PI3K/Akt信号通路对神经元机械性损伤诱导的自噬调节作用

目的研究机械性神经元损伤后自噬的发生情况以及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt,即PKB)信号通路对其发挥的调节作用。方法小鼠皮层神经元原代培养2 w后,采用机械性神经元损伤模型,通过蛋白印迹法(Western blot)定量分析损伤后不同时间点自噬相关分子微管相关蛋白轻链3(LC3)Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1和Akt蛋白磷酸化的表达情况;使用不同浓度的PI3K抑制剂LY294002预处理神经元1h后给予机械性损伤,通过Western blot来研究自噬相关分子LC3Ⅰ/Ⅱ和Beclin-1的表达情况。结果自噬相关分子LC3Ⅱ于机械性神经元损伤后3 h表达开始逐渐增加,而Beclin-1无明显变化;p-Akt的表达于损伤后3h达到高峰,此后逐渐恢复到正常水平;用PI3K抑制剂LY294002预处理神经元,可以使损伤后神经元的自噬相关分子LC3Ⅱ和Beclin-1的表达上调。结论机械性神经元损伤可以诱导自噬发生,且PI3K/Akt信号通路在其中可能发挥调节作用。

下调Homer-1b/c基因对机械性损伤神经元存活率的影响

目的既往研究表明,Homer-1b/c在神经元损伤后恒定表达,但下调Homer-1b/c能否对损伤的神经元具有保护作用尚不清楚,这也是本实验中待研究的问题。方法采用RNA干涉(RNAi)技术,抑制神经元Homer-1b/c基因及蛋白表达。通过Western blot法分析神经元转染小干扰RNA(siRNA)后Homer-1b/c基因抑制效果。建立神经元机械性损伤模型,通过细胞存活率、乳酸脱氢酶(LDH)活性测定,研究下调Homer-1b/c基因对神经元损伤的保护作用。结果 siRNA转染神经元后36 h,Homer-1b/c mRNA和蛋白质表达明显被抑制。siRNA转染组神经元损伤后细胞存活率明显比阴性对照组、空载体组高(P<0.05)。阴性对照组、空载体组和siRNA转染组神经元损伤前培养液LDH性无统计学差异(P>0.05),机械性损伤后24 h,与阴性对照组及空载体组比较,siRNA转染组LDH活性明显降低(P<0.05)。结论 Homer-1b/c siRNA转染神经元效率较高,基因抑制效果显著。降低Homer-1b/c蛋白表达能够减少机械性损伤后继发性神经元损害,对神经元具有一定的保护作用。

自噬抑制剂3-MA对机械性神经元损伤后神经元凋亡的影响

目的研究自噬抑制剂6-氨基-3-甲基嘌呤(3-MA)对机械性损伤后神经元凋亡的影响。方法小鼠皮层神经元原代培养2 w后,采用机械性神经元损伤模型,通过蛋白印迹法(Western blot)定量分析损伤后不同时间点自噬相关分子微管相关蛋白轻链3(LC3)Ⅰ/Ⅱ的表达情况;通过免疫荧光染色分析机械性损伤后24 h神经元自噬相关分子LC3的表达情况;小鼠皮层神经元原代培养2 w后,用自噬抑制剂3-MA预处理1 h,采用机械性神经元损伤模型,通过乳酸脱氢酶(LDH)活性测定及碘化丙啶(PI)/Hoechst 33342双染测定神经元损伤程度以及3-MA的保护作用,并通过Western blot研究凋亡相关指标caspase-3和自噬相关指标微管相关蛋白轻链3(LC3)和Beclin-1的表达变化。结果Western blot方法和免疫荧光组化同时证明机械性神经元损伤后24 h LC3Ⅱ表达明显增加;LDH活性测定表明3-MA能抑制机械性损伤造成的LDH活性的增高;PI/Hoechst 33342双染表明3-MA可以明显减少机械性损伤后神经元的凋亡;通过Western blot法证明3-MA抑制LC3Ⅱ,并导致cleaved caspase-3表达明显降低。结论自噬抑制剂3-MA可能通过抑制自噬而减少机械性神经元损伤后神经元凋亡,进而对机械性损伤后神经元起保护性作用。