重组腺相关病毒转染神经干细胞球的实验研究

目的 :探讨重组腺相关病毒 2型 (rAAV2 )对神经干细胞球的转染能力。方法 :①将FITC标记的rAAV2(FITC rAAV2 )分成两组 ,A组直接与神经干细胞球混合 ,B组与肝素混匀后再与神经干细胞球混合 ,孵育 30min后在荧光显微镜下观察 ;②含有GFP报告基因的rAAV2 (rAAV2 GFP)与神经干细胞球孵育 30min后 ,分成两组 :A组继续在培养箱内培养 ,B组分散成单细胞后移植到大鼠脑内 ,一个月后分别在荧光显微镜下观察神经干细胞球和大鼠脑组织切片中报告基因的表达情况 ;③将含有低氧启动子 (低氧应答元件 ,HRE)、VEGF和GFP的rAAV2(rAAV2 HRE VEGF GFP)转染神经干细胞球后分为两组 :A组在低氧条件下培养 ,B组在常规条件下培养 ,72h后观察报告基因的表达情况。结果 :①FITC rAAV2转染神经干细胞球的结果 :A组有明亮的绿色荧光 ,B组基本无绿色荧光 ;②rAAV2 GFP转染神经干细胞球后一个月 ,A、B两组均可以看到绿色荧光 ;③rAAV2 HRE VEGF GFP转染神经干细胞球后 72h ,A组可见绿色荧光 ,B组无绿色荧光。结论 :rAAV2可以与神经干细胞球特异性结合 ,rAAV2携带的外源基因在体内和体外均可以有效表达 ,rAAV2携带外源基因的表达可以人为调控。

低温保护剂对神经干细胞球添加过程的模拟分析

建立了神经干细胞球的低温保护剂添加模型。通过计算研究了在保护剂添加过程中,神经球中不同位置的细胞体积变化情况,以及细胞内外浓度和细胞膜两侧浓差随时间和空间的变化情况;并分析了影响细胞体积变化的因素,利用该模型进行了保护剂添加程序的优化。结果表明细胞外的保护剂浓度变化较快,在球表面处不到10s接近平衡,接近球中心处15s后接近平衡;由于跨膜传质阻力的影响,胞内的保护剂浓度变化较为平缓。减小Lp和增大ω可以显著改善保护剂添加过程的细胞体积变化,神经球尺寸对细胞体积变化影响较小。添加高浓度保护剂时,可以采用等渗透压差、渗透时间间隔逐渐减小的分步添加方法,分步添加方法以四步法较好。理想的连续梯度添加方案应是低浓差和短添加时间的组合,凸曲线添加方案是一种合适的添加方法。

冷冻保护剂对神经干细胞球导入过程的模拟分析

建立了以刚性球孔隙模型为基础的神经干细胞球的冷冻保护剂导入模型。在结合跨膜传质扩散的基础上,分别对细胞内空间和细胞外空间列传质扩散方程,并通过计算,得出了不同条件下细胞内外浓度以及细胞膜两侧浓差随时间和空间的变化曲线。从结果中可以看出,细胞外的保护剂浓度变化较快,在第5 s即可接近渗透平衡;细胞内的保护剂浓度变化则较为平缓。保护剂扩散系数对于导入过程影响不大,增加神经球尺寸及溶质胞膜渗透系数可以有效地减少导入过程中的细胞浓差。低温导入过程中细胞浓差较常温导入时更大,对细胞的渗透性损伤也更为强烈。研究结果对优化冷冻保护剂的导入程序有重要的指导意义。

神经干细胞球和单层贴壁神经干细胞的培养及鉴定

目的：探讨小鼠大脑皮层源性神经干细胞（NSCs）体外培养的两种方法并对培养的细胞进行鉴定。方法：分别取孕14-16d的昆明小鼠胚胎脑皮质并用细胞球悬浮培养和单层贴壁培养两种方法进行体外培养，用光学显微镜观察NSCs的生长情况，并用免疫细胞化学鉴定NSCs特异性抗原的表达，经过血清对NSCs分化诱导后进行胶质纤维酸性蛋白及微管相关蛋白．2的检测。结果：①培养出来的细胞可以扩增生长；②这两种方法分别培养的神经干细胞球和单层神经干细胞经抗巢蛋白免疫细胞染色均呈阳性；③两种培养方法培养出的NSCs经诱导分化后，免疫细胞化学染色显示微管相关蛋白-2、神经胶质酸性蛋白染色阳性。结论：采用无血清培养基中加入特定生长因子的神经干细胞球培养和单层贴壁两种培养技术，可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的NSCs。

硒化合物对大鼠神经干细胞球分化成熟蛋白表达的影响

[目的]观察微量元素硒对神经干细胞分化成熟的影响。[方法]利用新生大鼠神经干细胞体外培养技术、小盖玻片培养法和免疫细胞化学方法,观察了无机硒(亚硒酸钠)和有机硒(硒甲基半胱氨酸)对神经干细胞向神经元分化标记蛋白NSE、星形胶质细胞分化标记蛋白GFAP、少突胶质细胞分化标记蛋白CNPase的表达状况,同时用Western-blot免疫印迹技术对神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)、β-微管蛋白(β-tubulin)、星形胶质细胞-醋酸纤维蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)、环核苷酸-3’磷酸水解酶(2’,3’-cyclicnucleotide3’phosphohydrolase,CNPase)进行了半定量分析。[结果]适量浓度的硒对神经干细胞球的分化发育有良好的促进作用。在含硒的营养液中神经干细胞分化好、形态正常。神经干细胞向神经元、神经胶质细胞方向分化比例较高。其中胶质细胞分化方向GFAP+和CNPase+细胞计数,平均每高倍视野分别为5-6个和7-12个;并且分支多、细长,网络复杂。免疫印记结果发现有机硒能明显促进神经干细胞分化成熟蛋白NSE、β-tubulin、GFAP、CNPase的表达,化学发光显影明显高于对照组。[结论]适量的硒能促进神经干细胞的分化成熟。特别是硒甲基半胱氨酸是一个低毒和高生物效应的硒营养制剂,在神经干细胞球体外分化发育中有着重要的作用。

多组分冷冻保护剂导入神经干细胞球的传质模拟

基于Maxwell-Stefan方程和两参数模型构建了神经干细胞球多组分保护剂导入模型,并模拟了多组分保护剂导入过程中细胞内外浓度及细胞膜两侧浓差的时空分布。在此基础上系统分析了多组分浓度配比、神经球尺寸、保护剂导入方式对传质渗透过程的影响。结果表明,多组分保护剂导入神经球过程中出现"逆梯度扩散"现象,胞内浓度变化总是滞后于胞外浓度变化,细胞膜两侧浓差呈现先增大后减少的趋势。改变保护剂组分的浓度配比时,不同组分的渗透特性变化规律不同。此外,神经球尺寸对中心处细胞的浓度时空分布影响显著,分步导入和连续导入能够减缓保护剂扩散,降低细胞内外浓差。本研究结果可用于指导神经球冷冻保存的实验研究,优化保护剂导入程序。

体外神经干细胞克隆球的超微结构-透射电镜观察

为观察培养的神经干细胞克隆球内部的超微结构特征,采用无血清培养技术,在体外进行小鼠纹状体神经干细胞克隆球的培养传代,经过免疫细胞化学鉴定后,对单一的神经干细胞克隆球进行固定,常规透射电镜观察。结果表明,神经干细胞可以在bFGF等生长因子存在的情况下,在无血清培养液内增殖生成悬浮状态的神经干细胞克隆球,这种克隆可被诱导生成神经细胞和神经胶质细胞,电镜下,神经干细胞克隆球内部细胞相互间可形成特化的膜性结构,细胞内可有小泡出现,部分细胞有凋亡的形态。

胚胎小鼠听皮层区域神经干细胞的分离培养及鉴定

目的通过剖腹手术从C57BL/6胎鼠(E14左右)中获得听皮层区域组织,进行神经干细胞体外培养和分化鉴定,探索新的自体NSC移植治疗来源。方法选取孕14天左右的C57BL/6小鼠,剖腹取出胎鼠,分离听皮层区域组织,在体外无血清培养得到NSC,用免疫荧光细胞染色法进行NSC特异性标记物(Nestin)、增殖能力(BrdU)及多向分化潜能的鉴定。结果听皮层区域组织在体外通过无血清培养能够得到大量细胞球,经Nestin及Brdu鉴定为NSC球且具有较高增殖能力。NSC球在体外分化后产生β微管蛋白(β-TubulinⅢ)阳性的神经元以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性的星形胶质细胞。结论胎鼠听皮层区域在体外无血清培养可获得大量具有增殖能力和多向分化潜能NSCs,是自体NSCs移植治疗新的种子来源。

SD大鼠胚胎神经干细胞悬浮培养与鉴定

目的:研究神经干细胞(NSCs)的分离、培养及鉴定方法。方法:以孕12.5 d SD胚胎鼠端脑为组织来源,应用无血清悬浮培养技术培养、扩增NSCs;NSCs传代2次后,应用Nestin免疫荧光检测NSCs的干细胞特性,Brd U标记法检测细胞增殖能力;诱导贴壁分化后,对分化细胞进行NSE、GFAP免疫荧光鉴定;扫描电镜观察神经球及单个细胞表型。结果:培养出大量悬浮生长的NSCs球,Nestin及Brd U表达阳性;神经球诱导分化后表达NSE、GFAP,表明NSCs可分化为神经元和星形胶质细胞;HE染色可见NSCs细胞核巨大,胞质较少;扫描电镜可观察到单个NSC表面较光滑,且神经球表面的NSCs连接较疏散。结论:应用无血清培养技术体外培养扩增出的胚胎神经干细胞具有自我更新和多向分化能力,经诱导后可分化为神经元和星形胶质细胞。

EGF对神经干细胞迁移的影响

目的研究表皮生长因子(EGF)对神经干细胞迁移的影响.方法取孕13～14 d SD大鼠胚胎纹状体行神经干细胞培养,7 d后取悬浮神经球制成单细胞悬液再培养,EGF作用下连续培养14 d后分为实验组和对照组,继续培养,观察EGF对神经干细胞迁移的影响.结果原代培养的细胞球是神经干细胞,EGF传代培养14d时细胞球大小约100个细胞左右,实验组观察到第14d细胞球增殖变慢,细胞球长出突起与邻近的细胞球相接触,14～17 d观察到神经干细胞迁移,17 d后细胞迁移现象消失;对照组中未观察到细胞迁移.结论EGF在某一特定时间内能够诱导神经干细胞迁移.

梯度有序支架材料诱导神经干细胞的定向迁移

基质细胞衍生因子-1α(stromal-cell-derived factor-1α, SDF1α)在诱导神经干细胞(neural stem cells, NSCs)迁移中发挥重要作用.采用静电纺丝技术制备放射状梯度有序纤维支架材料负载胶原特异结合的SDF1α(collagen-binding domain SDF1α, CBD-SDF1α),针对神经干细胞及神经干细胞球(neural stem cell sphere, NSCS)迁移效果的影响进行了研究.实验结果表明:梯度支架可诱导神经干细胞以及神经干细胞球沿着有序纤维支架从CBD-SDF1α低浓度区域向高浓度区域迁移;神经干细胞球在CBD-SDF1α高浓度区域扩散出的神经干细胞数量和扩散面积比CBD-SDF1α低浓度区域显著增加;神经干细胞球沿着梯度有序纤维方向上呈现极化及定向延伸.

神经干单细胞获得的一种方法

目的寻找一种有效获得神经干细胞单细胞的方法。方法运用胰蛋白酶,EDTA和不同浓度酵素对人胚神经干细胞球进行消化,免疫细胞化学染色鉴定及其分化。结果运用一定浓度的酵素可以获得大量成活的单个神经干细胞。而运用胰蛋白酶,EDTA消化后成活细胞少。结论运用一定浓度的diapase消化神经干细胞球是可获得大量成活的神经干细胞单个细胞的方法。

C57BL/6-gfp小鼠嗅球NSC培养及定位注射方法的建立

目的建立一套稳定的绿色荧光蛋白转基因小鼠(C57BL/6-gfp)嗅球神经干细胞(NSC)体外培养的方法,并初步应用于定位注射试验,为干细胞移植治疗神经性耳聋的实验研究奠定基础。方法培养C57BL/6-gfp小鼠胚胎嗅球NSC,传代并进行分化实验,鉴定后将其立体定位注射于大鼠耳蜗核。结果所培养的NSC生长良好,可稳定传代,能够分化为三种神经细胞。定位注射后可在局部见到绿色荧光阳性的细胞团。结论该方法培养的C57BL/6-gfp小鼠胚胎嗅球NSC可稳定传代并可作为荧光标记细胞进行移植试验。

脂肪干细胞源性神经干细胞克隆球的电镜观察

目的观察脂肪干细胞(ADSCs)源性神经干细胞克隆球的超微结构形态。方法原代培养大鼠ADSCs,向神经干细胞诱导分化,分化为克隆球后,免疫荧光鉴定其Nestin表达,透射电子显微镜观察克隆球超微结构形态。结果大鼠ADSCs可诱导分化为细胞克隆球,其Nestin表达阳性,超微结构与原代培养的神经干细胞克隆球的超微结构相似。结论 ADSCs经诱导分化后形成的克隆球具有神经干细胞的特征。

成年大鼠嗅球神经干细胞的培养和鉴定

目的建立成年大鼠嗅球神经干细胞分离培养和鉴定方法,探索新的成年神经干细胞种子来源。方法用无血清方法分离培养成年大鼠嗅球来源的神经干细胞;用克隆培养、BrdU整合的方法检验培养细胞的干细胞特性;用免疫荧光细胞化学的方法检测BrdU、神经干细胞标记物Nestin和SOX2,分化的细胞标记物Tuj1、GFAP、NG2的表达。结果从成年大鼠嗅球能够分离、培养出具有自我更新、增殖的神经球,构成神经球的细胞呈Nestin和SOX2阳性,它们分化后产生Tuj1阳性的神经元、GFAP阳性的星形胶质细胞、NG2阳性的少突胶质细胞。结论成年大鼠嗅球存在神经干细胞,能够在体外进行培养、增殖、分化,是神经干细胞的新的种子来源。