毛囊表皮神经嵴干细胞调节面神经损伤后局部炎症因子的表达水平

背景:既往研究报道了毛囊表皮神经嵴干细胞在周围神经修复中的巨大潜力,但其炎症调节作用在面神经修复研究中鲜有报道。目的:探究毛囊表皮神经嵴干细胞能否调节面神经损伤后早期局部肿瘤坏死因子α和白细胞介素4表达水平,以促进面神经功能和形态恢复。方法:提取4 d龄SD大鼠毛囊表皮神经嵴干细胞进行培养、鉴定。取54只成年雄性SD大鼠制备面神经干缺损自体静脉导管桥接模型,随机等分为生理盐水组、DMEM组和毛囊表皮神经嵴干细胞组。通过免疫蛋白印迹、免疫组化、免疫荧光观察术后4-14 d肿瘤坏死因子α和白细胞介素4表达水平。对术后12周大鼠进行面神经功能评分,并行苏木精-伊红染色观察面神经形态。结果与结论:(1)毛囊表皮神经嵴干细胞中Nestin和p75NTR双阳性表达,细胞纯度>90%;(2)与其他两组相比,毛囊表皮神经嵴干细胞组的肿瘤坏死因子α表达在术后7 d减弱(P<0.05),而白细胞介素4表达在术后3,7,14 d均增强(P<0.05);(3)与其他两组相比,毛囊表皮神经嵴干细胞组的面神经功能改善(P<0.05);(4)面神经移植段均可见新生血管和再生轴突,与其他两组相比,毛囊表皮神经嵴干细胞组移植段和移植远段的神经纤维排列更有序、包绕的髓鞘更厚;(5)结果表明:毛囊表皮神经嵴干细胞对面神经损伤后修复早期局部肿瘤坏死因子α和白细胞介素4表达具有调节作用,可抑制局部炎症反应,并促进面神经功能和形态恢复。

小鼠胚胎肠神经嵴干细胞的分离培养及鉴定

目的建立分离培养及鉴定小鼠肠神经嵴干细胞(gut neural crest stem cells,GNCSCs)的方法,为临床应用奠定基础。方法分离胚鼠肠管,消化后接种于添加N2、B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基,贴壁培养;连续传代后用血清促进GNCSCs分化;最后用免疫细胞化学方法染色鉴定。结果分离培养的细胞聚集生长,形成的克隆球可以传代;克隆球p75染色阳性;分化后的细胞分别表达肠神经元、神经胶质细胞和平滑肌细胞特异性抗原。结论分离培养的克隆球具有自我更新和多向分化的能力,表达肠神经嵴干细胞的特异性抗原p75,是肠神经嵴干细胞。

GFP标记成年大鼠表皮神经嵴干细胞的分离培养与形态学特征

目的建立绿色荧光蛋白(GFP)标记大鼠表皮神经嵴干细胞(EPI-NCSC)的分离培养方法,为EPI-NCSC在体移植研究脊髓损伤修复奠定基础。方法分离成年GFP大鼠胡须毛囊,取毛囊隆突部贴附于胶原包被的培养板上。在培养第4天有大量细胞游出,取出贴附的毛囊隆突部,细胞传代培养。细胞采用SOX10和Nestin免疫细胞化学染色鉴定,并计算细胞纯度。结果 EPI-NCSC在胶原基质上从隆突部游出,细胞为圆形或梭形,呈强绿色荧光。免疫细胞化学染色SOX10和Nestin双阳性,纯度在99%以上。结论本实验方法简便易行,能分离出高纯度的GFP-EPI-NCSC,可作为一种有效的工具细胞用于损伤脊髓修复研究。

人端粒酶催化亚基基因转染大鼠颅神经嵴干细胞向永生化细胞的转变

背景：颅神经嵴干细胞可以作为颌面部各种组织和器官分化研究的重要细胞来源，如何使其获得永生化具有重要意义。人类细胞自发永生化的频率非常低，而一些永生化的基因可以显著增加这种频率。目的：观察人端粒酶催化亚基基因在大鼠颅神经嵴干细胞永生化过程中的作用。设计、时间及地点：观察性实验，于2007—09／2008-06在解放军第四军医大学完成。材料：选择清洁级孕8．5dSD大鼠3只，6周，体质量180g；先天性细胞免疫缺陷动物雄性Balb／c裸小鼠，体质量18～21g，均由解放军第四军医大学实验动物中心提供。质粒PCIneo-hTERT由解放军第四军医大学口腔医院牙体牙髓科提供。方法：原代培养大鼠颅神经嵴干细胞后，将含有人端粒酶催化亚基基因的质粒PCIneo-hTERT转入大鼠颅神经嵴干细胞。经G418筛选后扩增，并连续培养。采用免疫细胞化学法观察转染细胞内人端粒酶催化亚基基因和颅神经嵴干细胞的特异标志物P75的表达，检测细胞的端粒酶活性，绘制细胞生长曲线观察其增殖能力，并通过裸鼠移植实验了解转染细胞的特性。主要观察指标：细胞克隆、特异性蛋白P75表达、端粒酶活性、增殖能力及致瘤性实验结果。结果：①质粒PCIneo—hTERT转染细胞后24h，有少量细胞死亡。加G418后48h，细胞逐步开始大量死亡。12d后出现抗性细胞克隆，共有3个细胞克隆生长良好。分别命名为克隆1、2、3。克隆1和克隆2经过20～25代的传代后，细胞发生衰老、死亡：而克隆3在体外长期培养条件下生长状态良好，稳定表达人端粒酶催化亚基和P75。经转染后颅神经嵴干细胞的端粒酶活性明显升高，且能持续表达。②人端粒酶催化亚基基因转染后，3个细胞克隆在初期的增殖能力较强，随后克隆1、2的增殖速度逐渐变慢，出现死亡，克隆3越过衰老期，且无致瘤性。结论：人端粒酶催化亚基基因转染大鼠颅神经嵴干细胞后，细胞得以永生化，其表型稳定，可作为颅颌面部细胞分化和组织工程研究的种子细胞。

成体小鼠肠神经嵴干细胞体外分离、培养及鉴定

目的利用简化无血清培养基和连续传代法,从成体小鼠肠管分离培养肠神经嵴干细胞(GNCSCs),观察细胞体外培养过程中增殖、分化的特点.用p75,GFAP,Peripherin,α-Actin作为特异性标志来鉴定GNCSCs及其分化的细胞系.方法将新生1,5d的小鼠肠管制成单细胞悬液,接种于无血清DMEM/F12完全培养基中贴壁培养,连续传代培养并观察克隆球的形成过程.将克隆球接种于含血清的DMEM/F12完全培养基中,观察其分化现象.用免疫细胞化学和免疫荧光法检测克隆球及其分化细胞系特异性标志物的表达.结果成体小鼠肠管中有少数细胞在无血清培养基中存活且增殖形成克隆球.免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清诱导下可分化为神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞.结论成体肠管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs,在体外GNCSCs可分化为肠神经系统所必须的细胞类型.

神经嵴干细胞的研究进展

神经嵴是脊椎动物胚胎早期发育过程中出现的暂时性结构,从低等动物鱼类到高等动物人类具有极大的相似性。人胚发育第14天时,胚盘中轴区的外胚层局部增厚形成神经板,人胚18d左右时,神经板两侧缘增厚、隆起形成神经褶,神经褶进一步隆起、靠近与融合形成神经管。

骨形态发生蛋白2对体外培养肠神经嵴干细胞的调控作用

目的研究体外培养肠神经嵴干细胞(enteric neural crest stem cells,ENCSCs)的方法,以及骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)对ENCSCs增殖、迁移的作用,揭示BMP信号通路在先天性巨结肠发生、发展中的作用。方法 1机械分离法和酶消化法从SD大鼠的胎鼠肠道组织获取ENCSCs,免疫荧光法鉴定干细胞特性和多向分化能力;2光镜计数法检测不同浓度BMP2,以及BMP2与胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)对ENCSCs增殖(成球率)的影响;3肠片三维立体培养观察BMP2及GDNF对ENCSCs迁移的影响。结果1成功从胎鼠肠道组织分离提取ENCSCs,于培养第8天可见神经球形成,并可反复传代培养;2将获得的ENCSCs反复传代后,采用免疫荧光检测其具有干细胞特性(P75+/Nestin+)和多向分化能力[可以分化为成熟神经元(TUJ1+)、神经胶质细胞(GFAP+)和平滑肌细胞(αSMA+)],证实其为干细胞;3与对照组比较,BMP2可明显促进ENCSCs的增殖及迁移能力(P<0.05),GDNF可以增强其生物学效应(P<0.05)。结论 1成功获得ENCSCs,并证实其具干细胞干性和多向分化能力;2BMP2对ENCSCs的迁移、增殖具有明显的促进作用。

表皮神经嵴干细胞移植对大鼠损伤脊髓组织中脑源性神经营养因子表达的影响

目的:观察表皮神经嵴干细胞(epidermal neural crest stem cells,EPI-NCSCs)移植治疗大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的作用以及SCI组织中脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophical factor,BDNF)表达的变化,从神经营养因子的角度探讨EPI-NCSCs移植修复SCI的机制。方法:分离培养绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转基因大鼠的EPINCSCs,备移植用。60只SD大鼠均暴露T10脊髓并在NYU-Ⅱ撞击机(10 g 25 mm致伤力)挫伤脊髓制作SCI模型,随机分为空白损伤组(A组)、培养基移植组(B组)、EPI-NCSCs移植组(C组)。SCI模型大鼠损伤1周后将EPI-NCSCs细胞悬液移植入C组大鼠SCI处,B组用单纯DMEM/F12培养基代替,空白损伤组不做处理。伤后每周进行一次运动功能评分,移植后1、3、6周取材行酶联免疫分析、免疫组织化学染色、免疫荧光染色以及Western blot检测BDNF蛋白的表达。结果:移植术后第2周起C组运动功能评分高于同期A组(2、3、4、5、6周,P值分别为0.003、0.000、0.000、0.000、0.000)和B组(2、3、4、5、6周,P值分别为0.044、0.000、0.006、0.000、0.008)。酶联免疫分析显示C组BDNF蛋白在移植后3周表达高于A组(P=0.009)和B组(P=0.013),移植后6周表达量显著高于A组(P=0.003)和B组(P=0.003)。免疫组化和免疫荧光结果显示移植后3周和6周,C组BDNF表达高于同期A组和B组。Western blot结果显示移植后6周,C组BDNF表达高于同期A组(P=0.000)和B组(P=0.000)。结论:EPI-NCSCs移植能促进SCI内BDNF的表达,改善局部微环境,从而有助于大鼠损伤脊髓的修复。

培养Schwann细胞用于构建毛囊神经嵴干细胞定向分化饲养层

目的培养原代Schwann细胞,用于构建毛囊神经嵴干细胞饲养层构建。探索Schwann细胞(Schwann cells)对胎牛血清浓度的依耐性;检测Schwann细胞在不同血清浓度下的活性及分泌状态,并应用此饲养层定向诱导毛囊神经嵴干细胞分化。方法原代培养及纯化Schwann细胞;用不同血清浓度的胎牛血清(FBS)培养基培养Schwann细胞,测定并用四氮唑盐(MTT)比色法检测Schwann细胞生长及增殖情况;使用S100特异性标识抗体间接免疫荧光法与荧光染料Hoechst 33342对Schwann细胞进行鉴定。用ELISA方法检测Schwann细胞的分泌因子。利用丝裂霉素C处理Schwann细胞建立饲养层,培养Schwann细胞和毛囊神经嵴干细胞。结果体外成功培养Schwann细胞,用S100间接免疫荧光法与核染料Hoechst33342鉴定Schwann细胞呈阳性表达,纯度约95%,成功培养毛囊神经嵴干细胞。无血清的培养基可使Schwann细胞生长状态良好。饲养层细胞能够稳定分泌神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF),可诱导毛囊神经嵴干细胞定向分化。结论无血清的培养基更利于毛囊神经嵴干细胞饲养层的构建。饲养层Schwann细胞可持续分泌NGF和BDNF等神经营养因子,可成为使毛囊神经嵴干细胞定向分化的稳定饲养层细胞。

肠神经嵴干细胞移植治疗巨结肠的研究现状

先天性巨结肠（Hirschsprung＇s disease，HD）是小儿常见疾病，发病率高达1／2000—1／5000，最显著病理生理变化是病变肠管神经发育异常或确缺如，导致局部肠管痉挛和狭窄，肠蠕动丧失和内括约肌松弛反射消失，随着近端肠管的蠕动，不断推挤肠内容物向前，引起狭窄段近端肠管扩大，

毛囊神经嵴干细胞的培养、鉴定及其向雪旺细胞诱导分化的实验研究

目的培养并鉴定Wistar小鼠毛囊神经嵴干细胞,并使其诱导分化成为雪旺细胞(Schwann cell,SCs)。方法采用Wistar小鼠毛囊隆突贴块培养法培养小鼠毛囊神经嵴干细胞,并对培养的细胞进行并行免疫荧光细胞化学双重染色鉴定,诱导染色阳性的细胞初步分化后进行S-100染色,鉴定其分化产物为雪旺细胞。结果采用Wistar小鼠毛囊隆突贴块培养法培养的毛囊神经嵴干细胞,免疫细胞化学染色呈现nestin及P75双阳性;对培养贴壁出的细胞胰酶消化后传代培养,诱导分化后进行S-100免疫细胞化学染色显示S-100阳性细胞突起的末端呈扁平状膨大。结论 利用Wistar小鼠毛囊可以体外培养出毛囊神经嵴干细胞,对其进行初步的诱导分化可以得到S-100阳性的细胞。

颅神经嵴干细胞的发育生物学特征

颅神经嵴干细胞可特征性地分化成颌面部硬组织,形成上下颌骨及牙体(釉质除外)牙周组织。颅神经嵴干细胞发生于早期胚胎神经板,具有多能分化、广泛迁移、模式预成、可塑性等生物学特性,在内外多因素调控下发生不同的分化。

新生大鼠肠神经嵴干细胞的体外培养和鉴定

目的探索体外分离培养新生大鼠肠神经嵴干细胞(ENCSCs)的方法,观察肠神经嵴干细胞神经球(NLBs)的原代及分化情况。方法取新生SD大鼠,无菌环境下解剖分离从小肠至直肠的肠管,胰酶消化成单细胞悬液后,接种于培养瓶行原代培养,并传代;传到第3代时,加入分化培养基进行分化培养。观察ENCSCs原代培养及分化培养的情况,免疫荧光染色观察NLBs巢蛋白(nestin)的表达以及分化后ENCSCs Hu D蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。结果 ENCSCs原代培养第1天,可见细胞贴壁成长,第2天,贴壁细胞减少,出现大量悬浮的细胞团,第4天,悬浮细胞团增大,形成体积稍小的NLBs,7 d后,大量NLBs漂浮于培养液中。未分化的NLBs行免疫荧光染色可见nestin阳性表达;NLBs分化后贴壁的细胞可见Hu D、GFAP阳性表达。结论新生大鼠肠道可提取出ENCSCs,培育出ENCSCs神经球,并能够分化成神经元和神经胶质细胞。

miR-21促进毛囊神经嵴干细胞分化为许旺细胞

背景:mi RNAs是一类长18-25个碱基的非编码单链小RNA分子,可以与m RNA分子的3’UTR上序列互补结合而调节目标基因的蛋白表达水平。大量证据表明,mi RNAs可能起到调节许旺细胞分化、髓鞘形成以及周围神经生长和发育的作用。目的:观察mi R-21在毛囊神经嵴干细胞分化为许旺细胞过程中的表达。方法:培养毛囊干细胞,通过流式分选法从人毛囊中分离神经嵴干细胞,并定向诱导为许旺细胞,在诱导过程中采用q RT-PCR检测mi R-21的表达水平。将毛囊神经嵴干细胞分为对照组、agomir-21组、agomir-NC组、antagomir-21组和antagomir-NC组。对照组无干预,agomir-21组加入mi R-21的激动剂,antagomir-21组加入mi R-21的抑制剂,agomir-NC组和antagomir-NC组分别为agomir-21和antagomir-21的阴性对照组,加入无活性的micro RNA类似物。最后,通过数据库寻找mi R-21可能的作用靶标。结果与结论:在毛囊神经嵴干细胞诱导分化为许旺细胞过程中,mi R-21表达水平逐渐升高。转染mi R-21激动剂agomir-21后,干细胞分化为许旺细胞的能力增强,而转染mi R-21抑制剂antagomir-21后可削弱干细胞的分化能力。通过数据库检索发现,SOX2可能是mi R-21重要靶基因并参与其调节干细胞分化的作用。结果提示,毛囊神经嵴干细胞可作为许旺细胞的一个重要来源,mi R-21可促进此分化过程。

躯干神经嵴干细胞壳聚糖纤维复合硅胶管治疗坐骨神经损伤的实验研究

目的探讨体外培养的躯干神经嵴干细胞在壳聚糖纤维上立体培养后复合硅胶管治疗坐骨神经损伤的实验研究。方法采用孕10.5d Wistar大鼠的胚胎神经管分离培养躯干神经嵴干细胞,将体外培养48 h的躯干神经嵴干细胞接种在壳聚糖纤维材料上,观察两者的组织相容性。应用黏附有躯干神经嵴干细胞壳聚糖纤维复合硅胶管桥接了缺损的大鼠坐骨神经,术后进行电生理、组织学检测,观察了周围神经再生及神经通路重建的状况。结果从神经管取材的躯干神经嵴干细胞在无血清培养基内可以大量扩增;将躯干神经嵴干细胞接种在壳聚糖纤维支架材料上行扫描电镜观察,可见躯干神经嵴干细胞贴附在壳聚糖纤维表面,存活良好,表明躯干神经嵴干细胞与壳聚糖纤维支架材料有良好的相容性;桥接手术后,电生理检测结果显示,含躯干神经嵴干细胞的壳聚糖-硅胶管桥接组坐骨神经传导潜速率及波幅值显著好于单纯硅胶管桥接组(均P<0.01);甲苯胺蓝染色光镜观察及图像分析结果均显示含躯干神经嵴干细胞的壳聚糖-硅胶管桥接组再生轴突的髓鞘化更明显,再生纤维密度及直径等各检测指标均优于单纯硅胶管桥接组(均P<0.01)。结论壳聚糖纤维支架材料与躯干神经嵴干细胞构建的桥接管具有良好的生物相容性,其中躯干神经嵴干细胞可分化为施万细胞,以此桥接缺损的周围神经,可促进其再生和修复。

EGF和FGF-2对猪皮下脂肪神经嵴干细胞增殖和分化的影响

【目的】探究表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)和成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF-2)对猪皮下脂肪神经嵴干细胞(neural crest stem cells, NCSCs)增殖及分化的影响,以优化猪皮下脂肪神经嵴干细胞的培养条件。【方法】通过体外分离培养原代猪皮下脂肪NCSCs,免疫荧光染色鉴定NCSCs标志物p75 NTR,并用不同浓度的EGF和FGF-2(0和0、10和10、10和20、20和10、20和20、30和30 ng/mL)作用于传代猪皮下脂肪NCSCs,用CCK-8试剂盒测定细胞增殖率,确定细胞生长的最适EGF和FGF-2浓度,将试验分为空白组和最适浓度组,测定两组细胞的生长曲线,成脂化诱导后油红O染色,对比两组细胞的脂滴生成量。【结果】免疫荧光染色结果显示,原代猪皮下脂肪NCSCs经p75 NTR鉴定呈阳性。CCK-8细胞增殖试验结果显示,EGF和FGF-2的浓度均为20 ng/mL时对传代猪皮下脂肪NCSCs的促增殖作用最佳。生长曲线显示,两组细胞均在第5~9天处于对数生长期,第10~15天细胞增殖减缓,逐渐到达停滞期。油红O染色结果显示,最适浓度组胞质内的脂滴生成量远多于对照组。【结论】在培养液中添加20 ng/mL EGF和20 ng/mL FGF-2对猪皮下脂肪NCSCs的增殖和分化有促进作用。

大鼠毛囊神经嵴干细胞分离培养及鉴定

目的:采用显微分离+组织块贴壁法培养大鼠毛囊神经嵴干细胞(hf NCSC)。方法:显微分离SD大鼠触须部毛囊膨凸部(bugle),采用组织块贴壁法培养毛囊神经嵴干细胞,倒置显微镜下观察细胞形态。采用免疫荧光多重标记法检测Nestin和神经营养素受体p75(p75NTR)的表达。结果:用显微分离+组织块贴壁法可成功获得毛囊神经嵴干细胞,倒置显微镜下观察细胞活性好,形态多样,以梭形为主,也可见三角形、椭圆形细胞,核大而明显,多居于胞质一侧。免疫荧光鉴定显示细胞Nestin和p75NTR双阳性。结论:从SD大鼠触须部毛囊bugle区成功分离到毛囊神经嵴干细胞。

体外共培养条件下毛囊神经嵴干细胞促进神经束膜细胞迁移和增殖

目的探索体外培养神经束膜细胞的有效方案,并初步研究毛囊神经嵴干细胞(hfNCSC)对神经束膜细胞的激活作用。方法采用“限时消化-差速贴壁-化学药物”方法对大鼠坐骨神经束膜细胞进行培养和纯化,同时培养大鼠触须垫hfNCSC,并对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定。借助Transwell小室建立hfNCSC与神经束膜细胞的共培养模型,在Transwell上室接种神经束膜细胞,下室接种hfNCSC(hfNCSC共培养组)或不接种细胞(对照组),共培养6、12和18 h后进行结晶紫染色,观测神经束膜细胞的迁移情况。取hfNCSC条件培养基(hfNCSC条件培养基组)和含2%FBS的DMEM培养基(对照组)分别作用于神经束膜细胞,24、48和72 h后用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况。结果本方案可在2周的时间内获得纯度高达(97.66±2.08)%的神经束膜细胞。将神经束膜细胞与hfNCSC共培养6、12和18 h后,可见hfNCSC共培养组神经束膜细胞的迁移数较对照组增多,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。以hfNCSC条件培养基作用于神经束膜细胞24 h和48 h后,hfNCSC条件培养基组与对照组神经束膜细胞的细胞活力差异无统计学意义(P均>0.05);但作用72 h后,hfNCSC条件培养基组神经束膜细胞的细胞活力高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论“限时消化-差速贴壁-化学药物”方法可成功培养和纯化神经束膜细胞;hfNCSC可激活神经束膜细胞,促进其迁移和增殖。

毛囊神经嵴干细胞促进神经束膜细胞迁移和增殖

探索体外培养神经束膜细胞的有效方案,并初步研究毛囊神经嵴干细胞(hfNCSCs)对神经束膜细胞的激活作用。本研究创新性地采用“限时消化-差速贴壁-化学药物”的方法对大鼠坐骨神经束膜细胞进行培养和纯化,同时培养大鼠触须垫hfNCSCs,并对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定。借助于Transwell小室建立hfNCSCs与神经束膜细胞的共培养模型,在Transwell上室种植神经束膜细胞,下室分别设立hfNCSCs组和无细胞组,观测束膜细胞的迁移情况;取hfNCSCs条件培养基和无细胞培养基作用于神经束膜细胞.

毛囊神经嵴干细胞中Dhh基因过表达及其对神经束膜细胞迁移的影响

毛囊神经嵴干细胞(hfNCSCs)移植可促进周围神经损伤修复,沙漠刺猬因子(Dhh)对于神经束膜的形成有重要作用,本课题组前期实验结果显示,外源性Dhh蛋白对神经束膜细胞的早期增殖有促进作用。为了探索周围神经损伤修复更为有效的途径,本实验对大鼠触须垫hfNCSCs和坐骨神经束膜细胞进行分离、培养、纯化和鉴定,构建Dhh基因重组慢病毒,在hfNCSCs中过表达Dhh,Western blot结果显示Dhh在病毒转染第5天后稳定表达。