人β-神经生长因子基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

目的 构建人β-神经生长因子基因(β-NGF)的真核细胞表达载体,为运用进行基因治疗和细胞移植的研究奠定基础。方法 采用RT-PCR方法从人脑肿瘤旁组织的mRNA中扩增人β-神经生长因子的基因片段,将目的基因、真核表达载体 pcDNA3 同时经 HindⅢ和 Apa双酶切、纯化、连接、转化及筛选而构建重组载体 pcDNA3-β NGF;经酶切和测序对重组体进行分析和进一步鉴定。结果 RT-PCR产物琼脂糖电泳结果显示:在预期位置有阳性条带。重组载体经酶切、测序等分析插入的基因片段为表达β-NGF的基因。结论 人β- NGF基因重组真核细胞表达载体 pcDNA3-β- NGF构建成功,为进一步开展β-NGF基因治疗脑部疾患、脊髓损伤修复等研究奠定基础。

大鼠β神经生长因子前体基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-NGF的构建

目的 克隆大鼠脑组织中神经生长因子 (NGF) β亚基前体的全长序列 ,构建其真核表达载体 p EGFP-NGF。方法 采用 RT- PCR方法扩增 NGFβ亚基前体的全长序列 ,克隆入载体 p MD18- T,转化大肠杆菌 JM10 9,挑选白色菌落行酶切鉴定、PCR鉴定及序列分析 ;利用高保真 Taq酶自重组质粒 p MD18- T/ NGF中扩增目的基因NGF,将目的基因与真核表达载体 p EGFP- N1行双酶切 ,T4连接酶连接 ,转化大肠杆菌 DH- 5 α,挑选白色菌落行酶切鉴定。结果 p MD18- T/ NGF测序结果与 Gen Bank的序列完全一致 ,p EGFP- NGF行限制性内切酶 H ind 、Bam H 酶切 ,可见酶切片断与插入基因长度相符。结论 成功从大鼠脑组织中克隆神经生长因子 (NGF) β亚基前体的全长序列 ,并构建其真核表达载体 p EGFP- NGF,为从分子水平开展 NGF转基因相关研究奠定了基础。

人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定（英文）

背景:人胶质细胞源性神经营养因子(glialcell line-derived neurotrophic factor,GDNF)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)在细胞分化过程中有重要作用。目的:构建双基因共表达载体pIRES2-GDNF-VEGF165并对其进行鉴定。方法:采用PCR法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人胶质细胞源性神经营养因子基因,然后将人胶质细胞源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-GDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-BDNF-EGFP中,最后构建成为含有内部核糖体进入位点(IRES)的pIRES2-GDNF-VEGF165双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达。结果与结论:DNA测序显示,提取的人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,相对分子质量分别为636 bp和576 bp。构建的pIRES2-GDNF-VEGF165双基因共表达载体经Bgl II/Bam HI切出GDNF条带,经Bam HI/Not I双酶切后切出IRES-VEGF165片段,经Bgl II/Not I双酶切后切出GDNF-IRES-VEGF165片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。说明实验成功构建了能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165的双基因真核表达载体。

大鼠表皮生长因子、睫状神经营养因子真核表达载体的构建及其体外表达的鉴定

背景:星形胶质细胞被激活后表现出神经干细胞的特性,细胞表面的神经营养因子(表皮生长因子、睫状神经营养因子)受体超表达,通过改善复杂的内环境,有利于定向诱导神经干细胞向神经元的分化。目的:构建大鼠pSecTag2/HygroB-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF真核表达质粒,检测其在cos-7细胞中的共表达。方法:采用反转录-聚合酶链反应技术从大鼠颌下腺、坐骨神经组织总RNA中扩增出表皮生长因子、睫状神经营养因子基因功能区,将上述基因片段分别连接到真核表达载体pSecTag2/Hygro B,聚合酶链反应初步筛选、双酶切鉴定后送测序。将构建成功的两种重组载体单独及共转染cos-7细胞,Western blot法鉴定重组表皮生长因子、睫状神经营养因子蛋白的瞬时表达。结果与结论:反转录-聚合酶链反应结果证实成功获得大鼠表皮生长因子、睫状神经营养因子cDNA。DNA序列分析证实2种真核表达载体中的表皮生长因子、睫状神经营养因子序列与GenBank中目的序列一致。脂质体介导转染cos-7细胞48h后,Western blot鉴定重组表皮生长因子、睫状神经营养因子蛋白在cos-7细胞中的表达,分别在Mr6000,22000处出现阳性条带。提示大鼠表皮生长因子、睫状神经营养因子基因的真核表达载体pSecTag2/HygroB-EGF、pSecTag2/Hygro B-CNTF构建成功,共转染cos-7细胞后能够共表达重组表皮生长因子、睫状神经营养因子蛋白。

四环素诱导性人肝细胞生长因子真核表达载体的构建与鉴定

目的构建四环素诱导性人肝细胞生长因子(HGF)真核表达载体。方法运用基因重组技术,将人HGFcDNA全长序列,定向克隆于四环素诱导性真核表达载体pBI-L多克隆位点MluI和SalI之间,限制性内切酶酶切和测序鉴定。结果重组pBI-L-HGF真核表达载体经限制性内切酶酶切,与理论值相符;测序结果与GenBank比对,序列正确。结论本实验成功构建人HGF四环素诱导性真核表达载体pBI-L-HGF,为今后临床开展HGF基因治疗提供了一种安全可调控的基因治疗策略。

碱性成纤维细胞生长因子真核荧光表达载体的构建

目的 :构建可在真核细胞中表达碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)的真核表达载体 ,为进一步开展bFGF基因治疗缺血性脑血管疾病奠定基础。方法 :①采用线栓法建立SD大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型 ,取缺血灶周围脑组织经逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)扩增bFGF基因 ;②将bFGFDNA克隆到pGEM TEasy质粒 ,经菌落PCR和HindⅢ和EcoRI双酶切鉴定 ;③然后将bFGFDNA亚克隆到pEGFP N3质粒 ;通过抗性基因筛选阳性克隆 ,经菌落PCR、酶切和测序鉴定。结果 :菌落PCR、酶切和DNA序列鉴定均证实插入片段与GenBank报道的bFGF基因序列一致。结论 :经RT

碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响

背景:已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)可抑制血管内皮细胞凋亡。目的:构建表达bFGF的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢(H2O2)诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。方法:通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR检测基因的表达。实验分为3组,对照组(转染pcDNA3.1)、过氧化氢组(转染pcDNA3.1+H2O2)和bFGF转染+过氧化氢组(转染pcDNA3.1-bFGF-GFP+H2O2),流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3 P17活性亚单位和Bax蛋白表达。结果与结论:成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA显著增加,并可观察到绿色荧光。与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量都明显增加(P<0.01),而bFGF转染+过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低(P<0.01)。证实bFGF基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax蛋白表达和caspase-3活性有关。

大鼠神经生长因子腺病毒表达载体的构建及其在星形胶质细胞中的表达

目的 构建含有大鼠 β NGF基因的重组腺病毒载体并观察其在星形胶质细胞的表达 ,为下一步在动物体内进行中枢损伤的基因治疗提供基础。方法 设计一对含有HindⅢ及SalⅠ酶切位点的 β NGF基因上下游引物 ,PCR法扩增含有大鼠 β NGFcDNA的质粒pUC19 β NGF ,产物经HindⅢ及SalⅠ双酶切 ,插入腺病毒穿梭质粒 pAdTrack CMV ,获得重组质粒pAdTrack β NGF ,经PmeⅠ酶线性化后 ,与腺病毒骨架质粒 pAdEasy 1共同转入BJ5 183中进行同源重组 ,重组子经卡那霉素抗性筛选及酶切分析 ,阳性克隆经 2 93细胞包装 ,扩增 ,空斑法测定病毒滴度 ,转化体外培养的星形胶质细胞。通过RT PCR、ELISA、Westernblot法检测其在星形胶质细胞中的表达。结果 PCR及酶切鉴定确认获得重组腺病毒载体 pAd β NGF ,重组腺病毒在 2 93细胞中包装成功 ,病毒滴度达 2× 10 11PFU/ml。病毒上清液经ELISA检测 ,β NGF表达的量为 (94 5 0± 4 5 8)ng/L。 结论 该重组腺病毒载体的构建为下一步在动物体内的表达及中枢神经系统损伤的转基因治疗提供了一定的基础。

胶质细胞源性神经营养因子基因真核荧光表达载体的构建

目的:构建可在真核细胞中表达胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotroph ic growth factor,GDNF)的荧光表达载体。方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增GDNF基因,将GDNF DNA克隆到pEGFP-N1质粒,通过抗性基因筛选阳性克隆,经酶切和测序鉴定。结果:酶切和DNA序列鉴定均证实插入片段与Genebank报道的GDNF基因序列一致。结论:成功构建了GDNF荧光真核表达载体,为从分子水平开展GDNF转基因相关研究奠定了基础。

神经生长因子免疫反应产物在鸡产蛋期圆核中表达的变化

采用免疫组织化学SP法,对鸡繁殖期间脑中圆核内神经生长因子的表达及变化进行了研究。间脑冰冻切片,DAB显色,计算机图像分析。结果发现在120d出现NGF免疫阳性神经元,随时间推移,NGF表达显著增高,于240d达到表达高峰,后随日龄增加表达下降,到产蛋后期,NGF免疫反应最弱。结果表明神经生长因子的表达,与视觉信息的刺激和生殖状况具有一定的相关性。

鼠肌肉转录调节因子MyoD基因真核表达载体的构建

目的 构建肌肉转录调节因子 Myo D基因真核表达载体 ,为深入研究 Myo D在肌肉修复中的分子调节机制 ,探讨其在肌肉损伤方面的生物学行为 ,为临床应用提供物质基础。方法 含 Myo D c DNA的质粒PEMMBC2 β5于大肠杆菌 E.Coli DH5 a内扩增 ;提取及纯化 PEMMBC2 β5质粒 ;经 DNA序列分析含 Myo Dc DNA;限制性酶切 Myo D c DNA片段 ,连接酶连接到真核表达质粒 pc DNA3- neo内 ,克隆出真核表达载体pc DNA3/ Myo D。结果 提取及纯化的 PEMMBC2 β5质粒含有大小正确的 Myo D c DNA碱基片段 ,其碱基序列为编码目的基因的正确序列 ,凝胶电泳结果证明已将此片段正确地克隆到 pc DNA3/ Myo D内。结论 成功的构建了Myo D基因的真核表达质粒 pc DNA3/ Myo D。

hVEGF_(121)基因真核表达载体的构建及其在神经干细胞中的表达

目的构建真核表达载体pEGFP-N1/hVEGF121,并转染神经干细胞(neural stem cells,NSCs),以探究人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,hVEGF121)基因导入NSCs的表达变化。方法分离培养胎鼠NSCs,并行nestin、GFAP免疫染色鉴定。采用PCR法,以hVEGF121质粒为模板,扩增hVEGF121全长编码序列,克隆入载体pMD18-T,随后又将其亚克隆入pEGFP-N1载体中,构建其真核表达载体pEGFP-N1/hVEGF121,并以Fugene 6介导转染,将hVEGF121导入NSCs。倒置显微镜检测转染后的NSCs生长变化及hVEGF121在其中的表达等情况。图像分析技术计算转染效率。RT-PCR法对hVEGF121转染的NSCs进行鉴定。结果成功分离培养到NSCs,并予以鉴定。构建了hVEGF121的真核表达载体pEGFP-N1/hVEGF121,成功地将hVEGF121转染NSCs,其转染效率约50%。被转NSCs生长良好。转染hVEGF121基因的NSCs被诱导分化后,神经球的轴突和轴丘表达神经元标志物NF-200。结论成功地将hVEGF121克隆到pEGFP-N1载体中,并实现了hVEGF121基因在NSCs的表达。

人源核不均一核糖核蛋白E1真核表达载体在神经细胞中的表达

背景:人源核不均一核糖核蛋白E1功能广泛,可参与神经系统骨架蛋白的表达。目的:为深入研究其在神经细胞中的作用,构建其真核表达载体,观察其在神经细胞中的表达。方法:利用真核表达载体pcDNATM4/His C,通过亚克隆构建核不均一核糖核蛋白E1-pcDNATM4/His C重组质粒,经酶切、测序鉴定,通过转染神经细胞SH-SY5Y,采用western-blot,RT-PCR鉴定核不均一核糖核蛋白E1重组质粒的表达,并观察转染细胞的生长现象。结果与结论:成功构建了核不均一核糖核蛋白E1的真核表达载体,mRNA和蛋白水平上均证实了该质粒可在神经细胞SH-SY5Y中正确表达。SH-SY5Y细胞在转染核不均一核糖核蛋白E1后表现为加速生长。提示该蛋白对神经细胞的生长发育具有重要的作用。该载体为进一步研究核不均一核糖核蛋白E1在神经系统中的功能提供了前提条件。

人生长激素释放激素变异受体1型基因绿色荧光蛋白真核表达载体1的构建及体外表达

目的构建人生长激素释放激素变异受体1型(GHRHR-SVT1)基因绿色荧光蛋白真核表达载体1(pEG-FP-N1)并在鼠成纤维细胞株NIH-3T3细胞中的表达。方法GHRHR-SVT1基因是由人胃癌细胞株AGS中扩增出的DNA片段,克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,用高效转染试剂将pEGFP-N1/GHRHR-SVT1转染NIH-3T3细胞,NIH-3T3细胞分3组:非转染组(对照组),只加转染试剂不加质粒;转染空质粒组(pEGFP-N1组),加转染试剂与空质粒;重组质粒转染组(pEGFP-N1/GHRHR-SVT1组),加转染试剂与重组质粒。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和流式细胞仪检测各组转染后各组NIH-3T3细胞的生长情况。结果(1)pGEFP-N1/GHRHR-SVT1经限制性内切酶XhoⅠ和Bam HⅠ双酶切产生约1 080 bp和4 700 bp 2条带。(2)构建的GHRHR-SVT1cDNA序列与GHRHR-SVT1原始序列(AF-282259)进行对比,第54位碱基突变(A突变为T),为无义突变。(3)重组质粒转染组NIH-3T3细胞增殖率明显高于对照组(P<0.01)。(4)重组质粒转染组NIH-3T3细胞增殖指数明显高于对照组(P<0.01)。结论在适当浓度GHRH(10μmol/L)的培养基中,GHRHR-SVT1能够促进NIH-3T3细胞增殖,并为肿瘤的治疗提供新的思路。

pcDNA3-hNGF真核表达载体的构建及其在大鼠骨髓基质干细胞中的表达

目的构建人神经生长因子(h NGF)真核表达载体pc DNA3-h NGF,检测其在大鼠骨髓基质干细胞中的表达。方法利用PCR扩增h NGF全长c DNA,构建真核表达载体pc DNA3-h NGF,经测序证实后将其转染至大鼠骨髓基质干细胞中,利用Western blot方法检测h NGF的表达情况。结果 DNA测序结果显示构建的pc DNA3-h NGF表达载体与实验设计相符。Western blot检测显示该重组载体转染大鼠BMSCs 72h后,有h NGF的过表达。结论构建的pc DNA3-h NGF能在骨髓基质干细胞过表达h NGF蛋白,本研究为应用神经生长因子修饰的骨髓基质干细胞进行骨折治疗奠定了基础。

广西眼镜蛇蛇毒神经生长因子基因在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建广西眼镜蛇蛇毒神经生长因子(NGF)基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NGF,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法:采用RT-PCR的方法扩增蛇毒NGF的基因片段,将目的基因、真核表达载体pcDNA3.1(-)分别酶切后回收,连接、转化而构建重组表达载体pcDNA3.1(-)-NGF,经酶切和测序对重组体进行鉴定。利用脂质体Lipofectamine～(TM) 2000方法转染NIH3T3细胞,对阳性克隆裂解上清中NGF的表达用SDS-PAGE、Western-blot的方法检测。结果:重组载体经酶切、测序分析,插入的基因片段为表达蛇毒NGF的基因,NGF基因在NIH3T3细胞中获得表达。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-NGF,并检测出在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步开展NGF基因治疗神经系统的疾病奠定了实验基础。

鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因重组真核表达载体的构建

将已经序列测定的鸡传染性支气管炎病毒 ( IBV) HB株的核蛋白基因亚克隆到表达载体 pc DNA3的Kpn 酶切位点 ,快速筛选鉴定出含有 HB核蛋白基因的重组质粒 ,经酶切、PCR及 Southern鉴定为正向插入了 HB核蛋白基因 ,将其命名为 pc DNA-N。对重组质粒进行大量扩增 ,应用聚乙二醇纯化后 ,对 SPF雏鸡进行了免疫攻毒试验 ,结果表明 ,IBV核蛋白在抗感染和抗致死方面具有一定的作用。

小鼠T-bet基因真核表达载体的构建

目的构建小鼠T—bet基因重组真核表达载体pcDNA3一T—bet,为T—bet基因治疗研究提供有效的生物表达系统。方法采用内切酶切从质粒T—bet/GFP—RV中获得约1.7 kb的小鼠T—betcDNA片段,以单酶切非定向克隆方式与真核表达质粒pcDNA3连接,构建真核表达载体pcDNA3-T-bet。结果经PCR筛选阳性重组子,双酶切鉴定T—bet基因重组方向,并测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变。结论本实验成功构建了小鼠T—bet基因真核表达载体pcDNA3-T-bet。

重组FN多肽真核表达载体pCH510衔接化疗治疗小鼠肿瘤的研究

目的 :研究肿瘤化疗后转染 pCH5 10质粒是否提高疗效 ,以及二者衔接是否需要特定的条件。 方法 :采用瘤细胞接种建立小鼠肿瘤模型 ;通过基因转染 ,观察 pCH5 10对不同接种量所形成的小鼠肿瘤的抑制作用以及小鼠肿瘤化疗后立即进行pCH5 10转染的抑瘤效果 ;采用细胞培养技术 ,观察小鼠体内注射化疗药物后 ,其对小鼠腹腔巨噬细胞和脾淋巴细胞激活功能的影响 ;采用细胞计数的方法 ,观察化疗药物所致小鼠腹腔巨噬细胞和外周血免疫细胞数量变化的动力学 ;另外小鼠肿瘤化疗后第5天进行pCH5 10转染 ,观察抑瘤效果。结果 :转染pCH5 10对不同接种量形成的小鼠肿瘤生长都有抑制作用 ,并呈负相关。化疗药物可使免疫细胞代谢降低 ,活化受阻 ,在化疗后第 3天免疫细胞数降至最低 ,约 10d左右恢复正常 ;化疗后立即连续 10d转染 pCH5 10质粒 ,疗效没有增强 ;化疗 5d后 ,再连续 15d转染 pCH5 10质粒 ,则疗效明显增强。 结论 :化疗后转染 pCH5 10质粒 ,对小鼠肿瘤治疗效果更好 ,但由于化疗既降低免疫细胞数量 ,又抑制其功能 ,化疗后立即转染pCH5 10质粒是不恰当的 ,并且转染治疗时间不宜过短。pCH5 10、化疗和化疗 +pCH5 10三者对肿瘤不同抑制特点的比较显示化疗具有两面性 ,既抑瘤又促瘤。

人β-NGF真核表达载体的构建及其表达产物的生物活性

目的在CHO细胞中共表达二氢叶酸还原酶(DHFR)基因及人神经生长因子β亚基(-βhNGF)基因,并对表达产物进行鉴定和生物活性分析。方法克隆DHFR和-βhNGF基因,测序,酶切,连接到真核表达载体pBudCE4.1中,构建人NGF基因重组表达质粒pBudCE4.1/DHFR/-βhNGF,经电转染法导入二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞(CHO-DHFR-)中,经添加Zeocin抗生素和撤除H、T(次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)双筛选,获得了DHFR+细胞克隆。经MTX加压筛选高表达-βhNGF的CHO细胞株。SDS-PAGE、ELISA和Western blot对表达产物进行鉴定,并利用鸡胚背根神经节法检测表达蛋白的生物活性。结果人神经生长因子在CHO细胞中得到较高表达,表达量达0.3μg/ml,且表达产物具有良好的生物活性。结论为大规模工业化生产重组人神经生长因子奠定了基础。