一种壳聚糖神经组织工程支架的制备及表征

目的：用自行研制的模具制备一种具有轴向排列多通道壳聚糖神经修复导管。方法：实验于2004-05/09在清华大学生物系生物材料与组织工程实验室完成。首先制备多孔或致密的壳聚糖空管,管内径为2~5mm,壁厚0.2~1.0mm。将一组不锈钢针平行贯穿于壳聚糖空管,用钢针固定片固定不锈钢针,然后在此壳聚糖空管中注入壳聚糖溶液,最后用冷冻干燥法成型。然后,对所得到的支架进行理化性能表征,评价多通道壳聚糖导管的溶胀性、体外降解情况,并用瑞氏染色与扫描电镜用来观察N2a细胞（Neuroblastomacells,mouse）在导管内生长情况。结果：①在0.1mol/L磷酸盐缓冲液中溶胀后,多通道壳聚糖导管的内径无显著性变化（P〉0.01）,管壁厚度增大明显（P〈0.01）。②导管在溶菌酶溶液中降解8周后,形态结构无明显变化,而且保持了足够的机械强度和韧性。③瑞氏染色显示N2a细胞核染成深蓝色,铺展在通道表面及成团分布在导管内基质之中。扫描电镜观察可清晰地显示出细胞的形态及在导管中的分布情况。结论：实验制备的多通道壳聚糖导管具有合适的溶胀性、机械强度以及神经细胞亲和性,有潜在的研究与应用价值。

自体富血小板血浆修复面神经损伤

背景:周围性面神经损伤治疗包括手术、理疗及药物等方法,但有些情况下治疗效果并不十分理想。目的:研究自体富血小板血浆在面神经损伤修复中的作用。方法:将健康大耳白兔10只双侧面神经上颊支横断后置入硅胶神经再生导管,一侧注入富血小板血浆为实验侧,另一侧注入生理盐水为对照侧。术后8周进行面神经大体观察、神经电生理检测、组织学观察、图像分析、评价面神经再生恢复情况。结果与结论:实验侧口轮匝肌动作电位潜伏期明显低于对照侧,复合神经肌肉动作电位振幅(M波)明显高于对照侧(P<0.01)。实验侧再生神经更显成熟,再生轴突较多,髓鞘分化较好,髓鞘厚度较均匀,再生轴突的直径接近正常,神经轴突较密集,排列较规则,神经纤维外膜较较对照组增厚,胶原纤维、弹力纤维层较对照组增多;对照侧再生轴突数目较少,分布不均匀,轴突发育较差,并见大量纤维结缔组织,空泡变性较实验侧为多。实验侧再生神经在有髓轴突直径、面积、髓鞘厚度及轴突计数等方面均明显优于对照侧,两组差异有显著性(P<0.01)。提示富血小板血浆在面神经损伤修复再生中具有促进作用。

夹伤与冰冻损伤大鼠股神经的选择性再生

背景:促进周围神经损伤后神经功能的恢复,一方面要尽量加快损伤处神经轴突的再生,另一方面需要提高近端与远端神经对接的精确度。目的:观察机械挤压伤与冰冻损伤2种损伤模式下周围神经损伤后神经轴突的选择性再生情况。方法:取健康8周龄雄性Sprauge-Dawley大鼠110只,分为3组,对大鼠行股神经主干夹伤、冰冻损伤或空白对照处理。造模后分别于第2,3,6,12周进行大体行为学检查,另外分别用纯蓝和荧光红标记错向长入的隐神经和正确长入的股神经肌支,逆行示踪标记运动神经元观测脊髓前角中示踪剂的分布及数目;造模后8周行电生理检查,并进行统计学分析。结果与结论:夹伤组与冰冻损伤组大鼠术侧后腿活动范围均缩小,伸腿功能均受限,但随时间的延长,功能有所恢复。股四头肌处可记录到运动诱发电位,2组之间差异无显著性意义(P>0.05)。冰冻损伤组与夹伤组在荧光显微镜下均观察到脊髓前角红染神经元逐渐增加,造模后不同时间点夹伤组红染神经元数目显著高于冰冻损伤组(P<0.05),蓝色与紫色神经元数量逐渐减少。结果提示,保持神经束膜的完整性,即使损伤范围较大也能得到轴突再生中准确对接以及损伤肢体功能的恢复。

跳跃探针式离子电导显微镜动态观察大鼠海马神经元坏死

背景:目前关于神经元坏死的分子机制研究已取得一定进展,然而由于技术水平的限制,对神经元坏死过程细胞的动态变化研究较少。应用跳跃探针式离子电导显微镜可对体外培养神经元进行实时、非接触式的连续观察。目的:采用跳跃探针式离子电导显微镜动态观察大鼠海马神经元坏死过程中细胞表面形态随时间的动态变化。方法:体外原代培养大鼠海马神经元,用1mmol/L过氧化氢溶液处理30min致神经元坏死。采用跳跃探针式离子电导显微镜连续扫描,观察神经元坏死过程中其胞体与突起的形态变化,并测量其细胞高度与体积变化。结果与结论:跳跃探针式离子电导显微镜连续扫描9h结果显示,过氧化氢组大鼠海马神经元由正常的三角形或梭形逐渐肿胀变成球形,轴突与树突出现串珠样改变,最终神经突断裂并溶解消失。同时测量细胞高度与体积后结果显示,过氧化氢组神经元细胞高度比及体积比于扫描后2-7h之间持续增加(P<0.05),扫描后7-9h之间维持于相对稳定水平,最终高度与体积值约为初始值的2倍。线性回归分析结果示在扫描后1-7h之间过氧化氢组神经元高度与体积增加量与时间呈线性相关(b=0.15,P<0.05;b=0.17,P<0.05)。结果证实,利用跳跃式离子电导显微镜技术观察大鼠海马神经元坏死,可以得到了高质量的细胞图像,更准确的细胞高度与体积的信息。

双向脉冲可实现的神经纤维选择性兴奋

背景:研究证明利用电刺激外周神经纤维可恢复一些因失去中枢神经控制的肌肉的功能。目的:验证双电极 1 mm 较近距离下双向方波脉冲实现神经选择性兴奋的正确性,并基于此实现神经的选择性兴奋。方法:成年 Wistar 大鼠 8 只,麻醉后暴露大鼠坐骨神经,将电极小心放于坐骨神经干,建立神经选择性刺激模型。实验用电极为自制 Cuff 双极性电极,刺激器采用的是 Grass S88 刺激器和 AWG2005 任意波形信号发生器。采取双电极双向刺激方式,两个电极之间距离为 1 mm,刺激波形选用脉宽为 0.2 ms 的对称双向脉冲,其输出脉冲的幅度、脉宽和延时均可调。调节刺激强度,研究双电极双向刺激下神经兴奋性的规律,以此实现神经的选择性兴奋,并利用"碰撞法"原理验证利用双电极双向刺激方法实现神经选择性兴奋的可行性。结果与结论:实验过程中神经动作电位的变化将经 P511 放大器放大后接入示波器显示,双电极刺激波形为脉宽为 0.2 ms 的对称双向脉冲。随着刺激幅度的增大,实现神经的选择性兴奋。说明用距离很近(1 mm)的双电极双向对称脉冲的方法实现了神经的选择性兴奋,并利用"碰撞法"原理证实了此种方法的有效性和可行性。

短时低频电刺激体外培养许旺细胞髓鞘的形成

背景:周围神经系统损伤后,短时低频电刺激已被证明可显著促进轴突再生和选择性功能修复,但目前对电刺激是否影响周围神经髓鞘的形成还知之甚少,而电刺激发挥作用究竟是通过神经元还是许旺细胞还有待证实。目的:建立体外背根神经元与许旺细胞联合培养模型,观察短时低频电刺激对许旺细胞髓鞘形成的影响。方法:体外培养背根神经元,纯化后预先施予电刺激(20Hz,100μs,3V),持续作用1h,24h后再加入许旺细胞悬液制成背根神经元/许旺细胞联合培养模型。在此基础上,用L-ascorbicacid诱导髓鞘形成,分别于诱导后第7,14天观察培养体系中髓鞘的形成。结果与结论:电刺激增强背根神经元分泌脑源性神经营养因子(P<0.05),经电刺激作用的背根神经元再与许旺细胞联合培养,最终表现为髓鞘形成增多以及髓鞘蛋白表达上调(P<0.05)。提示短时低频电刺激对体外许旺细胞髓鞘的形成具有促进作用,初步认为该作用至少通过刺激神经元分泌脑源性神经营养因子增多导致。