神经突起因子酵母双杂交诱饵质粒构建和转化

目的构建和转化神经突起因子(Neuritin)的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究Neuritin的功能及作用机制奠定基础。方法用PCR扩增neuritin全长cDNA中编码开放读框的基因片段;将该基因片段与pLex-A载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;将核苷酸序列正确的重组质粒转化入EGY48[p8op-LacZ]酵母菌株。结果成功构建pLexA-neuritin重组质粒。转化有重组质粒和pLexA空载体的2种EGY48[p8op-LacZ]酵母都能在SD/Gal/Raf/-His/-Ura培养基中长成白色菌落,同时,转化pLexA-pos阳性对照质粒的酵母菌在相同条件下长成蓝色菌落,但都不能在SD/-His/-Leu/-Ura培养基中生长,在SD/-His/-Ura液中培养16 h后,A600均值均为0.9。表明重组质粒表达的融合蛋白没有激活LEU2和lacZ酵母报告基因表达的活性,也没有酵母毒性作用。结论构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的人胎脑cDNA文库筛选。

备用背根猫脊髓背核组织提取液对鸡胚背根节神经突起生长的影响

应用Liu和Chambers创立的备用背根模型,切除成年雄猫(5只)一侧的L_1～L_5、L_7～S_2背根节,保留L_6背根为备用背根,术后动物存活5d。分别制备脊髓T_(12)～L_3节段手术侧(实验组)、非手术侧(对照组)背核组织及其条件培养液。以Hanks平衡盐溶液的条件培养液作为参照组。用实验组、对照组以及参照组条件培养液对Hamburger 35期Leghorn鸡胚腰段背根部进行悬滴法培养,每只动物进行一批实验。于培养24h,48h观察测量各个背根节神经突起的平均长度。在各组背根节从培养24h到48h神经突起明显增长的基础上,求出每批培养物实验组、对照组背根节平均突起长度与参照组平均突起长度的比值以及5批培养物之平均比值。比较实验组、对照组平均比值在同一观测时间内的差异,发现两个观测时间实验组平均比值都明显大于对照组者。结果提示,猫脊髓经部分去后肢背根传入后,背核组织提取液促进神经突起生长的作用增强。

电针刺激增强备用背根猫背核组织提取液的促神经突起生长效应

切除１０只雄猫的一侧Ｌ１～Ｌ５、Ｌ７～Ｓ２背根节（ＤＲＧ）。保留Ｌ８背根为备用背根。电针刺激５只猫术侧Ｌ６背根分布区的足三里和悬钟、三阴交和伏兔两组穴位１０天，另５只不针刺。术后第１１天取脊髓背核组织，制备提取液，加入培养液。参照组以Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液代替提取液。用不同的条件培养液培养鸡胚ＤＲＧ。于培养２４与４８小时测定各ＤＲＧ神经突起的长度，以同一批培养各组平均长度与参照组平均长度的比值衡量各组提取液对ＤＲＧ神经突起生长的影响。组间比较发现，针刺手术侧组的平均比值明显大于非针刺手术侧组和非手术侧组，非针刺的求侧组又明显大于非手术侧组。提示，部分去背根传入猫的背核组织提取液，其促进神经突起生长的作用增强，电针刺激穴位能进一步提高其促神经突起生长的效应。

神经突起方向离散度和密度成像定量评估肝豆状核变性患者脑核团微结构改变

目的观察神经突起方向离散度与密度成像(NODDI)定量分析肝豆状核变性(WD)基底核及丘脑核团微结构改变的价值,并评估NODDI对WD的诊断效能。方法收集27例WD患者(WD组)及性别、年龄与之匹配的健康志愿者26名(对照组)行MR扫描,采用NODDI后处理方法,获得双侧尾状核、壳核、苍白球、丘脑的NODDI参数,包括神经突内体积分数(Vic)、神经突方向离散度(ODI)和脑脊液体积分数(Viso),比较两组间差异;分析各参数与临床Young评分的相关性,并采用随机森林模型评估各参数的相对重要性及对WD的诊断效能。结果 WD组双侧尾状核、壳核、苍白球的Vic值和ODI值均低于对照组,而Viso值高于对照组(P均<0.05);与对照组比较,丘脑的Vic值降低而Viso值升高(P均<0.05),ODI值差异无统计学意义(P=0.055)。WD患者双侧尾状核、壳核、苍白球的Vic值和ODI值与临床Young评分呈负相关,壳核、苍白球的Viso值与临床评分呈正相关。采用随机森林模型,NODDI预测WD的准确率为96.23%,ROC曲线下面积为0.96。结论 NODDI可有效评估WD患者脑部铜沉积所致微观结构和代谢变化,有望用于检测WD患者脑深部核团结构改变,并评估其病情进展。

吗啡增强备用根大鼠脊髓后角组织提取液对培养鸡胚背根节的促神经突起生长的作用

用组织培养方法，探讨备用很大鼠手术侧和非手术侧脊髓后角组织提取液对鸡胚背根节（ＤＲＧ）神经突起的促生长作用，以及应用吗啡对此作用的影响。结果显示：备用根大鼠手术侧脊髓后角组织提取液作用的ＤＲＧ神经突起密度（３６．４２±４．６９），比非手术侧的（２３．９６±３．４７）明显增大。提示去初级传入纤维的脊髓后角组织具有促进ＤＲＧ神经突起生长的神经营养活性作用。应用吗啡的备用根大鼠手术侧脊髓后角组织提取液作用的ＤＲＧ神经突起密度（６４．１９±９．２４），又比备用根大鼠手术侧的大。这表明，吗啡具有进一步增强去初级传入纤维支配的脊髓后角组织提取液促进培养的ＤＲＧ神经突起生长的效应。

Neuroplastin在培养的神经元的表达及对小脑颗粒细胞神经突起生长与神经元存活的影响

研究neuroplastin在培养神经元的表达及对大鼠原代培养小脑颗粒细胞分化与存活的影响。培养大鼠小脑颗粒细胞、中脑多巴胺能神经元、海马神经元、PC12-E2、新生鼠前脑组织,用RT-PCR检测neuroplastin65 mRNA和neuroplastin55 mRNA的表达;加入neuroplastin合成肽,观察小脑颗粒细胞神经突起生长及在低钾的神经毒性条件下神经元的存活。结果表明:在培养0、7d的海马神经元、中脑多巴胺能神经元、小脑颗粒细胞以及新生鼠前脑组织、PC12-E2细胞均表达np65 mRNA、np55 mRNA,且np55 mRNA的表达高于np65 mRNA;来自neuroplastin Ig1的合成肽是1ab-s,1cd-s,1dd,1ef,1fg;来自neuroplastinIg2的合成肽是2cd和2fg。1fg,1cd-s,2cd,2fg强烈刺激神经突起的生长,1dd,1ab-s中等程度刺激神经突起的生长,1ef,1bc则无效。1cd-s,1bc,1dd,1ef,2cd,2fg能促进低钾神经毒性环境下神经元的存活,1fg,1ab-s无效。以上结果提示,neuroplastin通过亲同性结合或亲异性结合后,诱导神经突起生长和促进神经元存活。

血清型A肉毒杆菌神经毒素重链对Neuro-2a细胞的促神经突起再生作用

目的:观察血清型A肉毒杆菌神经毒素重链(botulinum neurotoxin serotype A heavy chain,Bo NT/A HC)对Neuro-2a细胞的促神经突起再生作用并探讨与其相关的细胞内信号机制。方法:采用体外细胞培养技术,在培养液中加入不同浓度的Bo NT/A HC(0.01 nmol/L、0.1 nmol/L、1 nmol/L和10 nmol/L)进行干预,于24 h、48 h和72 h时收集细胞进行免疫荧光染色,再计算细胞突起长度及有突起细胞的百分比;在此基础上,选择最有效的Bo NT/A HC浓度作为处理剂量加入细胞培养液,于Bo NT/A HC作用后不同时点收集全细胞蛋白,采用Western blot检测p-ERK1/2及p-Akt的蛋白水平。结果:当Bo NT/A HC浓度为0.1 nmol/L、1 nmol/L和10 nmol/L时,细胞突起的长度及有突起细胞的百分比与对照组相比皆明显增加,差异显著(P<0.05),其中1 nmol/L效果最显著。在细胞培养液内加入1 nmol/L Bo NT/A HC后,p-ERK1/2的蛋白水平呈增加趋势,其中Bo NT/A HC作用60 min后,p-ERK1/2的增加与对照组相比差异显著(P<0.05);与p-ERK1/2变化趋势类似,细胞培养液内加入1 nmol/L的Bo NT/A HC后,p-Akt的蛋白水平也呈增加趋势,其中Bo NT/A HC作用15 min和60 min时,p-Akt增加显著(P<0.05)。结论:一定剂量的Bo NT/A HC可以促进神经细胞突起再生和生长;Bo NT/A HC对Neuro-2a细胞的促神经突起再生作用机制可能通过激活与神经再生相关的信号蛋白ERK1/2和Akt的磷酸化而实现。

植块联合培养法探讨备用背根猫脊髓背核组织对鸡胚背根节神经突起生长的影响

５只单侧备用背根猫，于术后第５ｄ分别切取手术侧、非手术侧脊髓Ｌ_３节段背核组织植块，与Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ３５期鸡胚背根节（ＤＲＧ）进行植块联合悬滴培养，以单独ＤＲＧ培养作为参照。于培养２４ｈ、４８ｈ观察ＤＲＧ神经突起的生长情况并测量其长度。结果发现：１．所有ＤＲＧ从培养２４ｈ到４８ｈ其神经突起都有明显增长；２：同一观察时间内，参照组与对照组（ＤＲＧ与非手术侧背核植块联合培养组）神经突起的生长状况较为相似，神经突起少而短，从ＤＲＧ迁移出的细胞多。而实验组（ＤＲＧ与手术侧背核植块联合培养组）神经突起多且长，从ＤＲＧ迁移出的细胞少；３：在分别求出每批培养物的实验组、对照组ＤＲＧ神经突起平均长度与参照组者的比值及５批培养物的平均比值后，发现两个观测时间实验组的平均比值都明显大于对照组者。本研究结果提示，猫脊髓在部分腰骶背根切除后，背核组织的促神经突起生长作用增强。

OMgp不同结构域在抑制神经突起生长中的作用

OMgp(oligodendrocyte-myelin glycoprotein)是一种在中枢神经系统表达的GPI连接的糖蛋白。最新发现,它具有诱使生长锥溃变和抑制神经突起再生的作用,这一作用是通过与nogo-66等神经再生抑制因子竞争结合同一受体NgR而实现的。但其相互作用的确切部位尚不能肯定。利用GST融合蛋白表达系统,分段表达了含有不同OMgp结构域的片段,对其与NgR作用的结构域进行了研究。结果表明,在OMgp与NgR的黏附结合过程中,OMgp的亮氨酸富含重复序列结构域是必需的,只有含该结构域的OMgp蛋白片段才能黏附表达有NgR的CHO细胞,并抑制神经突起的生长;在体外,含有丝/苏氨酸富含重复序列结构域的OMgp蛋白片段虽然具有微弱的沉降NgR的功能,但并不能抑制神经突起的生长。该结果将有助于中枢神经系统损伤后神经再生的理论与治疗研究。

膝骨性关节炎滑膜神经纤维分布和神经突起因子表达及意义

目的探讨神经纤维和神经突起因子(Neuritin)在膝骨性关节炎中的表达和意义。方法应用免疫组化的方法检测Neuritin在膝骨性关节炎和单纯膝关节外伤膝关节滑膜中的表达;用Gless神经纤维染色法观察膝骨性关节炎和单纯膝关节外伤膝关节滑膜中神经纤维分布。结果 30例膝骨性关节炎滑膜中阳性表达Neuritin 22例(73.3%),30例对照滑膜中阳性表达Neuritin 13例(43.3%);神经纤维在膝骨性关节炎滑膜的分布较单纯膝关节外伤广泛。结论 Neuritin和神经纤维可能参与膝骨性关节炎膝关节疼痛的发生。

神经突起生长因子蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

目的探讨Neuritin蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其与临床病理特征和预后的相关性。方法收集在该院行手术切除的87例NSCLC组织及其对应的87例癌旁组织,采用免疫组织化学法检测癌及癌旁组织中神经突起生长因子(Neuritin)蛋白的表达,并根据二级计分法将其分为低表达和高表达部分,分析Neuritin蛋白表达水平与临床病理参数[病理类型、分化程度、肿瘤大小、淋巴结有无转移、表皮生长因子受体(EGFR)表达等]的相关性。结果 Neuritin蛋白的阳性表达位于细胞质,NSCLC组织中Neuritin蛋白以高表达为主,其表达率为75.86%(66/87),远高于癌旁组织的31.03%(27/87),差异有统计学意义(P<0.05);且NSCLC组织中Neuritin蛋白表达水平与NSCLC病理类型、分化程度、肿瘤大小、EGFR基因突变相关(P<0.05),与年龄、性别、吸烟与否、肿瘤部位、有无淋巴结转移无关(P>0.05);Neuritin高表达组的中位疾病无进展生存期(PFS)为16个月,低表达组的PFS为13个月,差异无统计学意义(P>0.05);随访数据中Neuritin高表达组的中位总生存期为37个月,低表达组为47个月,差异无统计学意义(P>0.05);结论 Neuritin蛋白在NSCLC及其癌旁组织中均有表达,其中在NSCLC组织中呈高表达,且与NSCLC病理类型、分化程度、肿瘤大小、EGFR基因突变相关,提示Neuritin可能在NSCLC的发生、发展中发挥一定作用。

备用根大鼠脊髓后角组织的两种分子量组分提取液对培养的鸡胚背根节神经元神经突起生长的影响

应用Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ－１０微浓缩器和组织培养方法，探讨备用根大鼠手术侧和非手术侧脊髓后角组织小于１０ｋＤ和大于１０ｋＤ两种分子量组分提取液对鸡胚背根节神经元的神经突起的促生长作用。结果显示：给予备用根大鼠手术侧脊髓后角组织大于１０ｋＤ组分的提取液时，背根节神经元的神经突起密度较非手术例小于１０ｋＤ组分、非手术侧大于１０ｋＤ组分和手术侧小于１０ｋＤ组分者密度明显增大．提示部分去传人纤维支配的脊髓后角组织大于１０ｋＤ组分的提取液，可能含有某些促进培养鸡胚背根节神经元神经突起生长的神经营养物质．

大鼠神经突起因子的克隆及表达载体的构建

从成年SD大鼠脑组织分离提取总RNA,反转录PCR扩增出鼠神经突起因子(neuritin)cDNA的最大开放阅读框(openingreadingframe,ORF)后,重组于克隆载体pGEM3z上,经PCR、限制内切酶鉴定和DNA测序鉴定,扩增出的cDNA426bp全部核苷酸序列与国外文献报道的完全一致;在已构建好的重组克隆载体neuritin pGEM3z基础上,将该neuritinORF亚克隆到原核表达载体pQE30上,为获取具有天然活性的neuritin蛋白及其功能研究提供了基础。

甲苯胺蓝染色法显示体外培养的神经突起

显示体外培养的神经突起的常用技术之一是经典Bodian蛋白银染色法.我室曾对此法进行过改良,不仅获得满意的染色效果,而且成功率高.但此法与其它银染技术一样,染色时间长,需要在37℃恒温箱内孵育24小时以上.本文介绍一种简便的甲苯胺蓝染色法,只需数小时就可达到类似上述的染色效果.在染色标本数量较多的情况下,此法尤为适用.1 材料和方法1.1 将盖片培养物(涂有胶原基质的盖片及附着在其基质上培养的鸡胚背根节神经突起生长晕)放入10%中性福尔马林溶液内固定1小时.1.2 自来水冲洗15分钟,用蒸馏水洗1次.1.3 把盖片培养物放入盛有1%甲苯胺蓝溶液的染色皿内,室温下染色2～4小时.染液的配方是:硼砂(Bo-rax),1克;甲苯胺蓝(Toluidine blue),1克;蒸馏水,

神经突起生长导向因子(netrin)受体家族研究进展

神经突起生长导向因子netrin是一种分泌蛋白 ,在神经发育所需的轴突导向及细胞迁移中发挥双重导向功能———吸引或排斥 ,主要依赖于生长锥所表达的不同受体结肠癌缺失蛋白 (DCC)或UNC5同源物 (UNC5H) ,从而传递不同信息。同时 ,dcc和unc5h也是肿瘤抑制基因 ,近年来的研究显示这种双重导向功能可能归因于它们属于配体依赖性受体家族。依赖性受体的重要特征是缺乏相应配体时将诱导细胞凋亡 ,因此推测DCC和UNC5H不仅为神经元传递信号所必需 ,同时也是细胞生存因子 ,与细胞存活及正常功能的发挥密切相关。

激活素A与NGF协同刺激鸡胚背根神经节神经突起生长

目的:探讨激活素A(Activin A)与神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)共同刺激鸡胚背根神经节(DRG)神经突起生长作用。方法:采用8 d的鸡胚DRG原代培养法,通过Activin A与NGF联合刺激,观察DRG神经突起生长和DRG神经元存活情况。采用RT-PCR检测钙基因相关肽(CGRP)。结果:Activin A与NGF体外联合培养3 d时DRG神经突起生长比单纯NGF组更明显,DRG神经元存活数量也明显增加,Activin A与NGF联合作用可以明显促进CGRP mRNA表达。结论:Activin A对NGF诱导的鸡胚DRG神经突起生长和维持DRG神经元存活具有增强作用,提示二者的联合应用可能为治疗神经元损伤及变性疾病的应用提供了新的数据和实验依据。

核受体相关因子1表达下调对多巴胺能细胞酪氨酸羟化酶和神经突起生长的影响

将合成的核受体相关因子1(nuclear receptor-related factor 1,Nurrl)特异性短发夹寡核苷酸(small-hairpin RNA,shRNA)序列插入真核表达载体pSilenCircle(pSC),构建Nurrl基因特异性shRNA真核表达载体,转染体外培养多巴胺能神经前体细胞系MN9D,分别采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测其对MN9D细胞内源Nurrl的干扰作用及其对酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)表达的影响,并在倒置显微镜下观察MN9D细胞神经突起生长的情况,探讨Nurrl shRNA表达载体对多巴胺能细胞表型标记物TH和以神经突起延长为特征的细胞成熟的影响。结果表明,脂质体组细胞和转染阴性对照质粒的MN9D细胞内Nurrl、TH的表达正常,而转染Nurrl shRNA真核表达载体(pSC-N1和pSC-N2)的MN9D细胞内Nurrl和TH的mRNA水平明显降低,Nurrl mRNA的下降率分别为62．3%和45．65%,TH mRNA的下降率分别为76．3%和62．6%。同时Nurrl和TH蛋白的表达亦明显下调,Nurrl蛋白的下降率分别为57．4%和72．0%,TH蛋白的下降率分别为79．1%和70．1%。另外,转染Nurrl shRNA真核表达质粒的MN9D细胞神经突起延长有所减少,但是与正常细胞无明显差异。结果提示：Nurrl shRNA真核表达载体能显著下调MN9D细胞内源Nurrl和TH mRNA和蛋白的表达,同时可能对MN9D细胞的神经突起延长有一定的抑制作用。Nurrl shRNA表达载体的成功构建为多巴胺能神经元发育以及帕金森病相关基因的功能研究奠定了基础。

神经突起方向离散度与密度成像的技术原理与临床研究进展

神经突起方向离散度与密度成像（neurite orientation dispersion and density imaging,NODDI）是一种新兴的基于磁共振扩散成像（diffusion magnetic resonance imaging,dMRI）技术的显像方法 ,可用来评估神经轴突和树突微结构复杂程度从而可以反映神经纤维的形态学信息,

NGF对鸡胚背根神经节神经突起生长作用的机制研究

目的探讨神经生长因子(nerve growth factor,NGF)促进鸡胚背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经突起生长的作用机制。方法实验采用9 d的鸡胚分离背根神经节,原代培养法,观察鸡胚DRG的体外生长情况。通过半定量PCR检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达,采用NO检测试剂盒检测NO释放水平。结果 NGF能明显促进鸡胚背根神经节神经突起生长,同时可见NGF抑制iNOS mRNA表达,NO检测结果显示,添加NGF培养的背根神经节上清NO分泌水平明显降低,与阴性对照组比较差异显著(P<0.05)。结论 NGF可促进鸡胚背根神经节神经突起生长,其作用与其下调iNOS mRNA表达及抑制神经损伤因子NO释放有关。

组织外植块对培养的鸡胚背根节神经突起生长的影响

为了解神经元的发育和周围组织的关系,本文分别用了:(1)10天鸡胚背根节与10天鸡胚心脏、皮肤、角膜、骨骼肌、肠、大脑、脊髓外植块联合培养;(2)不同时期的鸡角膜与不同胚龄的鸡胚背根节联合培养;(3)10天鸡胚背根节与雏鸡角膜内、外层联合培养。实验结果表明鸡胚心脏、皮肤和角膜外植块对背根节神经突起生长具较强的促进作用且对生长方向有明显诱导作用;骨骼肌、肠和大脑对神经突起生长也有不同程度促进作用,但脊髓却无明显作用。14、16、18天鸡胚角膜对8、10、12、14天鸡胚背根节神经突起生长有明显促进作用;12、14天鸡胚背根节在各时期角膜作用下神经突起生长都较丰富。含上皮层的雏鸡角膜外植块促进背根节神经突起生长的作用比含内皮层的角膜外植块强。