D-半乳糖致原代培养神经元损伤模型的研究

目的 :建立D -半乳糖致原代培养神经元损伤模型 ,为筛选益智药物提供药效学研究方法。方法 :在原代培养神经元的第 6d ,加入 5 0mmol/LD -半乳糖作用 72h ,倒置显微镜下观察神经元的生长发育形态 ,MTT法在酶联免疫检测仪上检测神经元代谢率 ,PI染色在流式细胞仪上检测神经元凋亡率 ,HE染色观察神经元形态、形态计量神经突起密度 ,RT -PCR检测醛糖还原酶信使RNA(AR -mRNA)含量。比较正常对照神经元和受D -gal攻击神经元之间的差别。结果 :受D -半乳糖攻击神经元的生长发育显著迟缓 ;代谢率从 0 76 2± 0 0 30 (n =33)降低到0 5 4 3± 0 0 6 4 (n =11) ,P <0 0 1;凋亡率从 0 0 6 0± 0 0 2 9(n =19)增高到 0 35 6± 0 2 15 (n =19) ,P <0 0 1;出现变性坏死的形态变化 ,神经突起密度从 0 5 5 7± 0 0 4 2 (n =10 )降低到 0 4 6 8± 0 0 33(n =10 ) ,P <0 0 1;无AR -mRNA的表达。结论 :用D -半乳糖建立的原代培养神经元损伤模型稳定、观察指标敏感 ,可用于老年性痴呆等神经系统疾病的研究。

斑马鱼神经元损伤模型在养血清脑颗粒质量控制中的应用分析

目的：探讨斑马鱼神经元损伤模型在养血清脑颗粒质量控制应用的可行性,为该制剂提供一种新型生物活性质量控制方法。方法：以养血清脑颗粒为例,采用吗替麦考酚酯诱导的斑马鱼神经元损伤药效模型对养血清脑颗粒进行神经细胞保护生物活性评价和质量稳定性检测。结果：斑马鱼神经元损伤模型作为神经细胞保护药物生物活性质控方法具有较好的精密度,日内RSD 2.2%～3.7%,日间RSD 1.2%;重复性（RSD 8.4%）和稳定性（RSD 4.9%）良好;在0.10～1.00 g·L-1内养血清脑颗粒对神经细胞保护率成良好的线性关系,方法学考察符合生物活性测定指导原则的要求。结论：采用斑马鱼神经元损伤模型评价养血清脑颗粒神经细胞保护作用的方法快速、稳定可靠,可作为现有质量控制方法的有效补充,为中药的生物活性质量控制研究提供一定的技术参考。

叠氮钠损伤的神经元内硫氧还蛋白mRNA水平的变化

氧化应激与许多神经退变病有关,而线粒体损伤是氧化应激加剧的重要原因。本文通过细胞活性检测(MTT法)、形态学观察,分析NaN_3对原代培养神经元的损伤作用,并通过RT-PCR半定量检测NaN_3损伤后神经元内疏氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)mRNA水平的改变,以阐明这一重要的氧还调节蛋白在神经元损伤过程中的作用。实验表明NaN_3以浓度和时间依赖方式损伤神经元,降低Trx表达水平。提示:神经元内呼吸链受损引起Trx表达减少,从而减弱神经元内氧还调节功能,最终引起神经元损伤、死亡。

应用核素标记相对和绝对定量技术结合纳升液-质联用筛选养血清脑颗粒对斑马鱼神经损伤预后的生物标志物

目的分析斑马鱼神经元模型损伤给药治疗前后总蛋白差异,寻找养血清脑颗粒对斑马鱼神经元损伤预后的生物标记物及其作用机制。方法采用核素标记相对和绝对定量技术结合纳升液相色谱和串联质谱(Nano LC-MS/MS)对给药前后斑马鱼药效模型总蛋白进行分离并分析肽段,采用Proteinpilot 4.2软件对蛋白进行鉴定和定量分析,对获得的差异蛋白进行生物信息学分析,应用蛋白印迹法对可能的生物标记物进行验证。结果通过Nano LC-MS/MS分析鉴定出置信度>95%的蛋白质共1 933种,其中总差异表达蛋白质130种,模型组与模型给药组表达量上调≥1.5倍的蛋白质有9种,下调≤0.70倍的蛋白质有23种。通过GO分析显示,差异蛋白的分子功能主要集中在神经元离子通道的翻译和代谢过程;Western blot结果显示,与模型组相比,差异表达蛋白Ef1-α(elongation factor 1-alpha)和α-6-F(Na^+/K^+ transporting ATPase alpha 1 polypeptide)在给药后表达量下调,差异具有统计学意义(P<0.05),且与质谱结果一致。结论 iTRAQ联合Nano LC-MS/MS技术能高通量地筛选斑马鱼神经元损伤相关蛋白,初步阐述养血清脑颗粒对斑马鱼神经元损伤预后的作用机制。