胶质疤痕的形成,促进轴突再生。

BMP7蛋白对大鼠急性脊髓损伤后神经元修复作用的研究

目的探索骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP7)是否具有促进大鼠急性脊髓损伤后神经元修复的作用。方法实验大鼠分为阴性对照组(negative control,NC)和BMP7实验组,以Allen's打击法建立大鼠脊髓损伤模型,BMP7组大鼠每天在脊髓损伤处注射50ng BMP7蛋白,连续7天,NC组对应注射等体积的0.9%氯化钠注射液。两组大鼠分别于术后6小时、3天、1周、2周、4周、8周进行HE染色以观察脊髓损伤处病理学改变;两组大鼠分别于术后6小时、3天、1周、2周、4周、8周进行免疫组化实验以检测损伤节段脊髓神经丝蛋白200(neurofilament protein 200,NF200)、胶质纤微酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)及突触素(Synaptophysin,SYP)蛋白表达水平。结果 HE染色结果表明两组大鼠造模后脊髓损伤处神经元数量减少,神经突触数量减少,尼式体淡染且数量减少,组织中可见空洞形成,1周后,BMP7实验组大鼠脊髓损伤处尼式体染色逐渐加深,神经突触数量增多,变化较NC组明显。免疫组化结果表明BMP7实验组大鼠NF200阳性表达细胞数造模3天后逐渐增多,至第4周时达到高峰,且在1周、2周、4周及8周时均大于NC组;BMP7实验组及NC组术后GFAP阳性表达细胞数变化均不明显,且两组阳性细胞数差异不显著;BMP7实验组大鼠SYP阳性表达细胞数造模3天后逐渐增多,且在1周、2周、4周及8周时均大于NC组。结论 BMP7蛋白可以促进大鼠脊髓损伤后神经元的修复。

慢病毒介导骨形态发生蛋白7基因转染诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景:骨髓间充质干细胞具备向神经元样细胞分化的潜能,已经被列为治疗脊髓损伤的首选干细胞,但其分化效率低,寻找一种具有高效诱导能力的因子尤为重要。基于文献查阅及课题组研究基础,推测骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP-7)基因可能在促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化上发挥着重要作用。目的:探讨骨形态发生蛋白7慢病毒载体转染诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的作用。方法:采用全骨髓贴壁法培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,以感染复数为50,25,10,1进行LV-GFP转染,转染后3 d在荧光倒置显微镜下观察各组GFP表达情况,确定最佳感染复数。取第3代骨髓间充质干细胞,分为空白对照组(常规培养)、LV-GFP组、LV-BMP-7-GFP组,以最佳感染复数转染24,48,72,96,120 h后,采用MTT法检测细胞存活率;转染3 d后,采用免疫细胞化学实验检测神经细胞标记物神经丝蛋白200、突触素1表达。结果与结论:①LV-GFP转染后3 d,感染复数为1组未见GFP阳性细胞,感染复数为10,25,50组可见GFP阳性细胞,其中感染复数为10组平均荧光强度高于其余组(P<0.05),为最适感染复数;②空白对照组、LV-GFP组神经丝蛋白200、突触素1表达呈阴性;LV-BMP-7-GFP组神经丝蛋白200、突触素1表达呈阳性,胞体和轴突被染成亮棕黄色;③结果表明,LV-BMP-7转染可促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化。

骨形态发生蛋白7促进大鼠急性脊髓损伤后神经功能修复的研究

目的探讨骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP7)是否具有促进大鼠急性脊髓损伤后神经功能修复的作用。方法清洁级Wistar大鼠分为假手术组(SO组)、阴性对照组(NC组)和BMP 7实验组。假手术组仅暴露第10胸椎硬脊膜,但并不对其进行损伤。NC组以Allences′s打击器进行第10胸椎脊髓损伤模型,造模成功后,每天给第10胸椎硬脊膜处注射生理盐水,连续7天。BMP7组造模成功后,每天给损伤处注射BMP 7蛋白50 ng,连续7天。各组分别于术后6小时、3天、1周、2周、4周和8周进行BBB量表评分及利用Western blot检测损伤节段脊髓神经丝蛋白200 (neurofilament protein200, NF200)及胶质纤微酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达量的变化,于术后1周和8周采用生物信号采集和处理系统检测运动诱发电位(MEP)。结果 BBB评分结果显示SO组后肢运动功能基本正常。NC组和BMP 7组后肢运动功能在术后完全丧失,3天后逐渐恢复,在1周、2周、4周和8周,BMP 7组的BBB评分均高于NC组(P <0.05)。神经电生理测试结果显示,SO组胸10水平的MEP波形为正常,即P1-N1-P2。术后1周NC组和BMP 7组MEP波N1波均低于正常值,术后8周BMP 7组和NC组以M形双峰波为主,且前者波幅高于后者,但其较术后1周都明显增高。WesternBlot结果显示,NC组NF 200的表达一直无变化,BMP7组NF 200表达在术后3天明显升高,且持续增长直至至第4周;NC组和BMP 7组GFAP表达水平在2w达到高峰,随后下降,两组间无显著差异。结论 BMP7蛋白具有促进大鼠脊髓损伤后神经功能修复的作用。

参环毛蚓神经组织的NSE、NF200、ED1、GFAP和NO细胞化学特性

为研究环节动物的神经组织学特性 ,我们选择生活在我国的环节动物门典型代表参环毛蚓 (Pheretimaaspergillum)为研究对象 ,使用若干种兔抗鼠抗体 ,进行了免疫细胞化学与细胞化学染色 ,在光学显微镜下观察反应阳性细胞的形态与分布。研究发现 ,在参环毛蚓脑、咽下神经节、腹神经节所有神经细胞呈NSE阴性 ;在参环毛蚓脑 ,部分神经细胞呈NF2 0 0阳性 ,在咽下神经节、腹神经节未观察到NF2 0 0阳性神经细胞 ;在参环毛蚓脑观察到较多ED1阳性细胞 ;在参环毛蚓脑、咽下神经节、腹神经节均未观察到GFAP阳性细胞 ;在参环毛蚓脑未观察到NADPH d阳性神经细胞 ,而在咽下神经节和腹神经节部分神经细胞及纤维NADPH d阳性。结果表明 ,参环毛蚓神经细胞的神经细胞特异的烯醇化酶特性、神经微丝蛋白特性与星型胶质细胞的GFAP特性不同于哺乳动物 ;其神经组织存在有数量较多的吞噬功能的类似于哺乳动物小胶质细胞的细胞 ;参环毛蚓的脑不含有NO能神经细胞 ,而咽下神经节和腹神经节含有NO能神经细胞。

运动训练对脑梗死大鼠行为学及NF200表达变化的影响

目的:研究运动训练对脑梗死大鼠行为学的影响并从神经可塑性角度探讨其机制。方法:用线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)脑梗死模型,56只Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组和康复组。康复组于手术后5天开始进行滚筒、转棒、平衡木、网屏训练,每日40min,每周6次,共5周,假手术组与模型组则维持原来生活状态。对大鼠进行神经功能、运动能力和学习记忆能力测评观察其行为学变化,免疫组化法观察缺血区神经丝蛋白200(NF200)的表达变化。结果:康复组大鼠神经功能、运动能力、学习记忆能力优于模型组,神经功能在3周差异有显著性意义(P<0.05),其转棒实验和平衡木实验在3周、5周(P<0.01—0.05)差异有显著性意义,网屏实验在3周、5周差异有显著性意义(P<0.05),学习记忆能力在5周有极显著性意义(P<0.01)。康复组大鼠缺血区NF200蛋白质阳性表达较模型组增多,在3周时差异有显著性意义(P<0.05),5周时有极显著性意义(P<0.01)。结论:运动训练促进脑梗死大鼠神经功能、运动能力、学习记忆能力的恢复,其机制可能与缺血区NF200蛋白质表达上调有关。

硫酸软骨素酶ABC对大鼠脊髓损伤后神经元修复的影响

目的探讨硫酸软骨素酶ABC(ChABC)对脊髓损伤后神经元修复的影响。方法SD大鼠72只,雌雄不限,随机分为假手术组、生理盐水对照组和ChABC治疗组,采用Allen法打击大鼠胸10脊髓损伤模型,分别在伤后即刻和随后每天1次连续1周蛛网膜下注射生理盐水和ChABC。在伤后第1天,第1、2、4周应用免疫组化检测各组组织切片中NF200的变化,尼氏染色观测各组脊髓切片中尼氏体和神经元的改变,BBB评分检测损伤的后肢运动恢复情况。结果大鼠脊髓损伤后1d和1周给药组NF200着色面积、Nissl染色阳性细胞和BBB评分与生理盐水组比较差异无统计学意义。在2、4周,治疗组要显著优于生理盐水组(P<0.05)。结论ChABC能促进大鼠脊髓损伤后神经元的修复,提高后肢运动功能的恢复。

复方麝香注射液联合神经节苷脂对弥散性轴索损伤大鼠神经元凋亡的影响

目的:探讨复方麝香注射液联合神经节苷脂对弥散性轴索损伤(DAI)大鼠神经元凋亡及神经丝蛋白200(NF200)、生长相关蛋白43(GAP-43)、凋亡相关蛋白激酶1(DAPK1)表达的影响。方法:采用大鼠头颅瞬间旋转损伤装置建立DAI大鼠模型。将成功建立的45只DAI大鼠随机分为模型组、实验组和联合组,每组15只;另选择15只正常大鼠作为对照组。实验组大鼠腹腔注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠[30 mg/(kg·d)],联合组大鼠腹腔注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠[30 mg/(kg·d)]+复方麝香注射液[2 mL/(kg·d)],对照组与模型组腹腔注射等量生理盐水,连续干预7 d。采用改良神经功能缺损评分(mNSS)法评估各组大鼠的神经功能缺损情况;采用苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠脑组织病理学变化;采用TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)检测各组大鼠神经元凋亡情况;采用蛋白质免疫印迹(Wb)法检测大鼠脑组织NF200、GAP-43与DAPK1蛋白表达。结果:干预第1~7天,模型组、联合组与实验组大鼠mNSS评分均逐渐降低;与对照组比较,模型组大鼠第1~7天的mNSS评分均明显升高,但联合组与实验组低于模型组,联合组低于实验组(P<0.05);与对照组比较,模型组大鼠神经元凋亡指数及脑组织DAPK1蛋白相对表达量均明显升高,且联合组与实验组低于模型组,联合组低于实验组(P<0.05);NF200、GAP-43蛋白相对表达量明显降低,且联合组与实验组高于模型组,联合组高于实验组(P<0.05)。结论:复方麝香注射液联合神经节苷脂治疗DAI可改善大鼠神经功能缺损情况,抑制神经元凋亡,改善神经功能,其作用机制可能与上调脑组织NF200、GAP-43蛋白表达,下调DAPK1蛋白表达相关,且两药联合使用效果更佳。

慢性前脑缺血致血管性痴呆大鼠不同脑区NF200的经时变化研究

目的研究神经丝蛋白200(NF200)在慢性前脑缺血致血管性痴呆大鼠额、颞叶皮质和皮质下白质的经时变化。方法采用双侧颈总动脉永久结扎方法制备慢性前脑缺血动物模型;采用免疫组织化学方法检测痴呆鼠不同脑区NF200的经时变化情况;采用同济大学研制的HPIAS-1000高清晰彩色病理图文分析系统对不同脑区NF200阳性信号的面积密度进行分析。结果实验发现双侧颈总动脉永久结扎后不同脑区NF200的表达随时间变化。缺血1 m,2 m,4 m后NF200的表达阳性面积逐渐减少,与对照组相比有统计学意义。在形态学变化方面,1 m时NF200轻度变化,提示为可逆性损伤。随着缺血时间的延长,NF200免疫组化染色越来越淡。至4 m时,NF200免疫组化染色基本消失,提示为不可逆损伤。结论慢性持续性脑血流量下降致NF200的改变在血管性痴呆的病理生理过程中起一定作用。

ADSC移植对大鼠大脑中动脉闭塞脑梗死模型梗死灶周围DCC和NF-200表达的影响

目的分析脂肪来源干细胞(ADSC)移植对大鼠大脑中动脉闭塞脑梗死模型梗死灶周围神经丝蛋白200(NF-200)和结直肠癌缺失蛋白(DCC)表达的影响。方法取36只SD大鼠,其中30只用于构建脑梗死大鼠模型,随机分为假手术组(不插入线栓,注入生理盐水)、脑梗死组(插入线栓,注入生理盐水)、移植组(插入线栓,注入ADSC悬液),三组各10只;剩余6只用于分离培养ADSC。分别于造模后第1、2周,采用荧光显微镜观察ADSC在大鼠脑组织中的迁移情况;通过免疫印迹法测定NF-200和DCC蛋白在大鼠脑梗死病灶周围皮质中的表达情况;采用免疫荧光法测定NF-200和DCC在大鼠脑梗死病灶周围皮质中的分布情况。激光扫描共聚焦显微镜下观察DCC蛋白在梗死灶周围皮质中的定位。结果经荧光显微镜观察可见,移植组脑组织中可见PKH-26标记的ADSC,且多见于脑梗死周围皮质中。经免疫印迹法检测可知,相比假手术组,脑梗死组造模后第1、2周脑梗死病灶周围皮质中NF-200蛋白表达明显下调,DCC蛋白表达明显上调(P<0.05);与假手术组比较,移植组造模后第1周脑梗死病灶周围皮质中NF-200蛋白表达明显下调(P<0.05),造模后第1、2周DCC蛋白表达明显上调(P<0.05);移植组与假手术组造模后第2周NF-200表达的比较,并无显著差异(P>0.05);相比脑梗死组,移植组造模后第1、2周脑梗死病灶周围皮质中NF-200和DCC蛋白表达水平均显著上调(P<0.05)。经免疫荧光组织化学染色法检测可知,脑梗死组与移植组脑梗死病灶周围皮质中NF-200和DCC蛋白的表达较假手术组更加明显,且移植组更加明显;NF-200蛋白在大鼠脑梗死病灶周围皮质中主要定位于神经元轴突中,DCC蛋白呈现条索状表达。激光扫描共聚焦显微镜下观察可见,DCC蛋白主要定位于大鼠脑梗死病灶周围皮质中NF-200阳性的神经元轴突中。结论通过颈动脉注射途径移植的ADSC可移至大鼠脑梗死病灶周围皮质中,且其促进神经元轴突再生修复的作用机制可能与诱导脑梗死病灶周围皮质NF-200和DCC表达密切相关。

外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡诱导大鼠星形胶质细胞向神经元的转分化

背景:脊髓损伤会使星形胶质细胞增生进而形成胶质瘢痕阻碍神经轴突的形成,而局部炎症微环境进一步加重了神经元的死亡,因此,将星形胶质细胞转分化为神经元既能减轻星形胶质细胞的增生又能增加神经元的数量,可谓是一举两得。而有关外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡能否诱导星形胶质细胞转分化为神经元尚未见相关报道。目的:探索外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡能否诱导星形胶质细胞转分化为神经元。方法:①采用组织块直接培养法培养SD大鼠鼻黏膜来源外胚层间充质干细胞,并且根据其形态以及免疫荧光进行鉴定,收集细胞上清液以提取细胞外囊泡,通过粒径分析、透射电镜及蛋白免疫印迹予以鉴定;②采用胰酶消化法培养SD大鼠大脑星形胶质细胞,并予以鉴定;③星形胶质细胞分2组干预:分别加入外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡(质量浓度为1 g/L,2 mL培养基内加入细胞外囊泡体积为66μL)和同体积的PBS干预星形胶质细胞72 h;④通过免疫荧光、实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹来检测神经元标志物神经元特异性烯醇化酶及神经丝蛋白200的表达量。结果与结论:①外胚层间充质干细胞形态呈典型梭形并且高表达间充质干细胞标志蛋白CD44、Nestin和Vimentin;外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡呈经典茶托样形态,粒径分布在30-200 nm之间,蛋白免疫印迹显示细胞外囊泡标志蛋白CD9,CD63及TSG101呈现阳性表达;②星形胶质细胞形态呈不规则星状且高表达胶质纤维酸性蛋白;③与对照组相比,外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡组可见较多神经元样细胞,胞体呈梭形且饱满,突起增多变长,并且高表达神经元特异性烯醇化酶及神经丝蛋白200(P<0.05);④以上结果提示,外胚层间充质干细胞来源细胞外囊泡可诱导星形胶质细胞转分化为神经元。

脂肪来源的干细胞移植对脑缺血大鼠神经轴突再生的影响

目的:探讨脂肪来源的干细胞(ADSC)移植对脑缺血大鼠神经轴突生长以及神经胶质酸性蛋白(GFAP)、神经突蛋白(Neuritin)、神经微丝蛋白200(NF-200)表达的影响。方法:54只清洁级成年雄性SD大鼠,随机分为3组:假手术组(Sham组)、模型组(MCAO组)及MCAO+ADSC治疗组(ADSC组),每组18只。采用改良Zea-Longa线栓制法大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,ADSC移植前用DAPI标记,ADSC组于造模成功1 d后经侧脑室注射入ADSC(1×106),分别于术后7 d、14 d、28 d观察其恢复情况,并断头取脑,通过免疫荧光、Western blot法检测脑缺血组织中GFAP、Neuritin、NF-200表达情况。结果:ADSC组缺血周边区脑组织中能观察到DAPI染色的阳性细胞;ADSC组与MCAO组相比在各个时间点脑组织中GFAP阳性细胞表达明显降低(P<0.05),神经突蛋白和神经微丝蛋白200表达明显增高(P<0.05)。结论:ADSC移植后可引起脑缺血后期组织中Neuritin、NF-200有效表达,并抑制GFAP阳性细胞增生,促进了神经轴突再生和修复。