神经干细胞诱导分化过程中巢蛋白表达的时程变化(英文)

背景:神经干细胞和前体细胞在分化成神经元和胶质细胞过程中巢蛋白表达的动态变化是神经生物学家研究的焦点之一。目的:探讨巢蛋白(nestin)在体外诱导神经干细胞分化过程中表达的变化规律。设计:重复测量设计。地点和对象:实验地点为北京市神经外科研究所;研究对象为Wistar大鼠,雌雄不限,体质量(180±20)g;血清诱导后第3天,1,2,3,4,5,6,7,8周分别固定细胞检测巢蛋白的表达,每个时间点4个培养皿,实验重复3次。干预:血清诱导后第3天～第8周相差显微镜连续观察细胞形态的变化,免疫荧光染色检测巢蛋白表达的变化。主要观察指标:在神经干细胞体外诱导分化的不同时间点检测巢蛋白表达的变化。结果:在神经干细胞分化早期,巢蛋白表达仍呈阳性。随着分化的神经细胞、星形胶质细胞或少突胶质细胞逐渐发育成熟,巢蛋白表达逐渐减弱,到第7周时巢蛋白表达完全消失。结论:巢蛋白表达不仅是神经干细胞的重要标志,同时也出现在神经干细胞分化的早期,而且随着细胞逐渐分化成熟,其表达显著下降。体外培养情况下至分化的第7周即完全消失。

Ifitm3敲除抑制小鼠神经干细胞增殖和分化

目的建立干扰素诱导跨膜蛋白3基因(Ifitm3)敲除小鼠模型,探究Ifitm3对小鼠神经干细胞增殖和分化的影响。方法利用CRISPR/Cas9技术,建立Ifitm3敲除小鼠模型,通过基因型鉴定和Western Blot检测IFITM3的敲除效果;利用苏木素-伊红(HE)染色和流式细胞术等方法分析Ifitm3敲除小鼠和野生型小鼠的表型差异。分离并培养野生型和Ifitm3敲除小鼠成体神经干细胞,统计神经球数量和大小,qRT-PCR、Western Blot、免疫荧光技术检测神经干细胞增殖和分化的能力。结果成功建立Ifitm3敲除小鼠模型,Ifitm3敲除小鼠发育正常,组织病理学及免疫系统未见明显异常。体外实验显示Ifitm3敲除抑制小鼠神经干细胞的自我更新潜能,导致神经干细胞增殖能力下降,并且抑制神经干细胞向未成熟神经元和星形胶质细胞分化。结论IFITM3缺失导致神经干细胞增殖和分化能力下降,IFITM3可能参与了神经干细胞的功能调节。

神经巢蛋白抗原在兔骨髓源神经干细胞分化各阶段的表达

目的:检测神经巢蛋白抗原在兔骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcell,BMSCs)向神经细胞方向分化不同阶段的表达情况,为寻找骨髓基质细胞源性神经干细胞移植修复神经损伤最佳阶段提供体外实验依据。方法:以免BMSCs为实验对象,以“CYTOKINE·神经干细胞培养基”培养,并分作对照组胶质源性神经营养因子(GDNF,1μg/L)+维甲酸(0.5mg/L)组及“碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,10μg/L)组。免疫荧光细胞化学鉴定神经干细胞神经巢蛋白抗原,以流式细胞仪(FCM)鉴定分化各阶段表达神经巢蛋白的细胞比例。结果:部分兔BMSCs在相应培养条件下分裂增殖为含粗大胞质颗粒的大圆形细胞,这些细胞表达神经巢蛋白,并能进一步分化成神经组织样细胞。FCM检测结果:经纯化的BMSCs中神经巢蛋白(+)细胞占了5.52%,随着分化的进行,在对照组分化第8天为1.56%,第16天为0.47%。GDNF+维甲酸组第8天为1.84%,第16天降至0.31%。而bFGF组,分化第8天神经巢蛋白(+)细胞比例升至6.18%,第16天则降至1.33%。结论:在以上实验条件下可诱导兔BMSCs向神经干细胞及神经组织样细胞转化的功能。在BMSCs向神经组织样细胞方向分化过程中,神经巢蛋白的表达呈下降趋势。而bFGF可使表达神经巢蛋白的细胞比例增高,可用于体外富集神经干细胞。

神经生长因子诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的效果观察及相关蛋白网络分析

目的观察神经生长因子(NGF)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化的效果,并分析相关蛋白网络。方法将4周龄健康SD大鼠4只,脱臼处死取股骨分离BMSCs并传代。取第5代BMSCs制备细胞爬片,分为观察组和对照组两组,观察组加入3%DMSO、60 ng/m L NGF、DMEM/F12预诱导液预诱导2 h,预诱导完成后加入100 ng/m L NGF、DMEM/F12诱导液诱导48 h。对照组不加任何药物。诱导完成后倒置显微镜观察两组细胞形态变化,用免疫组化法检测两组BMSCs中的神经元特异性烯醇酶(NSE)蛋白,用实时荧光定量PCR法检测BMSCs中的NSE mRNA。采用生物信息学软件STRING10.0分析NGF在诱导BMSCs向神经细胞分化中参与的蛋白网络,并对网络系统中编码蛋白的基因进行功能富集分析。结果镜下可见观察组细胞体积增大,细胞核固缩,核质比降低,细长突起明显,部分细胞间以网络状连接。对照组细胞密度较均匀,形态以长梭形为主。诱导完成第1、2、4天,观察组NSE mRNA相对表达量分别为1.34±0.06、2.23±0.23、1.56±0.09,两组比较,P均<0.05。观察组诱导完成第1、2天时NSE蛋白阳性细胞数分别为(35±8)、(133±6)个,对照组未检测到NSE蛋白阳性细胞,两组比较,P均<0.05。以NGF为种子节点得到与NGF直接发生作用的105个蛋白节点,共3个中心节点,分别为NGF、神经生长因子受体和泛素C。对网络中的各个节点进行GO功能富集分析,结果富集在神经分化、神经发育及调控神经凋亡等生物学过程。NGF与Ras蛋白特定鸟嘌呤核苷酸释放因子1、脑衍生神经营养因子、生长抑制蛋白、NGF、NGFR、神经营养受体酪氨酸激酶1、神经营养受体酪氨酸激酶2、神经营养因子3、极微小蛋白激酶C、GTP结合蛋白RAC、核糖体蛋白S27A、信号传导子及转录激活子3、酪氨酸羟化酶、泛素A-52、泛素B和UBC等蛋白相互作用调控神经分化过程。模块分析结果显示中心节点NGF、NGFR和UBC在模块1中发挥核心的作用。结果 NGF可诱导大鼠BMSCs向神经细胞分化。以NGF为种子节点,筛选到105个与NGF直接发生互作的蛋白节点。NGF、NGFR和UBC在NGF诱导大鼠BMSCs向神经细胞分化的蛋白网络中发挥核心作用。

人胚胎脑组织蛋白提取物诱导人胎盘间充质干细胞向神经细胞的分化

背景:选择合适的诱导方法诱导人胎盘间充质干细胞分化为神经元样细胞是临床治疗神经损伤的关键。目的:在人胎盘间充质干细胞中加入商品化的人胚胎脑组织蛋白提取物,观察其诱导分化为神经元样细胞的可行性。方法:采用酶消化法分离培养人胎盘间充质干细胞,传至第3代,将人早期胚胎脑组织蛋白提取物加入诱导培养基培养6 d,加入浓度为20 nmol/L全反式维甲酸和500μg/L音猬因子培养3 d,换新的培养液,包含体积分数为10%胎牛血清,10μg/L脑源性神经营养因子,20μg/L神经胶质细胞源性神经营养因子,50μg/L胰岛素样生长因子Ⅱ型继续培养3 d。结果与结论:胎盘组织经酶消化后获得贴壁细胞,传至第2代细胞形态为梭形,成漩涡样生长,传至第3代细胞形态较均一。诱导后细胞经免疫细胞化学法检测均表达神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、神经丝蛋白、神经生长相关蛋白43;ELISA法检测细胞培养上清脑源性神经营养因子、神经营养因子3、神经营养因子4为阳性表达;RT-PCR检测细胞微管相关蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经丝蛋白、神经生长相关蛋白43均为阳性表达。结果表明人胚胎脑组织蛋白提取物使人胎盘间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞。

体外培养及其诱导分化人胚胰腺巢蛋白和神经元素3阳性细胞的实验

目的:观察从人胚胎胰腺体外分离培养的巢蛋白和神经元素3阳性细胞,分析其基因表达及诱导分化能力,探讨为胰腺组织工程移植提供种子细胞的可能性。方法:实验于2002-01/2004-05在北京大学干细胞中心完成。实验采用标本为北京市海淀妇产医院产科药物引产的人胚胎,引产药物为米索。使用的胚胎经孕妇同意,并签署同意书。选取18例胎龄为12～24周的人胚胰腺,用Ⅴ型胶原酶消化获得贴壁生长的人胚胰腺细胞,观察其原代培养、传代培养、增殖能力及体外诱导分化能力;胰腺干细胞标志巢蛋白和神经元素3阳性细胞及胰岛素表达应用免疫荧光染色及反转录聚合酶链反应检测;细胞总蛋白中胰岛素含量应用化学发光法检测。结果:18例胎龄为12～24周的人胚胰腺全部纳入实验。①人胚胎胰腺组织体外培养和诱导分化:人胚胎胰腺组织消化后可获得胰岛样结构,能贴壁生长,传代20代以上,然后进入凋亡期。汇合的细胞加入诱导分化培养基,24h后即可见大部分细胞聚集成团;周围散在贴壁细胞突起细长,立体感增强。随着诱导时间的延长,细胞增殖缓慢,个别细胞脱落、死亡。细胞团易于脱落漂浮,继而死亡。但仍有部分细胞及细胞团贴壁生长。②巢蛋白、胰岛素、胰高血糖素、广谱角蛋白及角蛋白19含量测定:无论是第2代还是第10代细胞中均无胰岛素、胰高血糖素CK-Pan和CK-19染色阳性的细胞。第2代细胞中,巢蛋白阳性细胞约占总细胞数的20%,个别细胞核神经元素3阳性,多数细胞为两者均阴性。第10代细胞中95%以上为巢蛋白强阳性细胞,约90%细胞神经元素3阳性且阳性部位同时存在于细胞核和细胞质中,并与巢蛋白共表达。但第18代细胞,荧光染色神经元素3染色转阴性(反转录聚合酶链反应可检测到少量mRNA的表达),而巢蛋白阳性无明显变化。③诱导前后巢蛋白和神经元素3阳性细胞及胰岛素表达:诱导前有巢蛋白、胰十二指肠同源盒基因-1、神经元素3的表达,无胰岛素表达。诱导后出现胰岛素表达,胰十二指肠同源盒基因-1表达增高,巢蛋白和神经元素3表达下降。④胰岛素含量测定结果:诱导分化后,巢蛋白和神经元素3阳性细胞的总蛋白质中含有胰岛素量为2.10IU/g总蛋白,作为阳性对照的人胚胎胰腺组织总蛋白中的含量为2.70IU/g总蛋白,而未诱导的细胞的总蛋白质中未检测到胰岛素。结论:从人胚胎胰腺可以体外分离获得巢蛋白和神经元素3阳性人胚胎胰腺干细胞,为未分化细胞,能在体外大量扩增,可长期培养。总蛋白中有胰岛素表达,有分化为胰岛素阳性细胞的潜能,有望为胰腺组织工程移植提供足够的种子细胞。

诱导牙髓干细胞神经向分化的研究进展

牙髓干细胞来源于神经嵴细胞,与其他来源的干细胞相比,具有更高的神经源性潜能。牙髓干细胞可以分化为雪旺细胞、胶质细胞以及神经元前体细胞,弥补了神经元细胞缺乏再生能力的缺陷。牙髓干细胞还可分泌神经营养因子,修复和保护神经。本文就目前诱导牙髓干细胞神经向分化的研究进展作一综述。

骨形成蛋白2在神经干细胞诱导分化中的作用

神经干细胞的多向分化潜能 ,使其成为替代治疗的内源性和外源性潜在细胞源 ,为治疗神经系统退行性疾病和中枢神经系统损伤带来了希望。神经干细胞的定向诱导分化 ,是当前神经干细胞研究领域的难点和热点。生长因子TGF beta超家族成员BMP2在骨发育形成中的重要作用已为许多研究所证实。近年来国内外对BMP2在神经系统发育中的作用进行了广泛研究 ,证实BMP2在诱导神经干细胞分化中发挥重要的作用 ,表现为一种多效性神经诱导因子。

成人骨髓源性神经干细胞诱导分化实验研究

为探讨成人骨髓分离培养神经干细胞的可行性和有效性 ,无菌条件下行骨穿 ,梯度密度离心分离获取成人骨髓源细胞 ,以“CYTOKINE·神经干细胞培养液”培养 ,确定神经干细胞的最佳体外生存环境。以细胞克隆方法判断神经干细胞增殖情况 ;以NESTIN、NSE及GFAP免疫细胞化学方法分别鉴定神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。细胞培养所涉及的细胞因子主要有GDNF(2 0ng/ml)、LIF(10ng/ml)和RA(0 5 μg/ml)等。结果发现 ,成人骨髓源细胞在相应培养条件下快速分裂增殖为大而圆并含粗大胞质颗粒的神经干细胞 ,后者形成细胞球 (或称“神经球”) ,该细胞球表达特殊的神经干细胞NESTIN抗原 ;若进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度培养 ,单个的细胞又很快形成新的神经球。神经干细胞球进一步分化 ,可见到有的细胞胞体增大并出芽 ,逐渐发育成为较成熟的长突起细胞 ,长突起相互连接、交织成网并建立有神经纤维样联系 ,表达NSE或GFAP抗原。说明成年人骨髓在一定条件诱导下可以生成神经干细胞 ;

牙髓干细胞神经向分化及神经标记物的表达

背景:牙髓干细胞由于其来源广泛、免疫原性低并具有优秀的向神经系统细胞分化的能力,因此对神经系统疾病有潜在的治疗价值。目的:总结牙髓干细胞神经源性标记物的表达特点,回顾以往牙髓干细胞向神经系统细胞分化的研究进展,为其应用于临床神经系统疾病的治疗提供研究基础。方法:应用计算机以“牙髓干细胞、神经分化、神经细胞标记物、神经”为中文检索词,以“dental pulp stem cells,neurodifferentiation,nerve biomarker,nerve”为英文检索词,检索中国知网、万方数据和PubMed数据库中的相关文献,根据纳入标准并筛选,最终选择85篇文献进行综述。结果与结论:①牙髓干细胞向神经细胞分化过程中所表达的几种常用的神经标记物主要包括:巢蛋白、性别决定基因相关转录因子2、βⅢ微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2、S100钙结合蛋白B、神经元特异性烯醇化酶、神经元特异性核蛋白,文章总结归纳了上述标记物的特点、表达的时期以及在牙髓干细胞神经向分化研究中的应用情况。②目前研究表明,判断牙髓干细胞向神经细胞分化是否成功,需要结合形态学特征以及分化后细胞的功能进行综合判断,同时使用单一标记物很难专门识别单个细胞谱系,因此,未来有必要将多个标记物应用于一种细胞类型进行分析。③文章还从生长因子、信号通路及生物支架等方面介绍了牙髓干细胞向神经样细胞分化的方法,以期为诱导牙髓干细胞神经向分化研究提供理论参考。

当归诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的 研究当归体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞 (MSCs)分化的作用。方法 通过贴壁法分离大鼠MSCs,体外扩增培养。MSC用 2 0 μl当归注射液 /ml含 10 %胎牛血清的L -DMEM为预诱导条件 ,预诱导 2 4h后用当归注射液 10 0 μl/ml不含胎牛血清的L -DMEM进行诱导。光镜下观察细胞形态 ,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果 大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。当归诱导 3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞 ,出现胞体和突起 ,免疫细胞化学染色NSE及nestin呈阳性、GFAP阴性。

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化早期胞内钙调蛋白mRNA的转录水平

背景:黄芪可促进骨髓间充质干细胞向神经元方向分化,但对于诱导机制的报道较少,目前普遍认为诱导作用可能与其具有抗氧化功能有关。目的:观察黄芪注射液诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化早期进程中细胞内钙调蛋白mRNA转录水平的变化。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-10/12在河北北方学院实验中心完成。材料:清洁级6周龄雄性大鼠1只,购自中国医科院实验动物中心。黄芪注射液为大理药业有限公司产品,批号060105。方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代按4×105L-1密度接种于12孔板,加入含200g/L黄芪注射液、体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养基进行诱导分化,制备的细胞爬片行免疫细胞化学染色。传至第5代细胞平均分配到4个离心管内,1管为对照组,另外3管加入上述诱导培养基分别作用30,60,120min,消化获取的细胞采用RT-PCR技术检测钙调蛋白mRNA的转录水平。主要观察指标:黄芪对骨髓间充质干细胞的诱导作用,诱导后钙调蛋白mRNA的转录水平。结果:黄芪诱导5h后,可见少量细胞形态发生改变,胞体变圆,自胞体伸出细长突起,免疫细胞化学染色后可见巢蛋白阳性细胞和神经元特异性烯醇化酶阳性细胞,少量细胞呈微管相关蛋白2阳性,而神经胶质纤维酸性蛋白呈弱阳性。RT-PCR实验显示,在黄芪诱导骨髓间充质干细胞分化的早期,钙调蛋白基因进行了转录,随着诱导时间的延长,钙调蛋白mRNA的相对含量逐渐增加,诱导30,60,120min组与对照组钙调蛋白mRNA的相对含量比较差异有显著性意义(F=153.315,P=0.000)。结论:黄芪诱导骨髓间充质干细胞向神经元方向分化初期细胞内钙调蛋白转录水平上调,提示其诱导作用可能与钙调蛋白介导的信号转导途径有关。

体外诱导骨髓基质细胞向神经干细胞和成熟神经细胞分化的实验研究

探索骨髓基质细胞(BMSCs)分化为神经干细胞和成熟神经细胞的可行性 ,为BMSCs在神经科学领域的应用提供依据。以犬的BMSCs为实验对象 ,利用bFGF、RA、GDNF等作为增殖或分化诱导因子 ,对各阶段细胞进行免疫细胞化学鉴定。结果发现 ,增殖培养2 4～ 72h见细胞分裂像和克隆单位 ;诱导培养 3天 ,部分细胞开始表达NSE或GFAP ,继续增殖培养仍可见细胞克隆 (干细胞特性 ) ;诱导培养第 10天有成熟神经细胞形成 (成分鉴定证实 )。说明BMSCs在体外培养条件下 ,经过多种因子的“程序性”作用 ,可以向神经干细胞、成熟神经元及胶质细胞方向分化。提示BMSCs可作为“种子细胞”在神经科学领域加以利用。

成年大鼠毛囊神经嵴干细胞的培养、鉴定及初步诱导分化

目前多以施万细胞（Schwann cell，SC）、神经干细胞（neural stem cell，NSC）12j、骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）为种子细胞构建组织工程化周围神经。然而SC传代后形态和功能逐渐改变，NSC来源受限，BMSCs向神经细胞的分化率相对较低，因此寻找理想的种子细胞势在必行。毛囊神经嵴干细胞（neural crest stem cell，NCSC）可来源于自身，取材方便，损伤小，不涉及免疫原性和伦理道德问题，且可以自我更新，并具备向神经细胞分化的优势。但是，关于毛囊NCSC国内罕见相关文献报道，而国外的研究对象多为小鼠。本研究拟从成年SD大鼠触须垫毛囊中分离培养出毛囊NCSC，为组织工程化周围神经的构建提供一种新的种子细胞。

川芎嗪诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞:最佳诱导剂量筛选

背景:目前用于体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的诱导剂众多,但多数化学诱导剂具有毒性不适合用于人体。目的:观察中药川芎嗪对大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的影响,并寻找川芎嗪诱导分化的最佳浓度。方法:SD大鼠麻醉后无菌条件下取出股骨和胫骨,离心后弃上清液,加入含体积分数为15%胎牛血清的L-DMEM培养基重新悬浮细胞并转入培养瓶培养传代,用免疫细胞化学方法检测第5代骨髓间充质干细胞CD44、CD45的表达;取含1.00,1.25,1.50g/L3种剂量盐酸川芎嗪注射液的无血清L-DMEM培养基对体外培养的第5代骨髓间充质干细胞进行诱导。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫细胞化学方法检测已诱导细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达,比较3种剂量盐酸川芎嗪注射液诱导神经元样细胞抗原表达率。结果与结论:①原代细胞接种3d后多数细胞贴壁,传代后细胞贴壁速度和增殖更快,第5代基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈放射状或漩涡状排列。②第5代骨髓间充质干细胞(98.02±0.81)%CD44表达阳性,CD45表达阴性。③诱导后细胞出现类似神经元细胞样形态;免疫细胞化学方法检测显示多数细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶阳性表达,1.25g/L浓度组细胞的神经元特异性烯醇化酶阳性表达率最高。提示川芎嗪可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,1.25g/L为最适诱导剂量。

神经干细胞体外培养鉴定及诱导分化的表型特征

背景:神经干细胞促进受损中枢神经系统结构和功能再修复具有广阔的应用前景,而进行神经干细胞体外培养鉴定及诱导分化表型的研究是实现这一应用的基础。目的:观察神经干细胞在体外培养条件下的生物学特性和分化表型特点。方法:从新生小鼠海马、嗅球提取神经干细胞。选取3代后稳定的神经干细胞采用Brd U进行标记,并进行Brd U+巢蛋白+Hochest33258免疫荧光复合染色对神经干细胞进行鉴定。体外诱导促使神经干细胞贴壁分化,对分化产生的子代细胞进行Brd U、β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白、Hochest33258复合免疫荧光染色确定分化表型。结果与结论:来源于新生鼠海马及嗅球的细胞连续传代培养后可形成稳定悬浮的类球状细胞团,且Brd U+巢蛋白免疫荧光双染阳性。神经干细胞体外诱导贴壁分化后可产生β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白阳性的子代细胞。以上结果表明体外培养的神经干细胞具有很强的自我增殖更新的能力,在培养过程中趋向于形成稳定的神经球,经体外诱导通过不对称细胞增殖、分化产生神经元和星形胶质细胞等细胞表型。

大鼠胚胎神经干细胞的纯化、诱导分化及鉴定

探讨胚胎神经干细胞 (Neural stem cell,NSCs)的体外纯化扩增、保存标记、诱导分化及其鉴定方法。将14 .5 d胎龄大鼠大脑额叶皮质 NSCs在无血清 DMEM/ F12 (含 2 0 ng/ ml b FGF,2 0 ng/ m l EGF及 B2 7辅助培养液 )培养 ,利用有限稀释法将悬浮生长的单个细胞所形成的克隆球挑选出来、通过亚克隆连续传代大量扩增而纯化 ,免疫组化鉴定 nestin抗原阳性 ;选取部分 NSCs冻存、复苏后 nestin抗原阳性 ;用 Brd U孵育 NSCs,被 Brd U标记的 NSCs及其血清诱导分化后仍均呈 Brd U阳性。用血清或饲养层诱导 NSCs分化为大量表达 Tubulin- (神经元特异性抗原微管蛋白 3)阳性的神经元和 GFAP(神经胶质纤维酸性蛋白 )阳性的神经胶质细胞。由该实验可知有限稀释单细胞克隆连续传代是分离纯化、大量扩增胚胎期大脑 NSCs的简单有效方法。饲养层细胞也能诱导 NSCs分化为神经细胞。 Brd U可标记、示踪神经系统疾病动物模型 NSCs的实验治疗。掌握 NSCs的体外纯化培养、保存标记、诱导分化及鉴定方法可为进一步研究 NSCs的生物学特性及神经系统疾病的治疗提供新方法。

体外诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞的分化

背景:人脐带间充质干细胞较骨髓、脂肪等来源的间充质干细胞易取材、更为原始,并不受伦理、法律的限制,是中枢神经系统损伤修复最具治疗潜力的细胞来源之一。目的:探讨重组人碱性成纤维生长因子、重组人表皮生长因子定向诱导人脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的潜能。方法:采用碱性成纤维生长因子、表皮生长因子作为诱导剂,体外诱导人脐带间充质干细胞;在倒置显微镜下动态观察细胞形态学变化,并用免疫荧光法检测人脐带间充质干细胞向神经干细胞分化的情况,实时荧光定量PCR技术检测诱导前后神经干细胞标记蛋白巢蛋白在mRNA水平的相对表达量。结果与结论:形态学观察经诱导后的人脐带间充质干细胞呈神经干细胞球改变;免疫荧光法及实时荧光定量PCR技术均可检测到神经干细胞标记物巢蛋白,并可进一步分化表达神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2以及神经胶质细胞蛋白、神经胶质原纤维酸性蛋白。碱性成纤维生长因子、表皮生长因子可定向诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞及神经元、神经胶质细胞分化。

人脐血干细胞培养及其向神经元样细胞定向诱导分化的研究

目的:通过体外培养脐血干细胞并诱导分化为神经元样细胞,为研究脐血干细胞移植修复脊髓损伤奠定基础。方法:用密度梯度离心法将脐血单个核细胞从脐血中分离出来,置于含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液中培养、扩增、传代,取体外扩增5代的脐血间充质干细胞(MSCs),接种于培养板内,将诱导剂3-叔丁基4-羟基茴香醚(BHA)和二甲基亚砜(DMSO)加入条件培养基静置培养,观察细胞的形态学和组织学变化,取神经元样细胞进行免疫组化检测细胞表面标志物神经元烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP),然后,在光镜下随机数取10个非重叠视野(×100),计算NSE、NF及GFAP阳性细胞占总细胞数的比例,实验结果用统计学分析。结果:光镜下hMSC在预诱导液中处理24 h后,加入诱导液,1 h后细胞形态发生变化,原来宽大扁平的hMSCs胞质向核收缩,胞体向胞核收缩成锥形且变得致密并有折光性,有较多的长突起,6 h后多数细胞均转变为类似于神经元的形态,3 d后免疫组化检测NSE、NF及GFAP的阳性率分别为(35.24±3.63)%(、33.46±3.21)%(、15.12±1.65)%。结论:脐血MSC在体外有较强的扩增能力,并且在一定条件下可以诱导成为神经元样细胞。