人神经系统特异表达RNA结合蛋白HuC cDNA的克隆、表达及纯化

目的克隆人神经系统表达RNA结合蛋白HuC的cDNA并原核表达纯化。方法提取人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞株总RNA,经RT-PCR扩增得到人HuC全长cDNA的克隆。将HuC cDNA克隆到原核表达载体pGEX4T-3载体中,并转化到大肠杆菌中,在获得高效表达后,利用GST纯化系统,对HuC重组蛋白进行纯化。结果经过表达及纯化条件的摸索,最终获得重组HuC蛋白。结论HuC蛋白是一种神经系统表达RNA结合蛋白,重组HuC蛋白的获得为HuC抗体的制备及进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

冷诱导RNA结合蛋白对主动脉夹层全弓置换术后神经系统并发症的影响

目的探索冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)对中低温停循环主动脉夹层全弓置换手术后患者神经系统并发症的影响。方法选取2021年1—3月在西安交通大学第一附属医院行外科手术治疗的急性A型主动脉夹层患者68例。根据术后是否发生短暂性神经系统并发症(TND)将患者分为TND组(12例)和非TND组(56例);根据术后是否发生永久性神经系统并发症(PND),将患者分为PND组(8例)和非PND组(60例)。记录患者的临床资料,采用二元Logistic回归模型,分析主动脉夹层全弓置换术后出现神经系统并发症的危险因素。结果TND组体外循环后血清CIRP水平高于非TND组[(2311±936)ng/L比(1313±528)ng/L],差异有统计学意义(P<0.05)。PND组体外循环时间长于非PND组[(172±33)min比(139±27)min],差异有统计学意义(P<0.05)。二元Logistic回归分析结果显示,体外循环后血清CIRP水平是A型主动脉夹层患者中低温停循环全弓置换术后出现TND的独立危险因素(比值比=1.002,95%置信区间:1.001~1.004,P=0.008),而体外循环时间不是术后出现PND的危险因素(比值比=1.074,95%置信区间:0.990~1.165,P=0.085)。结论体外循环后血清CIRP水平是A型主动脉夹层患者中低温停循环全弓置换术后出现TND的独立危险因素,但与PND无关。

神经系统RNA结合蛋白Musashi1 RRM1的初步结晶

目的对Musashi1发挥功能的RRM1结构域进行结晶,得到可用来衍射的蛋白晶体,为之后的结构解析打基础。方法通过构建Musashi1 RRM1的原核表达载体,并在BL21中表达、纯化高纯度的蛋白质,通过筛选结晶体条件得到蛋白晶体。结果通过系统筛选和优化晶体生长条件得到了蛋白晶体。结论Musashi1 RRM1的蛋白晶体质量较好,满足蛋白晶体衍射和数据收集的要求。

f3b基因表达下调斑马鱼胚胎中枢神经系统olig-2、Huc的表达观察

目的观察f3b基因表达下调斑马鱼胚胎中枢神经系统少突胶质细胞转录因子2(olig-2)、神经系统特异表达RNA结合蛋白(Huc)的表达情况。方法将单细胞阶段的斑马鱼胚胎随机分为两组(胚胎数量分别为90枚和85枚),分别注射针对f3b起始密码区域序列的吗啡啉反义核苷酸(ATG-MO)和作为标准对照的随机序列吗啡啉反义核苷酸(CON-MO)。在CON-MO注射后的斑马鱼胚胎中随机挑选20枚受精后24 h的胚胎作为对照组,在ATG-MO注射后出现特异表型的斑马鱼胚胎中随机挑选20枚受精后24 h的胚胎作为实验组,通过原位杂交的方法检测两组斑马鱼胚胎中枢神经系统olig-2、Huc。结果实验组、对照组斑马鱼胚胎中枢神经系统olig-2表达评分分别为(1.9±0.4)、(5.6±0.5)分,两组比较,P<0.01。实验组、对照组斑马鱼胚胎中枢神经系统Huc表达评分分别为(6.3±0.6)、(6.5±0.3)分,两组比较差异无统计学意义。结论 f3b基因表达下调斑马鱼胚胎中枢神经系统olig-2表达减弱、Huc表达无明显变化。

水稻双链RNA结合蛋白同源基因OsRBP的克隆及其表达的分析

在基因数据库中发现两个水稻EST片段与大白菜BcpLH基因的双链RNA结合结构域 (dsRBD)有同源的区域 ,根据同源片段的位置特征设计引物 ,用RT-RCR扩增粳稻 (Oryzasativasubsp .japonica)愈伤组织的cDNA ,得到大小为 1.8kb的DNA片段。该cDNA片段含完整的编码区 ,有两个典型的dsRBD ,分别与BcpLH的dsRBD在氨基酸水平上同源性为 75 %左右 ,故将其命名为OsRBP。RT -PCR表达分析显示该基因在未成熟的种子和愈伤组织中表达 ,在根、茎、叶、穗、成熟种子及胚芽鞘中没有表达信号 ,由此推测该基因的表达可能与种子和胚的早期发育相关。该研究首次从水稻中分离到双链RNA结合蛋白基因 ,并初步研究了其表达方式 。

肿瘤及胚胎组织特异表达蛋白65与低密度脂蛋白受体相关蛋白关联蛋白的结合

目的:寻找与肿瘤及胚胎组织特异表达蛋白65(cancerandembryoexpressionprotein65,CEP65)相互结合的蛋白分子,为研究CEP65在肿瘤发生中的作用机制提供线索。方法: 以CEP65为诱饵蛋白,通过酵母双杂交方法, 筛选人胚胎组织cDNA表达文库。将获得的阳性克隆cDNA片段分别克隆到原核和哺乳细胞表达质粒,通过GSTpull down和免疫共沉淀对相互作用蛋白作进一步验证。结果: 筛选到能与CEP65相互结合的低密度脂蛋白受体相关蛋白产关联蛋白(lowdensitylipoproteinreceptor relatedprotein associatedprotein1,RAP)。将分别在原核和哺乳细胞中表达的RAP与CEP65进行GSTpull down实验,结果显示,原核表达的GST RAP可以与His CEP65相互结合,而在哺乳细胞共表达的GST CEP65和Myc RAP也能相互结合。结论:RAP可以和CEP65相结合,CEP65有可能通过与RAP相互作用,在肿瘤的浸润、转移及增生中发挥其功能。

冷应激条件下猪睾丸细胞中RNA结合基序蛋白3过表达对Caspase 3表达的影响

目的:探讨冷应激(32℃)条件下,猪睾丸(ST)细胞系中RNA结合基序蛋白3(RBM3)过表达时凋亡蛋白半胱天冬酶3(Caspase 3)表达量变化情况。方法:利用本实验室成功构建的携带绿色荧光蛋白(GFP)的RBM3过表达慢病毒载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-RBM3和空病毒载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-DEST分别感染ST细胞,作为过表达病毒(OEV)组和空载体病毒(EVV)组,此外还设立野生型细胞(WTC)组作对照,利用实时荧光定量RCR(qPCR)法和Western blot分析法检测各组中RBM3 mRNA和蛋白的表达情况。然后对各组细胞进行37℃以及32℃(2 h、4 h,8 h)的冷应激处理,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测各组Caspase 3表达量的变化。结果:OEV组RBM3基因和蛋白相对表达量高于EVV组和WTC组。在37℃以及32℃冷应激实验(2 h、4 h,8 h)中,OEV组Caspase 3表达量显著低于EVV组和WTC组。结论:冷应激ST细胞中RBM3过表达能够显著地降低Caspase 3的表达程度,为RBM3基因具有抵抗低温诱导ST细胞凋亡作用提供实验依据。

寒冷环境下民猪冷诱导RNA结合蛋白基因的表达变化

为了研究民猪冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)基因组织表达及寒冷环境下表达变化情况,试验采用RT-PCR和Real-time PCR的方法检测CIRP基因在民猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪、背最长肌等器官组织中的表达情况以及寒冷环境下在肌肉中的表达变化情况。结果表明:常温下CIRP基因在所检测的7个器官组织中均有表达,呈组成型表达;寒冷环境下CIRP基因在民猪背最长肌中表达水平显著升高(P<0.05)。

利用RNA干扰抑制具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的表达

目的:构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白(RBPMS)基因siRNA的真核表达载体,观察其对RBPMS表达的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成了2条针对RBPMS基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上。将重组质粒和带FLAG标签的RBPMS共转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检验RNAi效应。结果:测序证明成功构建了RBPMSsiRNA真核表达载体;Western印迹表明构建的siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。结论:构建了RBPMSsiRNA的真核表达载体,该siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。

RNase A及其链亲和素融合蛋白在pET系统中的表达

在大肠杆菌中用pET28a表达载体表达重组RNase A。变性条件下,利用His-Resin亲和纯 化,得到60mg／L电泳纯的RNase A。纯化的RNase A复性后,利用含大量RNA分子的碱法抽提质 粒为底物,测定重组RNase A活性,与商品化的RNase A活性相当。同时在RNase A活性测定体 系中加入4 mol／L尿素会使RNA分子切割效率提高10倍左右。在此基础上,成功表达RNase A 与链亲和素(streptavidjn)的融合蛋白,经纯化复性后,该融合蛋白同时具有核酸酶、biotin结合活 性,在分子生物学中具有重要的应用价值。

鸟传染性支气管炎病毒RNA结合蛋白基因的克隆和表达

以鸟传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV)的cDNA为模板,用PCR技术克隆出编码该病毒非结构蛋白NSP9中的RNA结合蛋白基因,连接到pGEX-6p-1载体中并转入大肠杆菌DH5α中进行测序。随后将该重组载体转入大肠杆菌BL21中进行表达,通过GST亲和层析纯化得到目标蛋白。DNA测序分析表明所得克隆片段的长度为333bp,将其序列与GenBank的报道比对,可知所得结果与鸟传染性支气管炎病毒M41毒株的RNA结合蛋白基因一致。同时,所得蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分析证实其分子量为12kD,与ExPASy ProtParam所得到的预期大小一致。

卵巢上皮性癌中RNA结合基序蛋白3及环氧化酶-2的表达与意义

目的探讨卵巢上皮性癌中RNA结合基序蛋白3(RBM3)及环氧化酶-2(COX-2)的表达与意义。方法选取2018年9月至2019年5月江西省妇幼保健院收治的卵巢上皮性癌患者100例,同时选取同期的良性卵巢上皮性肿瘤患者和正常卵巢组织患者各100例。所有患者的石蜡组织标本均经手术病理学确诊,均采用免疫组化法检测RBM3和COX-2,比较RBM3和COX-2在3组中的表达情况。结果COX-2、RBM3在卵巢上皮性癌组中的阳性率均明显高于良性卵巢上皮性肿瘤组和正常卵巢组织组(P<0.05)。结论RBM3和COX-2在卵巢上皮性癌中呈高表达,因此RBM3和COX-2可作为诊断卵巢上皮性癌的重要生物学指标。

小鼠RNA结合蛋白QKI-5的生物信息学和组织表达分析及其过表达对癌症相关基因表达的影响

【目的】旨在构建小鼠Quaking基因的主要转录本Quaking-5(Qki-5)的真核表达载体,利用生物信息学软件预测分析其结构与功能特征,检测该基因的组织表达谱,并在小鼠AML12肝细胞系中探究Qki-5过表达对癌症相关基因表达的影响。【方法】提取小鼠肝脏组织的总RNA,反转录为cDNA,通过PCR扩增Qki-5转录本的蛋白编码区(Coding Sequence,CDS)全长,将获得的目的片段与线性化载体pcDNA3.1-Puro-N-3HA进行同源重组连接以获得pcDNA3.1-mQki-5。通过在线软件对Qki-5基因序列及其编码蛋白进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Qki-5基因在小鼠不同组织中的表达谱,同时使用免疫组织化学技术检测QKI-5蛋白在小鼠肝脏组织的表达分布。之后,将pcDNA3.1-mQki-5重组质粒和pcDNA3.1-Puro-N-3HA空质粒分别转染至AML12细胞,通过qPCR和Western Blotting(WB)检测Qki-5基因在mRNA和蛋白水平的表达,并进一步检测Qki-5基因在AML12细胞中过表达后对癌症相关基因表达的影响。【结果】成功构建了pcDNA3.1-mQki-5真核表达载体;小鼠Qki-5基因的CDS区长度为1026 bp,共编码341个氨基酸;小鼠QKI-5蛋白为亲水性蛋白,不含跨膜结构和信号肽,存在26个磷酸化位点,且小鼠QKI-5蛋白的三级结构与人和大鼠完全一致;在检测的12个组织中,Qki-5在小鼠全脑的表达量最高,在十二指肠的表达量最低;QKI-5在小鼠肝脏组织中主要表达于肝细胞细胞核中;在AML12细胞过表达QKI-5后,会引起癌症相关基因P53和Ccnd1的mRNA表达水平显著升高。【结论】研究成功构建了小鼠Qki-5基因真核表达载体;Qki-5基因在小鼠全脑、肺脏等组织中表达量较高;QKI-5主要表达分布于小鼠肝细胞细胞核内;此外,在AML12细胞中QKI-5的过表达会引起P53和Ccnd1的表达水平升高。研究为进一步探究小鼠Qki-5基因的功能提供了关键材料。

肿瘤中环状RNA泛素结合相关蛋白2的表达及调控作用研究进展

泛素结合相关蛋白2(UBAP2)是一种新发现的环状RNA,其在诸多人类肿瘤中异常表达并能参与调控肿瘤恶性生物学行为进程如肿瘤细胞的增殖、侵袭转移、抗凋亡和上皮间质转化等。环状RNA UBAP2(circ-UBAP2)的异常表达也与肿瘤的淋巴结转移、TNM分期、微血管浸润等病理特征有关;并且circ-UBAP2与环状RNA临床应用的研究热点如调控肿瘤细胞自噬、诱导细胞放疗和化疗耐受等也紧密相关。本文就circ-UBAP2在肿瘤中的表达、生物学作用及调控机制进行综述。

全转录组测序分析精子发生中RNA结合蛋白质的动态表达

目的系统解析RNA结合蛋白质(RBPs)在小鼠精子发生中的动态表达全貌、阶段特异性及协同表达模式,并预测其潜在调控作用。方法整合6种类型生精细胞的全转录组测序数据,分析精子发生全程差异表达的RBPs;利用时间序列分析软件(STEM)分析差异表达RBPs动态表达模式;利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)鉴定精子发生中协同表达的RBPs;通过ClusterProfiler工具分别对差异表达以及协同表达的RBPs进行GO功能富集分析。结果精子发生中共鉴定519个阶段特异表达的RBPs,并具有7种动态表达模式,其中减数分裂时期的RBPs占比最高;GO分析显示RBPs主要参与mRNA选择性剪接、加工或翻译过程;WGCNA分析获得246个共表达RBPs,其中减数分裂时期共表达RBPs占比最高。结论RBPs在精子发生中呈现阶段特异性,并且以协同表达模式发挥调控作用。其在精子发生早期阶段参与RNA加工或剪接等过程,而在后期阶段参与核糖体组装或RNA翻译等过程。

水牛脂多糖结合蛋白基因表达载体构建及其shRNA片段的筛选

试验旨在构建水牛脂多糖结合蛋白(LBP)基因融合蛋白表达载体,探讨其在293细胞中的表达情况;筛选获得可抑制水牛LBP基因表达的shRNA干扰片段。采用RT-PCR方法,以水牛肝脏cDNA为模板,扩增水牛LBP开放阅读框(ORF),将其连接到pMD18-T载体中。序列测定并分析正确后,采用SalⅠ和BamHⅠ进行双酶切,将水牛LBP基因编码区定向克隆至pDsRed-N1载体中,构建其融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP。设计2个针对LBP靶基因序列的shR-NA(774-792、1212-1231),同时设计无关序列1864作为阴性对照。合成好的shRNA序列先退火连接到pUC 57载体上,再亚克隆到慢病毒表达载体pSicoR-GFP中,将重组质粒命名为pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C),采用PCR和测序方法鉴定阳性克隆。将LBP融合蛋白表达载体和其shRNA慢病毒表达载体经脂质体共转染293细胞,48h后观测荧光蛋白表达情况。收集共转染细胞样品,采用实时定量PCR(QRT-PCR)检测LBP基因的表达,筛选有效抑制LBP基因表达的shRNA干扰序列。结果表明,成功构建水牛LBP融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP,并在293细胞中瞬时表达。PCR和测序结果均证实所构建的shRNA慢病毒表达载体pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C)为阳性克隆。共转染48h后观测,红色和绿色荧光蛋白均有表达。QRT-PCR检测结果显示,shRNA-774和shRNA-1212对293细胞中LBP基因mRNA的表达均有抑制效果,抑制效率分别为49.53%、29.27%。因此,设计合成的2条shRNA序列能有效抑制水牛LBP基因的表达,这为进一步探讨LBP基因在LPS诱导的革兰氏阴性菌跨膜机制和信号转导中的作用机理研究奠定了基础。

多房棘球蚴RNA结合蛋白EWS的原核表达及其细胞定位与功能的初步鉴定

通过对多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)RNA结合蛋白EWS(EmEWS)基因的原核表达、抗体制备、细胞定位等研究,初步探究EmEWS基因特征以及与RNA的结合能力。根据Wormbase数据库中EmEWS基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增EmEWS基因并构建重组表达质粒,诱导表达、纯化重组蛋白,制备EmEWS多克隆抗体后进行Western blot、实时荧光定量PCR、免疫荧光定位、双荧光测定。结果表明,EmEWS基因长度为1485 bp,编码495个氨基酸,在多房棘球蚴原代细胞中表达量较高,在原头蚴中最低。生物信息学分析表明,细粒棘球蚴EWS与EmEWS相似性高达98.3%,且EmEWS的RBD结构域在绦虫中高度保守。EmEWS重组蛋白大小约为54 ku,制备的多克隆抗体可识别多房棘球绦虫中天然EmEWS蛋白。细胞定位显示EmEWS主要分布在细胞膜上。双荧光试验证明EmEWS可以与结合富含UG的RNA序列结合。综合上述结果,推测EmEWS可能作为转录调控因子参与小RNA的形成,同时有助于核蛋白的运输。

RNA结合基序蛋白3在神经系统疾病中的神经保护作用

RNA结合基序蛋白3(RBM3)是一种RNA结合蛋白,在低温诱导下RBM3表达增加。近年来,RBM3在中枢神经系统中对神经的保护作用引起了人们的重点关注,被认为是一个具有潜力的治疗靶点。文中对RBM3的表达、神经保护作用机制以及在各种神经系统疾病中的研究进行了综述。

远端上游元件结合蛋白1调节肝癌细胞中长链非编码RNA表达的实验研究

目的筛选肝癌细胞中受远端上游元件结合蛋白1(FUBP1)调节的长链非编码RNA(lncRNAs)。方法通过慢病毒介导不同肝癌细胞株中(MHCC97H、MHCC97L和Huh7)过表达FUBP1,利用定量PCR的方法鉴定过表达效率。利用芯片的方法筛选过表达FUBP1后肝癌细胞株中差异表达的lncRNAs,并利用定量PCR验证结果。利用生物信息学的方法确定差异表达的lncRNAs与mRNAs的共表达网络。结果以对照组中FUBP1的表达量为1,慢病毒感染的MHCC97H、MHCC97L和Huh7肝癌细胞株中FUBP1的mRNA水平分别为3.28±0.15、2.75±0.26和4.25±0.35,明显高于对照组(均P<0.01)。芯片结果显示,共有12个lncRNA在3种细胞株中具有一致的表达变化,包括3个上调和9个下调。定量PCR验证结果与芯片结果一致,其中lnc-ARF6-3下调最明显,lnc-BCAS2-1上调最明显。lnc-BCAS2-1、lnc-USP9X-3、lncLYZ-2和lnc-C14orf135-3与FUBP1具有共表达网络。结论 FUBP1诱导肝癌细胞中lncRNAs的表达紊乱,FUBP1-lncRNAs的表达网络可能与肝癌的发展和转移密切相关。

NRSE与NRSF及其对神经元特异性基因表达的调控作用

神经限制性沉默元件(NRSE)是一段长度为21￣23bp的保守DNA序列,存在于许多神经元特异表达基因的转录调控区中,神经限制性沉默因子(NRSF)能特异性结合到NRSEdsDNA上,并通过其N端和C端阻遏结构域分别连接共阻遏蛋白Sin3A/B和CoREST,Sin3A招募HDAC对组蛋白进行去乙酰基化修饰,CoREST则作为平台蛋白招募特异的“沉默组件”,以此维持基因沉默.最近的研究显示,NRSEdsRNA能在转录水平与NRSF蛋白直接作用,而不是作为siRNA或miRNA在转录后水平启动神经元特异性基因的表达.