DREAM A和B在原代培养的小鼠神经细胞中的表达

目的:研究DREAM蛋白的2个主要亚型DREAM A和DREAM B在原代培养的小鼠大脑皮层星形胶质细胞、小鼠大脑皮层γ-氨基丁酸能神经元以及小鼠小脑谷氨酸能神经元中的表达水平的差异。方法:提取原代培养的小鼠大脑皮层星形胶质细胞、小鼠大脑皮层γ-氨基丁酸能神经元以及小鼠小脑谷氨酸能神经元的RNA,采用普通PCR及real time PCR的方法检测上述各种细胞中DREAM蛋白2个亚型A和B的mRNA的表达水平。结果:DREAM的两个亚型A和B在上述三种神经细胞都存在。在发育成熟的原代培养细胞中,DREAMA的mRNA水平要远高于DREAM B。在三种不同的细胞中,谷氨酸能神经元表达DREAM A的水平最高。结论:DREAM的两个亚型A和B在小鼠三种原代培养的神经细胞中的表达水平及其差异提示DREAM A是成年小鼠中DREAM的主要亚型,DREAM A和B在不同类型的神经细胞中发挥的作用及其机制有所不同。

携强绿色荧光蛋白重组慢病毒的构建及其在原代培养SD大鼠皮层神经细胞中的表达

目的:构建携带强绿色荧光蛋白的重组慢病毒(Lent/EGFP),感染原代培养SD大鼠皮层神经细胞,观察其感染能力及报告基因的表达水平。方法:采用PCR方法克隆EGFP cDNA;将EGFP基因片段亚克隆到慢病毒穿梭质粒多克隆位点内;用4质粒共转染系统在293ET细胞中包装出携带EGFP基因的重组慢病毒Lent/EGFP;重组病毒感染NIH 3T3细胞,FACS检测重组病毒滴度;Lent/EGFP感染体外培养的原代SD大鼠皮层神经细胞,共聚焦荧光纤维镜观察原代神经细胞内绿色荧光蛋白的表达情况。结果:基因测序证明克隆的EGFP cDNA与GenBank提供的序列完全一致;琼脂糖凝胶电泳结果证实EGFP正确插入pLenti6/V5TOPO;FACS检测病毒滴度为2×106;在体外分离培养的原代SD大鼠皮层神经细胞中,重组病毒感染72 h后可见较强的绿色荧光蛋白表达。结论:采用改良的4质粒共转染方法成功构建了携EGFP的重组慢病毒载体;Lent/EGFP对非分裂的神经细胞具有较强的感染能力,且携带的EGFP基因可以在神经细胞内有效表达。

胆红素诱导原代培养神经细胞内Ca^(2+)含量的变化及MgSO_4的拮抗作用

目的 探讨胆红素诱导原代培养神经细胞内Ca2 + 含量的变化 ,以及MgSO4 的拮抗作用。方法 采用胎鼠大脑皮层细胞作原代神经细胞培养 ,观察 10 0 μmol/L胆红素对不同成熟程度神经细胞内Ca2 + 含量的影响。原代培养神经细胞经Fura- 2 /AM负载 ,荧光图像分析测定细胞内Ca2 + 含量。结果 未成熟神经细胞 (培养2天 )暴露于 10 0 μmol/L胆红素 4h ,细胞内Ca2 + 从 75 .3nmol增加到 32 0 .8nmol;继续暴露 4h ,细胞内Ca2 + 增加到 40 0 .7nmol;去除胆红素暴露 ,细胞内Ca2 + 不能逆转。成熟神经细胞 (培养 8天 )暴露于 10 0 μmol/L胆红素 4h ,细胞内Ca2 + 从 70 .6nmol增加到 15 0 .8nmol;继续暴露 4h ,细胞内Ca2 + 不再增加 ;去除胆红素暴露 ,细胞内Ca2 + 浓度可显著降低。培养液中Mg2 + 加至 2mmol/L可减轻胆红素诱导的神经细胞内Ca2 + 含量变化。结论 胆红素可诱导原代培养的、未成熟的神经细胞Ca2 + 超载 ,MgSO4 可拮抗胆红素诱导的神经细胞Ca2 + 超载。

铝对原代培养神经细胞线粒体氧化功能的损伤

目的通过测定不同浓度铝对原代培养的神经细胞线粒体的氧化功能的损伤以探讨铝神经毒作用的可能机理。方法采用原代培养的神经细胞,以不同浓度进行体外三氯化铝染毒,测定细胞的死亡率、线粒体酶活力、线粒体活性氧含量和线粒体膜电位,衡量铝对线粒体氧化功能的损伤。结果随着三氯化铝体外染毒剂量(0μmolL、50μmolL、100μmolL、500μmolL)的增加,细胞的死亡率分别为(10.53%、11.99%、12.03%、25.00%)、线粒体酶活力分别为0.56、0.47、0.42和0.32、线粒体活性氧含量分别为17.12、19.71、29.67和45.46、线粒体膜电位分别为8.03、8.02、4.69和3.01。结论铝对大鼠皮层神经细胞线粒体氧化功能的损伤是其毒作用机制之一。

知母皂甙元对原代培养神经细胞M受体刺激后cGMP生成速率的影响

目的：观察知母皂甙元（ＺＭＳ）对原代培养神经细胞Ｍ受体刺激后ｃＧＭＰ生成速率的影响。方法：用放射免疫分析法测定细胞内ｃＧＭＰ水平，观察ＺＭＳ不同作用时间对Ｃａｒｂａｃｈｏｌ刺激下ｃＧＭＰ生成的影响。结果：ＺＭＳ短时间（５ｍｉｎ）作用于原代培养的神经细胞对Ｃａｒｂａｃｈｏｌ刺激下ｃＧＭＰ的生成无影响，而长时间（４８ｈ）作用明显提高Ｃａｒｂａｃｈｏｌ的刺激下ｃＧＭＰ生成量。结论：ＺＭＳ的作用与激动剂或拮抗剂不同，需要较长时间的作用才能发挥作用。

AβOs对大鼠原代海马神经细胞丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路的影响

目的:观察β-淀粉样蛋白寡聚体(AβOs)对原代培养大鼠海马神经细胞丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的影响。方法:原代培养大鼠海马神经细胞,用免疫荧光染色鉴定纯度,制备并鉴定AβOs,用不同浓度AβOs(0.25、0.5、1及10μmol/L)处理细胞48 h,采用CCK-8试验检测细胞的存活率,蛋白印迹法(Western blotting)检测细胞中细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)及p38磷酸化及总蛋白表达水平。结果:免疫荧光染色结果显示原代大鼠海马神经细胞的体外培养纯度达85%以上;低于0.5μmol/L AβOs对原代神经细胞无明显毒性作用,但可见phospho-ERK1/2和phospho-JNK蛋白表达升高;1μmol/L及更高浓度的AβOs对原代神经细胞有细胞毒性作用,同时可引起phospho-ERK1/2和phospho-JNK蛋白表达水平均降低,但总ERK1/2及总JNK蛋白表达水平未受明显影响,而phospho-p38及总p38蛋白表达水平与AβOs作用浓度呈负相关。结论:AβOs与MAPK信号通路之间的作用可因AβOs的作用浓度不同而出现差异。

影响大鼠胚胎多巴胺能神经元原代培养因素的研究

目的 试图通过方法改进获得高纯度原代多巴胺能神经元 ,并研究 Matrigel及多聚左旋赖氨酸(poly- l- lysine,PL L )等不同基质对于大鼠胚胎 13d中脑黑质神经元突起生长的不同作用。 方法 无菌技术取得孕 13d SD大鼠胚胎 ,采用改进的取材方法 ,得到胎鼠腹侧中脑细胞 ,以较高密度 (1× 10 5 / cm2 )分别种入由 Matrigel及 PL L作为基质的塑料培养皿中。体外培养 5 d后 ,对培养物进行 TH免疫细胞化学染色 ,测量 TH免疫反应突起的长度并计算 TH免疫反应神经元占细胞总数的比例。 结果和结论 1.采用改进的方法 ,能够得到高纯度的多巴胺能神经元 (多巴胺神经元占培养细胞总数的比例为 15 % ) ;2 .与 PL L相比 ,Matrigel能有效地促进多巴胺能神经元突起的生长 。

NGF和FGF对高温干扰神经细胞生长分化之保护作用的实验研究

ＮＧＦ和ＦＧＦ对高温干扰神经细胞生长分化之保护作用的实验研究管英俊＊高英茂马金龙刘凯李盛芳（山东医科大学组胚教研室＊潍坊医学院组胚教研室）本实验室的研究证明，高温可干扰神经管的形成、分化和发育，从而引起神经管畸形，并且证明在高温致畸过程中，神经上皮中...

两种方法提取乳鼠神经细胞建立缺氧/复氧损伤模型的研究

目的比较两种不同方法培养乳鼠神经细胞稳定性,并探讨H_2O_2对原代培养神经细胞造成缺氧/复氧损伤模型的最佳处理时间。方法两种方法培养原代神经细胞,加入600μmol/L H_2O_2培养50 min、2 h、3 h后换正常培养液继续培养18 h,造成神经细胞缺氧/复氧损伤。MTT法检测各组细胞生存率,检测LDH活性、SOD、MDA含量和RhoA活性。结果与空白组相比,缺氧50 min、2 h、3 h培养各组细胞存活率下降,LDH活性增加,SOD含量下降,MDA含量升高,RhoA含量增加P均<0.05。与直接法组相比,种植法组细胞在缺氧50 min、2 h各组细胞存活率高,细胞LDH漏出少,SOD含量高,MDA生成少P均<0.05。结论与直接法相比,种植法培养的神经细胞状态更稳定,缺氧50 min、复氧18 h时制作神经细胞损伤模型最接近体内缺氧损伤状态,可用于实验。

β-淀粉样蛋白对原代培养大鼠海马神经细胞Sorcin、RyR2mRNA基因表达的影响

目的研究β-淀粉样蛋白（Aβ）对原代培养的大鼠脑海马神经细胞内钙稳态相关蛋白Sorcin、RyR2mRNA的影响。方法新生1-3天的Wistar大鼠，取其海马组织，原代培养8d后，用已老化过的Aβ25-35对海马神经细胞进行1μmol／L，10μmol／L和20μmol／L剂量的染毒，培养24和48h后分别观察海马神经细胞形态、和海马神经细胞内钙调节相关蛋白Sorcin、RyR2mRNA的基因表达水平。结果随着Aβ25-35剂量的增加和染毒时间的延长，可发现随着Aβ25-35剂量的增加和染毒时间的延长，海马细胞出现细胞凋亡的比例增加，其中Aβ25-35 20μmol／L染毒48h培养海马细胞中出现了大量早期凋亡细胞和少量中期凋亡细胞。实时定量PCR结果显示，10μLmol／LAβ25-35在对原代细胞染毒24和48h后SorcinmRNA的相对表达量为（1．42±0．03）和（1．63±0．02），与对照组相比，表达增加（P〈0．05）；20μmol／L Aβ25-35在对原代细胞染毒24h和48h后SorcinmRNA的相对表达量（2．11±0．05）和（2．23±0．05），与对照组相比，表达增加（P〈0．05）；20μmol／L Aβ25-35在对原代细胞染毒24和48h后RyR2mRNA的相对表达量为（1．64±0．03）和（1．95±0．03），表达显著高于对照组相（P〈0．05）。结论Aβ具有神经毒性，可抑制海马神经细胞的生长，可通过作用于钙调节相关蛋白的表达，诱发阿尔茨海默氏病（AD）的发生。

绞股蓝皂甙抗谷氨酸诱导的氧化性神经毒性

目的:探讨绞股蓝皂甙(gypenoside,GP)对谷氨酸(glutamate熏Glu)介导的氧化性神经毒性的拮抗作用。方法:体外培养胎鼠大脑皮层神经细胞,建立Glu氧化性损伤模型,用MTT法测定细胞活力,透射电镜观察Glu所致的神经细胞死亡方式,流式细胞术分析细胞凋亡率。结果:GP以时间依赖性方式明显拮抗谷氨酸介导的氧化性神经毒性,于Glu损伤前达到最佳保护效果,Glu氧化性毒性导致神经细胞发生凋亡兼具坏死特征的死亡,Glu损伤组细胞凋亡率(21.63%)明显高于正常对照组(0.09%)及GP保护组(8.94%)。结论:GP可明显拮抗Glu介导的氧化性神经毒性。

绞谷蓝皂苷含药血清对谷氨酸氧化性神经损伤的保护作用

目的研究绞股蓝皂苷(gypenosides,GP)含药血清对谷氨酸(glutamic acid,Glu)诱导的氧化性神经损伤的保护作用。方法采用中药血清药理学方法,收集GP含药血清,以体外培养的胎鼠大脑皮层神经元为研究对象,采用倒置相差显微镜观察细胞形态;MTT法测定细胞存活率;Ho33342/PI荧光双染法鉴定细胞死亡方式;生化法检测细胞内超氧化物歧化酶(Super Oxide Dismutase,SOD)活性和谷胱甘肽(L-Glutathione,GSH)含量;流式细胞仪测细胞内游离Ca2+变化,综合评价GP含药血清对谷氨酸氧化性神经损伤的保护作用。结果谷氨酸可导致神经细胞发生凋亡和坏死;GP含药血清能明显拮抗谷氨酸的细胞损伤作用,提高细胞的存活率,维持细胞内较高GSH含量和SOD活性,抑制细胞内游离Ca2+浓度的升高。结论GP含药血清能明显拮抗Glu诱导的氧化性神经毒性,以400mg.kg-1.d-1GP灌胃含药血清作用最显著。

乳鼠脑皮质神经元的培养方法

离体原代神经元培养是研究神经元损伤和药物作用的模型，目前关于神经元培养方法多种多样。2009年4月至11月本课题组通过157只新生24h SD 大鼠大脑皮质神经元原代培养，