微囊藻毒素-LR所致神经小胶质细胞BV-2的炎性反应

目的：通过检测微囊藻毒素-LR（MC-LR）对BV-2细胞内一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）,以及培养上清液中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）表达的影响,为进一步探讨MC-LR引起中枢神经系统免疫反应奠定基础。方法：用MC-LR刺激BV-2细胞建立炎症模型,以四甲基噻唑蓝（MTT）法测定MC-LR对细胞的毒性作用;采用硝酸还原酶法检测BV-2细胞中NO的表达量;NOS分型法检测NOS的表达水平;酶联免疫吸附实验（ELISA）检测TNF-α和IL-6炎症因子的产生情况。结果：MC-LR染毒24h后,染毒浓度在0~128μg/L范围内,随着剂量的增加,细胞活性呈下降趋势（r=-0.609,P〈0.05）,其半数有效浓度（EC）为22.49 50μg/L。当染毒浓度≥5.0μg/L时,细胞分泌的IL-6和NOS的含量明显增加,与对照组比较差异具有统计学意义（P〈0.05）;10.0μg/L染毒后TNF-α和NO含量明显增加,与对照组比较差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论：MC-LR诱导BV-2细胞产生大量的炎性细胞因子NO、NOS、IL-6及TNF-α,引起神经系统的炎症反应。

灯盏乙素通过环状GMP-AMP合酶-干扰素基因刺激因子通路抑制BV-2小胶质细胞介导的神经炎症

目的探讨灯盏乙素对脂多糖(LPS)诱导的BV-2小胶质细胞神经炎症的影响。方法培养BV-2小胶质细胞系,将BV-2小胶质细胞分为对照组(Ctrl)、环状GMP-AMP合酶(cGAS)抑制剂RU320521(RU.521)组、LPS组、LPS+RU.521组、LPS+灯盏乙素预处理(LPS+S)组、LPS+S+RU.521组,共6组。Western blotting及免疫荧光双标染色法检测并观察BV-2小胶质细胞中cGAS、干扰素基因刺激因子(STING)、核因子κB(NF-κB)、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)、PYD结构域蛋白3(NLRP3)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达变化(n=3)。结果Western blotting和免疫荧光双标染色均显示,与对照组相比,LPS诱导后,BV-2小胶质细胞中cGAS、STING、p-NF-κB、NLRP3和TNF-α蛋白的表达水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+S组中cGAS、STING、p-NF-κB、NLRP3和TNF-α蛋白的表达水平显著下降(P<0.05)。使用cGAS通路抑制剂RU.521后显示了与灯盏乙素预处理组相似的作用效果。此外,NF-κB在各组的变化不明显(P>0.05)。结论灯盏乙素干预抑制BV-2小胶质细胞介导的神经炎症反应,可能与cGAS-STING信号通路有关。

金松双黄酮抑制JAK2/STAT3通路对脂多糖诱导的BV2小胶质细胞炎症反应的影响

目的探究金松双黄酮(SCI)调控酪氨酸激酶2/信号转导与转录激活因子3(JAK2/STAT3)通路,对脂多糖(LPS)诱导的BV2小胶质细胞炎症反应的影响。方法①采用格里斯(Griess)试验试剂检测不同浓度SCI(1.25~40μmol·L^(-1))干预对经LPS刺激后BV2小胶质细胞培养液中亚硝酸盐含量的影响。②采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测不同浓度SCI(1.25~40μmol·L^(-1))干预的BV2小胶质细胞活性以此判断SCI对BV2小胶质细胞毒性作用。③将BV2小胶质细胞以2×10^(6)个/孔接种于6孔板中,并将其随机分为对照组(Ctrl组)、对照+SCI组(Ctrl+SCI组)、模型组(LPS组,100μg·L^(-1))、模型+SCI组(LPS+SCI组),各组进行相应干预。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)法检测SCI对LPS刺激BV2细胞的促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和诱导一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达的影响;酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测白介素-6(IL-6)、TNF-α的蛋白水平;Western blot法检测JAK2/STAT3信号通路磷酸化酪氨酸激酶2(p-JAK2)、磷酸化信号转导与转录激活因子3(p-STAT3)以及iNOS蛋白表达。结果①Greiss法结果显示,1.25~40μmol·L^(-1) SCI均显著降低LPS刺激的BV2小胶质细胞产生的亚硝酸盐(P<0.05)。②MTT法结果显示,1.25~20μmol·L^(-1)浓度的SCI对BV2小胶质细胞的活性没有影响。③RT-qPCR结果显示,与LPS组比较,LPS+SCI组中iNOS、TNF-αmRNA的表达量下降(P<0.05);ELISA法结果显示,与LPS组比较,LPS+SCI组中IL-6、TNF-α的蛋白表达量下降(P<0.05);Western blot结果显示,与LPS组比较,LPS+SCI组中p-JAK2、p-STAT3、iNOS蛋白表达降低(P<0.05)。结论SCI能够通过抑制JAK2/STAT3信号通路发挥对LPS刺激的BV2小胶质细胞的抗炎作用。

迷走神经刺激通过调控M1/M2小胶质细胞极化减轻神经炎症改善癫痫大鼠认知功能

目的探讨迷走神经刺激(VNS)对难治性癫痫大鼠认知功能的影响及可能机制。方法通过腹腔注射氯化锂-皮罗卡品建立难治性癫痫大鼠模型。模型制作成功大鼠随机分为模型组(18只)与VNS组(15只),另外设对照组(20只)。对照组与模型组只分离迷走神经并植入刺激器,但不给予刺激;VNS组采取连续4周迷走神经电刺激。观察大鼠癫痫发作情况;Morris水迷宫实验检测大鼠认知功能;Nissl染色观察大鼠海马组织病理形态;ELISA检测大鼠海马组织TNF-ɑ、IL-6和IL-10表达;免疫荧光染色法与Western-blot分别检测大鼠海马组织M1型小胶质细胞标记物(iNOS)和M2型小胶质细胞标记物(Arg1)相对表达。结果①与对照组相比,模型组大鼠癫痫发作等级及发作持续时间明显增加(P<0.05);通过VNS连续干预4周后,大鼠癫痫发作等级及发作持续时间明显降低(P<0.05)。②模型组大鼠逃避潜伏期时间明显长于对照组,而穿越原平台的次数明显少于对照组(P<0.05);通过VNS连续干预4周后,癫痫大鼠逃避潜伏期时间明显缩短,而穿越原平台的次数明显增加(P<0.05)。③对照组大鼠海马神经元形态正常;模型组大鼠海马神经元损伤严重,数量明显减少(P<0.05);VNS组大鼠海马神经元损伤相比模型组明显减轻,数量明显增加(P<0.05)。④模型组大鼠海马组织TNF-ɑ、IL-6相对表达明显高于对照组,而IL-10相对表达明显降低(P<0.05);通过VNS连续干预4周后,癫痫大鼠海马组织TNF-ɑ、IL-6相对表达明显降低,而IL-10相对表达明显增加(P<0.05)。⑤与对照组相比,模型组大鼠海马组织iNOS相对表达明显增加,而Arg1相对表达明显减少(P<0.05);与模型组相比,VNS组大鼠海马组织iNOS相对表达明显减少,而Arg1相对表达明显增加(P<0.05)。结论VNS具有改善难治性癫痫大鼠认知功能障碍的作用,其机制可能是通过促进M2型小胶质细胞极化,减轻中枢炎性反应,保护海马神经元。

Cs4-SeNPs对BV2小胶质细胞炎症反应作用及机制

目的 探讨虫草多糖功能化纳米硒(Cs4-SeNPs)对脂多糖(LPS)诱导BV2小胶质细胞炎症反应的作用及其可能机制。方法 以不同浓度(0.01、0.10、1.00μmol/L)Cs4-SeNPs作用LPS诱导的BV2小胶质细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测BV2小胶质细胞活力,免疫印迹技术检测BV2小胶质细胞硒蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)蛋白表达,荧光定量PCR技术检测不同时间(4、8、12 h)BV2小胶质细胞促炎因子环氧化酶-2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达。结果 0.01、0.10、1.00μmol/L的Cs4-SeNPs对BV2细胞活力无明显影响。与对照组相比,LPS组GPX4蛋白表达降低(F=25.47,q=6.43,P<0.01);0.01、0.10和1.00μmol/L的Cs4-SeNPs处理组GPX4蛋白表达较LPS组明显升高(q=5.72~14.07,P<0.01),且1.00μmol/L Cs4-SeNPs作用效果最好(q=6.04~8.35,P<0.01)。LPS组COX-2与iNOS mRNA表达较对照组显著上调(F=25.00、37.34,q=12.18、12.06,P<0.001)。1.00μmol/L Cs4-SeNPs预处理12 h可显著抑制COX-2基因表达(q=6.10,P<0.05);预处理8和12 h可显著抑制iNOS mRNA表达(q=4.71、6.97,P<0.05)。结论 Cs4-SeNPs对LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症反应具有抑制作用,其机制可能与硒蛋白GPX4的调控有关。

益智对TREM2调控小胶质细胞表型转化的调节作用

目的 研究益智对小胶质细胞表型转化的调节作用。方法 采用LPS诱导建立M1型小胶质细胞模型,通过检测M1和M2型小胶质细胞标记物表达,初步证实益智提取物可抑制LPS诱导的M1型小胶质细胞的过度活化并促进其向M2型的转化。TREM2-siRNA转染实验敲低BV2细胞中TREM2蛋白表达,通过RT-qPCR法检测M1、M2型细胞标志物的mRNA表达,免疫荧光和Western blot法进一步验证M1、M2型细胞标志物的表达以及PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达。结果 与对照组比较,LPS处理的BV2细胞M2型标记物IL-10、Arg-1 mRNA与蛋白表达降低(P<0.01);与LPS组比较,益智组IL-10、Arg-1 mRNA表达与蛋白升高(P<0.01)。抑制TREM2蛋白表达后,与转染对照组比较,转染实验组BV2细胞IL-10、Arg-1 mRNA与蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01),TNF-α mRNA与蛋白表达升高(P<0.01)。在无转染TREM2中,给予益智提取物共培养后,PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达升高(P<0.01),而在抑制TREM2蛋白表达后,PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01)。结论 益智可以通过TREM2受体蛋白激活PI3K/Akt信号通路,调节M1和M2型小胶质的表型转化,改善神经炎症。

小胶质细胞P2Y_(12)受体在小鼠卒中后中枢痛中的作用和机制

目的探讨小胶质细胞P2Y_(12)受体在小鼠卒中后中枢痛中的作用及机制。方法选取无特定病原体(SPF)级雄性C57BL/6J小鼠32只,7~8周龄,体质量25~30 g,采用随机数字表法分为4组:假手术组(C组)、CPSP组、CPSP-M组(CPSP+P2Y_(12)受体拮抗剂MRS2395)、C-M组(假手术+P2Y_(12)受体拮抗剂MRS2395),每组8只。采用右侧丘脑腹后内侧核和腹后外侧核内注射10 nL 0.001 U/nLⅣ型胶原酶制备CPSP模型。CPSP-M组和C-M组在CPSP模型制备前30 min时腹腔注射MRS 2395(1.5 mg/kg),1次/d,连续注射5 d;C组和CPSP组给予等量生理盐水。造模前1 d(T_(0))和造模后1、3、5 d(T_(1)、T_(2)、T_(3))时测定热缩足潜伏期(TWL)、冷缩足潜伏期(CWL)和机械缩足反应频率(PWF)。随后处死小鼠取脑组织,采用免疫荧光法观察P2Y_(12)受体的表达部位,苏木精-伊红(HE)染色法观察脑组织病理改变,蛋白质印迹法检测脑组织P2Y_(12)受体、Toll样受体4(TLR4)、磷酸化核转录因子κB-p65(p-NF-κB p65)和NF-κB p65的表达水平。结果P2Y_(12)受体在CPSP组脑组织内只表达于小胶质细胞中,星形胶质细胞和神经元中未表达。与C组比较,CPSP组和CPSP-M组T_(1)~T_(3)时TWL、CWL缩短,PWF升高,脑组织损伤程度加重,P2Y_(12)受体、TLR4和p-NF-κB p65表达上调,C-M组T_(1)~T_(3)时以上各项指标与C组比较,差异无统计学意义(P>0.05);与CPSP组比较,CPSP-M组T_(1)~T_(3)时TWL、CWL延长,PWF降低,脑组织损伤程度减轻,P2Y_(12)受体、TLR4和p-NF-κB p65表达下调(P<0.05)。结论小胶质细胞P2Y_(12)受体可能通过激活TLR4/NF-κB信号通路参与小鼠CPSP的形成。

激活α2A肾上腺素受体抑制背根神经节卫星胶质细胞活性缓解镜像痛敏

目的:躯体单侧组织损伤引发对侧疼痛反应,称为镜像痛敏。镜像痛敏的病理机制尚不明确,缺乏特异性靶标,影响其治疗。本研究拟阐释背根神经节中α2A肾上腺素受体和神经胶质细胞介导镜像痛敏的发生机制。方法:采用行为药理学、实时荧光定量PCR、免疫荧光和免疫印迹等技术研究背根神经节中α2A肾上腺素受体和神经胶质细胞介导镜像痛敏的机制。结果:背根神经节中α2A肾上腺素受体参与了镜像痛敏的发生发展。激活α2A肾上腺素受体显著缓解镜像痛敏行为。疼痛刺激下,双侧背根神经节中胶质细胞被差异激活,而激活α2A肾上腺素受体进一步活化背根神经节神经胶质细胞。此外,激活α2A肾上腺素受体显著降低卫星胶质细胞中α2A肾上腺素受体的表达,而不影响小胶质细胞中α2A肾上腺素受体的表达。结论:背根神经节卫星胶质细胞中的α2A肾上腺素受体是镜像痛敏的重要分子传感器,激活α2A肾上腺素受体改善镜像痛敏行为。

灯盏乙素通过STAT3信号对激活的BV-2小胶质细胞M2型极化的影响

目的探究灯盏乙素(Scutellarin)对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作用下M2型小胶质细胞极化的作用及信号转导和转录激活因子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)的调控机制。方法BV-2小胶质细胞分为对照组(Con组)、STAT3抑制剂α-氰基-(3,4-二羟基)-N-苄基霉素-烟酰胺组(AG490组)、LPS组、LPS+AG490组、LPS+灯盏乙素预处理组(LPS+S组)、LPS+S+AG490组,共6组。Western blot和免疫荧光染色检测STAT3、磷酸化STAT3(P-STAT3)和M2型小胶质细胞标记物白介素10(IL-10)的表达。结果Western blot结果显示,LPS组的P-STAT3、IL-10表达显著增强,与对照组差异显著(P<0.05);使用灯盏乙素干预后P-STAT3表达明显降低;IL-10表达显著增高;均与LPS组有显著差异(P<0.05)。AG490增强灯盏乙素的作用。此外,STAT3在各组的变化无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光染色结果显示,灯盏乙素干预后可降低LPS激活的BV-2小胶质细胞P-STAT3的蛋白表达水平;增强IL-10蛋白表达。各组STAT3的蛋白水平无统计学意义。结论灯盏乙素通过抑制STAT3活化促进BV-2小胶质细胞向M2型极化,可能与灯盏乙素减轻神经炎症反应有关。

神经胶质抗原2胶质细胞与中枢神经系统疾病的研究进展

神经胶质抗原2(NG2)胶质细胞是兼具神经元和胶质细胞特性的特殊细胞,其细胞表面特异性表达NG2硫酸软骨素蛋白多糖。NG2胶质细胞是脑内区别于神经元、成熟少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞的细胞亚群,广泛存在于发育和成年的哺乳动物中枢神经系统(CNS)中,参与调节CNS的重建、神经网络、轴突生长和多种CNS疾病。CNS失衡在帕金森病、阿尔茨海默病等神经系统疾病的发病机制中发挥重要作用。因此,深入研究NG2与CNS疾病的相关性,可以为疾病的治疗提供新思路。

P2Y受体介导星形胶质细胞在中枢神经系统疾病中作用机制的研究进展

星形胶质细胞是中枢神经系统(central nervous system,CNS)中数量最丰富的胶质细胞[1],除了在人体健康中发挥着免疫应答、滋养支持神经细胞、维持血脑屏障、促进髓鞘及突触形成以及保持内环境的稳态等重要神经系统保护作用外[2],有研究发现星形胶质细胞在一些条件下会释放炎症因子如白细胞介素-1α、肿瘤坏死因子、IL-6等加剧炎性反应,导致神经毒性作用损害机体功能,诱导疾病的发生发展[3].

PRP通过NRF2/HO-1通路对LPS诱导的BV2小胶质细胞神经炎症的保护作用

目的 探究富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的BV2细胞炎症反应保护作用与机制。方法 BV2小胶质细胞分成正常对照组、10%PRP对照组、LPS组(LPS诱导)、3%PRP+LPS组(LPS诱导,3%PRP预处理)、5%PRP+LPS组(LPS诱导,5%PRP预处理)和10%PRP+LPS组(LPS诱导,10%PRP预处理),CCK-8测定BV2细胞增殖。共聚焦显微镜测定BV2细胞线粒体膜电位水平,荧光法检测ROS生成情况,Griess法测定NO水平。Western blot检测IL-6、TNF-α、BACH1、GPX4、NRF2和HO-1蛋白表达。此外,用HO-1抑制剂处理BV2小胶质细胞后实验分为正常对照组,LPS组,ZnPP+LPS组,10%PRP+LPS组,ZnPP+LPS+10%PRP,Western blot检测HO-1、IL-6和TNF-α蛋白表达。结果 与正常对照组相比,PRP促进BV2细胞增殖(P<0.01);LPS组线粒体膜电位下降,ROS生成增多,NO、IL-6、TNF-α、BACH1水平升高(P<0.01),而GPX4、NRF2、HO-1表达水平下降(P<0.01)。与LPS组相比,3%PRP+LPS组、5%PRP+LPS组、10%PRP+LPS组BV2细胞增殖活性升高,线粒体膜电位升高;ROS、NO、IL-6、TNF-α、BACH1水平降低(P<0.01);GPX4、NRF2、HO-1在不同浓度PRP(3%、5%、10%)组表达升高(P<0.01)。另外,使用HO-1抑制剂结果显示,与LPS组比较,ZnPP+LPS组IL-6和TNF-α表达增高;与10%PRP+LPS+ZnPP组比较,HO-1抑制剂能够逆转PRP对LPS诱导下BV2细胞IL-6和TNF-α表达的影响(P<0.01)。结论 PRP可以通过激活NRF2/HO-1信号通路来抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症反应。

DOCK2在缺血性卒中大鼠小胶质细胞除极和神经发生中作用研究

目的 探究靶向胞质分裂作用因子蛋白(dedicator of cytokinesis 2,DOCK2)蛋白在缺血性卒中(IS)大鼠脑组织中对小胶质细胞除极与神经发生的影响。方法 将大鼠随机分为假手术(Sham)组,缺血性卒中(MCAO)组,IS+LC-shNC (MCAO+LV-shNC)组,IS+LV-shDOCK2 (MCAO+LV-shDOCK2)组,每组15只。7d后开展神经功能评分与Y型迷宫检测,取脑组织进行TTC染色、免疫荧光染色,取缺血侧海马组织开展RT-PCR检测、Western blot检测。结果 与Sham组相比,MCAO组与MCAO+LVshNC组大鼠脑组织中DOCK2表达增加(P<0.05),出现梗死区域,神经功能评分增加(P<0.05)。Y型迷宫中正确反应次数减少(P<0.05),正确反应时间增加(P<0.05)。此外,与Sham组相比,MCAO组与MCAO+LV-shNC组大鼠海马DG区BrdU阳性细胞数、DCX表达增加(P<0.05),小胶质细胞活化标记物iba1表达升高(P<0.05)。小胶质细胞极化标记物中,MCAO组与MCAO+LV-shNC组CD16、TNF-α、IL-1 β、iNOS mRNA表达明显增加(P<0.05),且CD206、TGF-β、Arg1、Ym1 mRNA表达增加。然而,与MCAO组相比,MCAO+LV-shDOCK2组大鼠脑组织中DOCK2表达降低(P<0.05),伴随着梗死面积减少(P<0.05),神经功能评分减少(P<0.05)。Y型迷宫中正确反应次数增加(P<0.05),正确反应时间减少(P<0.05)。与此同时,海马DG区BrdU阳性细胞数、DCX表达进一步增加(P<0.05),但iba1表达降低(P<0.05)。此外,M1型小胶质细胞标记物CD16、TNF-α、IL-1 β、iNOS mRNA表达减少(P<0.05),M2型TGF-β、Arg1、Ym1 mRNA表达进一步增加(P<0.05)。结论 敲低DOCK2蛋白表达有利于抑制小胶质细胞活化,逆转M1型小胶质细胞除极,提高M2型小胶质细胞除极化,最终起到促进神经发生,发挥神经功能与学习、记忆能力改善作用。

黄芪多糖抑制小鼠EAE及调控BV-2神经小胶质细胞活化的实验研究

目的:研究黄芪多糖(APS)对实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)的治疗作用以及对参与EAE发病机制的神经小胶质细胞活化的调控作用及其可能的作用机制。方法:动物实验:MOG_(35-55)诱导C57BL/6小鼠建立EAE模型,予APS给药干预,通过5级临床症状评分观察APS对小鼠EAE的治疗作用。细胞实验:MTT法检测脂多糖(LPS)对于BV-2神经小胶质细胞的增殖抑制作用,筛选合适的LPS刺激浓度活化神经小胶质细胞,构建BV-2神经小胶质细胞活化的模型;倒置显微镜观察BV-2神经小胶质细胞形态学的改变;ELISA法检测BV-2神经小胶质细胞IFN-γ、TNF-α的分泌水平变化;观察不同浓度的APS对BV-2神经小胶质细胞活化的调控作用;APS干预后,Western blot、Real-time PCR方法分别检测BV-2神经小胶质细胞PD-L1蛋白和mRNA表达水平的变化。结果:APS能够有效治疗小鼠EAE的临床症状,成功建立了体外BV-2神经小胶质细胞活化模型,一定浓度的APS能够抑制BV-2神经小胶质细胞的活化,提高活化的BV-2细胞的生存活性,降低IFN-γ、TNF-α的分泌水平,促进活化的BV-2神经小胶质细胞PD-L1基因及蛋白表达上调。结论:APS对小鼠EAE具有明显的治疗作用,其发挥作用的机制可能是APS能够有效抑制神经小胶质细胞的活化,降低炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α的分泌,对神经小胶质细胞有抗炎保护作用,PD-1/PD-L1通路可能是APS发挥抗炎作用的重要途径。

竹节参总皂苷对BV-2小胶质细胞神经炎症模型p38 MAPK/NF-κB通路的影响

目的 探讨竹节参总皂苷对BV-2小胶质细胞炎症模型p38 MAPK/NF-κB通路的影响。方法 采用大孔树脂提取竹节参总皂苷,并进行鉴定、含量检测。体外培养BV-2小胶质细胞,分为正常对照组、模型组、竹节参皂苷组(10、100μg·mL^(-1)竹节参皂苷)、抑制剂组(10μmol·mL^(-1)SB203580)、竹节参皂苷联合抑制剂组(100μg·mL^(-1)竹节参皂苷+10μmol·mL^(-1)SB203580),1μg·mL^(-1)LPS(脂多糖)干预BV-2小胶质细胞24 h,诱导炎症反应。CCK-8法检测细胞活性,免疫荧光、Western Blot法检测p38 MAPK/NF-κB通路蛋白表达,实时荧光定量PCR法检测IL-1β、IL-6 mRNA表达,划痕实验观察细胞迁徙。结果 与0μg·mL^(-1)竹节参皂苷比较,低浓度范围(0.1~100μg·mL^(-1))内,竹节参皂苷对BV-2细胞活性无明显影响(P>0.05)。与正常对照组比较,模型组BV2小胶质细胞p-p38 MAPK、p-NF-κB p65、IL-1β蛋白表达明显上升(P<0.05,P<0.01),IL-1β、IL-6 mRNA表达明显上升(P<0.01),细胞在划痕区域所占面积上升(P<0.01);与模型组比较,10、100μg·mL^(-1)竹节参皂苷均可抑制p-p38 MAPK、IL-1β蛋白表达(P<0.05),100μg·mL^(-1)竹节参皂苷可抑制p-NF-κB p65蛋白表达(P<0.01),10、100μg·mL^(-1)竹节参皂苷均可抑制IL-1β、IL-6 mRNA表达(P<0.05,P<0.01),并降低划痕区域迁徙细胞所占面积(P<0.01)。与模型组比较,抑制剂组p-NF-κB p65、IL-1β表达下降(P<0.01);与竹节参皂苷组(100μg·mL^(-1))比较,竹节参皂苷联合抑制剂组(100μg·mL^(-1)竹节参皂苷+10μmol·mL^(-1)SB203580)p-NF-κB p65表达下降(P<0.01),而IL-1β表达无明显变化(P>0.05)。结论 竹节参总皂苷干预活化的小胶质细胞,可通过抑制p38 MAPK/NF-κB通路,改善神经炎症,并抑制细胞迁徙。

醛酮还原酶1成员B1(AKR1B1)激活NF-κB通路诱导小鼠BV-2小胶质细胞活化抑制视网膜神经节细胞活性

目的探讨醛酮还原酶1成员B1(AKR1B1)在调控小胶质细胞极化中的机制及其对视网膜神经节细胞(RGC)活性的影响。方法利用脂多糖(LPS)诱导BV-2小胶质细胞极化,分别利用AKR1B1小干涉RNA(siRNA)和抑制剂泊那司他(ponalrestat/Statil)作用BV-2细胞;实时定量PCR检测BV-2小胶质细胞AKR1B1、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、环加氧酶2(COX2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表达,ELISA检测BV-2小胶质细胞培养上清液TNF-α、IL-1β含量。采用BV-2条件培养基处理原代RGC,免疫荧光细胞化学染色检测RGC脑特异性同源盒蛋白3a(Brn-3a)的表达以确定RGC活性,TUNEL染色检测RGC凋亡;Western blot法检测RGC核因子κBp65(NF-κBp65)、核因子κB抑制物激酶(IKK)蛋白磷酸化情况。结果LPS诱导BV-2细胞中TNF-α、IL-1β、COX2和iNOS的mRNA表达增加,培养液上清中TNF-α、IL-1β含量增加。BV-2细胞条件培养基导致RGC活力降低、凋亡增加;敲低AKR1B1后,可阻断BV-2细胞M1型极化,恢复RGC活力;敲低AKR1B1可阻断LPS诱导的IKK磷酸化和NF-κBp65的入核。结论AKR1B1可通过激活NF-κB通路诱导小胶质细胞的活化,进而降低RGC的活力并促进其凋亡。

芍药甘草汤通过JAK2/STAT3信号通路对神经病理性疼痛大鼠的镇痛及对免疫调节机制影响

目的探寻芍药甘草汤对神经病理性疼痛(NP)的改善作用及其机制。方法采用坐骨神经分支选择性损伤(SNI)法建立NP大鼠模型,模型制备成功后予以芍药甘草汤灌胃治疗14 d。治疗前后监测大鼠疼痛行为学指标变化,TUNEL染色检测脊髓背角细胞凋亡情况,免疫荧光组织化学法测定p-STAT3在脊髓中与Iba1的共定位情况,RT-PCR检测CD68、SOCS3、Arg-1的mRNA表达,ELISA检测白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达,Western blotting检测JAK2/STAT3通路蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠机械缩足阈值(MWT)、热缩足潜伏期(TWL)明显降低(P<0.01),脊髓背角中凋亡细胞显著增加(P<0.05),IL-1β、1L-6和TNF-α的表达显著增加(P<0.01),JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的表达显著增加(P<0.01),术后7、14 d的CD68、SOCS3 mRNA表达显著增加(P<0.01),Arg-1 mRNA表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较,芍药甘草汤组大鼠治疗后MWT、TWL明显上升(P<0.01),脊髓背角中凋亡细胞减少,IL-1β、IL-6、TNF-α的水平显著减少(P<0.01),JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达水平明显降低(P<0.01),CD68、SOCS3 mRNA表达显著减少(P<0.01),Arg-1 mRNA表达水平显著增加(P<0.01)。结论芍药甘草汤可能通过调控JAK2/STAT3通路调控小胶质细胞极化状态进而发挥改善NP的作用。

Fasudil通过TLR4通路抑制脂多糖诱导的小鼠BV-2小胶质细胞TNF-α和IL-1β的表达

目的探讨Fasudil对脂多糖(LPS)诱导BV-2小胶质细胞系促炎细胞因子表达中的作用。方法体外培养BV-2小胶质细胞系,实验分为PBS对照组、LPS刺激组、LPS联合Fasudil干预组,ELISA检测细胞TNF-α、IL-1β的释放,Griess法检测NO释放水平,流式细胞术检测Toll样受体4(TLR4)、TLR2蛋白表达。结果 LPS刺激BV-2细胞可导致TNF-α、IL-1β和NO的释放明显增加,还可导致炎性信号通路中的受体TLR4表达明显增加。Fasudil能明显抑制炎性因子的释放和TLR4的表达。结论 Fasudil可抑制LPS诱导的小胶质细胞NO、TNF-α和IL-1β释放,其作用机制可能与Fasudil下调TLR4通路有关。

EphA2对神经胶质瘤细胞系U251的凋亡﹑增殖﹑迁移和侵袭的研究

为了研究EphA2对神经胶质瘤细胞系U251在增殖、凋亡、迁移和侵袭方面所起的作用,用RT-PCR方法检测正常脑组织标本与两种恶性胶质瘤细胞系中EphA2 mRNA表达水平,然后用化学合成的针对EphA2基因的小干扰RNA(siRNA)下调该基因的表达,以检测其在U251中的生物学功能.证实了EphA2基因在正常脑组织标本中的表达水平远低于两种恶性胶质瘤细胞系.把体外化学合成针对EphA2基因的小干扰RNA(siRNA-EphA2)转染入U251细胞后,Western blot,实时定量RT-PCR检测到U251细胞中EphA2蛋白及mRNA表达水平都明显降低,并且细胞增殖受到显著抑制,同时出现了明显的细胞凋亡.伤口愈合实验(检测细胞迁移能力),Transwell小室实验(检测细胞侵袭能力)均表明,下调EphA2的表达后,细胞的迁移和侵袭能力较阴性对照组显著减弱.上述结果表明,在神经胶质瘤U251细胞中,EphA2与其恶性增殖及高度侵染性相关,可作为分子治疗的有效靶点.

TRPM2离子通道在颞叶癫痫相关神经炎症中的作用研究

目的探讨小胶质细胞及星形胶质细胞中的瞬时受体电位M2型(TRPM2)离子通道在颞叶癫痫(TLE)相关神经炎症中的作用。方法将大鼠随机分为对照组和癫痫组,癫痫组采用氯化锂-毛果芸香碱(匹罗卡品)制作癫痫模型,对照组给予等剂量的生理盐水代替,根据造模后观察的时间将TLE大鼠随机分为7个亚组(n=5):急性期(3 h组、6 h组、1 d组、2 d组)、潜伏期(14 d组)、慢性期(30 d组、90 d组)。检测TRPM2在不同亚组TLE大鼠海马中的表达及TRPM2在大鼠海马中的细胞定位情况。采用过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导小胶质细胞BV2及星形胶质细胞C8细胞系,检测细胞释放IL-1β、IL-6和TNF-α的水平,检测H_(2)O_(2)诱导的BV2及C8细胞中TRPM2、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、磷酸化核因子κB p65蛋白(p-NF-κB p65)的表达变化,同时检测H_(2)O_(2)诱导BV2细胞中钙调神经磷酸酶(CaN)的活性变化。结果急性期TLE大鼠海马中的TRPM2表达升高(P<0.05)。H_(2)O_(2)诱导的BV2及C8细胞中TRPM2的表达升高、炎症因子释放增加(P均<0.05),H_(2)O_(2)可促进BV2细胞中PARP-1、p-NF-κB p65的表达并提高CaN、GSK-3β的活性(P均<0.05)。结论氧化应激可促进小胶质细胞及星形胶质细胞TRPM2及促炎细胞因子的表达,癫痫反复发作引起的氧化应激可能在小胶质细胞中通过TRPM2/CaN/p-NF-κB p65通路介导TLE相关神经炎症的发生。