跨神经元追踪

对中枢神经系统内部神经传导通路的形态学研究,经历了漫长的岁月。通过古典的溃变镀银法和Nissl法到70年代初兴起的示踪法,已发现了大量脑内神经元的联系通路。特别是示踪法问世后有些示踪物既可通过轴浆流顺行运输又可被逆行运输,使用它们可以显示出单个神经元的轴突、轴突分枝及与之相连的神经元细胞体。示踪法的出现及近年来的发展,大大地丰富了人们对脑内神经元联系通路的认识。但是,迄今所使用的示踪物,只能在某一级神经元内部被顺行或逆行运输,因而不能显示神经元链,即不能将神经元的连续状态同时显示出来,从而限制了人们对神经通路的更多,更确切的认识。为此。

大鼠视交叉上核与视上核的纤维联系—病毒跨神经元追踪,免疫组化双重标记法研究

大鼠视交叉上核与视上核的纤维联系—病毒跨神经元追踪，免疫组化双重标记法研究王蕾欧可群陈文玉操高原张军马玉琼（华西医科大学组织学研究室）有文献报道视交叉上核（ＳＣＮ）的传出纤维到达室旁核（ＰＶＮ），但是否有传出纤维投射至视上核（ＳＯＮ），目前尚未见报道...

病毒跨神经元追踪、免疫荧光双标法的应用

为进一步探讨视网膜节细胞的轴突终末与视交叉上核（SCN）内VIP和AVP能神经元间的联系，采用假狂犬病毒（PRV）跨神经元顺行追踪及免疫荧光双标法。对成年大鼠单侧眼球内缓慢注入PRV（Bartha株、5X108PFU／ml）3PI，留针10分钟。动物分别存活56、72和96小时。1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经左心左灌注生理盐水（每100ml含肝素100单位）持续5分钟，流速30—40ml／分钟，冷固定液（含4％多聚甲醛、15％苦味酸，用0IM／L磷酸缓冲液配制、PH7‘4），开始流速为朋～40ml分钟，持续5～7分钟，然后降慢到10ml／分钟，维持半小时。开颅取材、修块、入上述固定液后固定一小时，再转入ZO％蔗糖磷酸缓冲液过夜、恒冷箱切片，片厚30Pm。免疫荧光双标法：含03％Triton、2％驴血清（NDS）的001PBS（pH7．4）稀释混合两种一抗，羊抗PRV1：2000，兔抗VIP或AVP1：2000，室温24～48h。二抗分别为驴抗羊IgG（IRITC标记）1：100，驴抗兔IgG（FITC标记）1：50，用2％NDS的0．01MPBS稀释，室温1．sh。以上各步间均用0．01MPBS漂洗10’X3.裱片，PBS甘油封片。免疫荧光双标操作在暗室里进行。结果；被PRV标记的细胞呈现出，绿色荧光，含VIP或AVP能神经元呈现出红色荧光，既含PRV又含VIP或AVP的神经元即双标细胞呈现出桔黄色荧光?

假狂犬病毒用于跨神经元追踪中的电镜观察

神经传导通路的追踪研究经历了经典的演变法、NISSI法和70年代兴起的HRP示踪法，但它们因均有一些缺陷而不理想。80年代末以来，欧美神经解剖学家们开始把活的亲神经性病毒（主要是单纯病疹病毒和假狂犬病毒）作为跨神经元传递的示踪剂来研究某一特定机能的神经传导通路，取得了可喜的成就。这些研究多集中于病毒跨神经元追踪的应用，有关病毒超微结构水平的研究报道甚少。本文选用SD大鼠6只，单侧眼球内注射假狂犬病毒（PRV，4μl，5×108／pfu／ml），存活72h后灌注固定，取含视交叉上核（SCN）的脑组织，经修块、常规EM包埋，切超薄片、铅铀染色，H—600下观察。结果：（1）SCN受感染的神经元成份中含有中央致密、周围密度低呈圆形的核衣壳，其直径为40～60urn，易于辨认；（2）核衣壳多聚积在核内和神经元突起中，胞浆中量少；（3）胞浆内个别核衣壳被呈新月状的内质网包绕，偶见核衣壳外裹有完整囊膜呈圆球形的发育成熟病毒，其直径为80－100urn。上述结果表明：（1）PRV在细胞核内被复制并装配成核衣壳；（2）PRV的发育成熟与细胞的膜性结构相关；（3）在此存活时间段内，SCN受感染的神经元E处于PRV复制阶段，故神经元内极少见到发育成熟的病毒。

大鼠视交叉上核与室旁核的联系──病毒跨神经元顺行追踪研究

本实验采用假狂犬病毒（猪疱疹病毒）作为跨神经元追踪示踪物，对下丘脑视交叉上核与下丘脑室旁核的联系进行了研究．实验大鼠于摘除双侧颈上交感神经节后，向单侧眼球内注入假狂犬病毒，术后动物分别存活48、56、72及96h．结果显示：56h组仅在视交叉上核内有极少数的细胞被病毒感染；72h组机交叉上核内被病毒标记的细胞增多，定劳核内也出现了被病毒感染的神经元，主要集中在背内侧帽区；96h组在室旁核内被病毒感染的神经元增加，除背内侧帽区外，其它亚孩也出现了被病毒感染的神经元；各实验组的亚室旁带未见有被病毒标记的神经元．以上表明视交叉上核的传出纤维直接投射到室旁核，两核团神经无间可能存在有直接的突触联系．

大鼠松果体的中枢神经支配──病毒跨神经元顺行追踪研究

大量研究证明，松果体（Pi）的功能同它的神经支配密切相关，因此，研究Pi的神经支配就十分必要。但长期以来对此存在着异议，一些学者认为Pi的神经支配仅来源于双侧颈上交感神经节（SCG），另一些又提出Pi的神经支配不仅来源于SCG，而且也接受来自脑或其它地方的纤维投射。本研究用假狂犬病毒（PRV）作顺行跨神经元追踪，进一步探讨Pi的神经支配。17只雄性SD大鼠在单侧眼球内注入3一PRV（Bartha株、5X10’PFU／ml）前施行双侧SCG摘除术，术后分别存活56、72和96hr。PRV标记的神经元用免疫组化ABC法显示。结果；（1）56hr组仅在视交叉上核（SCN）内在极少数神经元被PRV标记；（2）72hr组除SCN外，在丘脑下部前区、下丘脑室旁核（PVN）、缰核（Hb）和外侧膝状体（LGH）出现了PRV标记的神经元。与此同时，在松果体的被膜内和松果体细胞之间也呈现出PRV标记的神经纤维；（3）随着动物存活时！和延长，96hr组在上述提及区域内被PRV标记的神经元和神经纤维数量增多。以上结果表明松果体接受了来自视网膜节细胞（RGC）的光信息。结合其他学者的报道，我们推测从视网膜及下丘脑投射到松果体的神经通路可能有以下几条：①RGC～LGH～Pi。＠PGC～Hb～Pi，＠SCN～PVN—Pi，＠SCN～LGH～Pi和⑤SCN～Hb－Pi。

视交叉上核、隔核、乳头体核间神经联系的观察──病毒跨神经元顺行追踪

隔核、乳头体均属于边缘系统，参与内脏活动、摄食行为、性行为、记忆等的调节。视交叉上校（SCN）有纤维直接投射到外侧隔核，隔核纤维有的又投到乳头体。视交叉上核、隔核、乳头体核间是否存在直接神经的联系，未见详细报道。为了证实上述核团间有元直接的联系。本实验采用假狂犬病毒（PRV）跨神经元追踪、免疫荧光及免疫组化ABC法，以病毒在各核团出现的时序来推论它们之间的联系。成年SD大鼠18只，体重250－300克，动物行双侧颈上节切除术后，于单侧眼球内注射PRV3ul，动物分别存活56、72、96小时。结果：①56h组，PRV阳性神经元主要出现在SCN腹外侧份，ABC法显示多数神经元系含VIP。②72h组，SCN内PRV阳性神经元增多，外侧隔核内呈现出PRV阳性神经元，该神经元散在分布于核团内。③96n组乳头体外侧核出现PRV阳性神经元，它们系大细胞神经元，集聚在小范围的乳头体外侧核内。结果提示，动物存活56hSCN内出现PRV阳性神经元，经复制后72h到达到侧隔核，再经复制于96h到达乳头体外侧核。根据PRV阳性神经元出现的时间顺序，我们推测SCN内主要由腹侧份的神经元投射到外侧隔核，由外侧隔核直接投到乳头体外侧核，上述核团间可能存在直接的纤维联系，即SCN直接参与内脏活动、摄食行为、性行为、记忆等调节?

视交叉上核、弓状核、穹窿下器间神经联系的研究──病毒跨神经元顺行追踪

视交叉上核（SCN）通过直接的纤维联系调控弓状核（ARC）的功能，ARC又通过调控穹窿下器（SFO）而调节心血管系统的功能。由于所采用方法的局限，对上述核团间的直接联系研究欠深入。为了进一步证实ARC与SFO神经元间以及SCN和ARC神经无间有无直接的纤维联系，本实验采用假狂犬病毒（PRV）跨神经元追踪、免疫荧光及免疫组化ABC法，通过病毒在各核团出现的时序来分析其间的联系。成年SD大鼠18只，体重25O－300克，动物行双侧颈上节切除术后，干单侧眼球内注射PRV3μ1，动物分别存活56、72、96小时。结果：①56h组，PRV阳性神经元主要出现在SCN腹外侧份，ABC法显示多数神经元系合VIP；②72h组，SCN内PRV阳性神经元增多，ARC内呈现出PRV阳性神经元，它们系小细胞神经元散在分布于整个核团。③96h组SFO内出现PRV阳性神经元，神经元体积较小，均匀散在分布。各时间组PRV阳性神经元脑体和树突均清晰可见。结果提示，动物存活56hSCN内出现PRV阳性神经元，经复制后，72h到达ARC，再经复制于96h到达SFO神经元。根据PRV阳性神经元出现的时序我们推测SCN与ARC神经元间以及ARC与SFO神经元间可能存在直接的纤维联系。SCN通过神经联系影响ARC的功能，ARC又通过直接的神经纤维联系参与SFO功能的调控。

大鼠下丘脑室旁核对淋巴结免疫功能的神经调控

目的 探讨下丘脑室旁核 (PVH)是否通过直接的神经联系对淋巴结的功能进行调控。方法 采用假狂犬病毒 (PRV)跨神经元追踪方法研究肠系膜淋巴结注射PRV大鼠PVH内PRV感染神经元的分布 ,同时采用免疫组化方法研究腹腔注射细菌脂多糖 (LPS)后大鼠PVHc fos表达的变化。结果 在注射PRV动物的PVH内出现被PRV标记的阳性神经元 ,既有大细胞神经元 ,也有小细胞神经元 ,它们主要分布在PVH尾侧帽部和内侧部。FOS阳性产物在PVH的神经元核中出现 ,其阳性细胞的分布范围及阳性细胞的数目在LPS注射组均明显大于对照组。两批不同实验动物的相同冠状平面比较 ,可发现PVH中大多数PRV标记的阳性神经元出现在LPS注射后FOS阳性细胞数目增多的区域内。结论 PVH可能通过直接的神经环路与淋巴结相互联系 。

三维图像栈中神经末梢点的自动检测

作为神经元追踪算法的种子点,神经元的末梢点的检测非常关键。此前的研究提出了一种基于发散射线模型(rayshooting model)的检测方法,通过分析神经元图像中候选末梢点附近邻域的灰度强度分布来检测神经元的末梢点。然而,在此模型中,射线的长度以及z方向切片的数量都是固定值,所以在处理一些神经元直径尺寸变化较大的图像时,算法的准确性很受影响。因此,提出了一种可以根据神经元局部直径大小来改变射线长度以及相邻切片数量的自适应发散射线模型,神经元的局部直径由一种结合了Rayburst sampling算法及MSFM(multistencils fast marching)算法的方法测得。实验结果表明,与之前的方法相比,检测精度提高了约10%。