YAP蛋白在神经肌肉接头中作用机制的研究

目的探讨YAP蛋白对神经肌肉接头的影响及其机制。方法以质粒为模板构建YAP敲低的shRNA,用Western Blot方法检测shYAP的敲低效率,并在此基础上将shYAP包进AAV8并感染C2C12肌管,通过免疫荧光染色检测乙酰胆碱受体的长度和荧光强度。将agrin加入至分化成熟的C2C12肌管中,通过免疫荧光染色检测加入agrin后细胞核中YAP的表达情况和乙酰胆碱受体聚集情况。采用Western Blot方法检验样本在agrin处理后YAP磷酸化的合成水平和YAP结合β-环联蛋白的生成体量。结果YAP shRNA构建成功;肌管形成后敲低YAP能抑制乙酰胆碱受体聚集;agrin能促进C2C12肌管中的YAP进入细胞核;agrin能减弱YAP蛋白S127位的磷酸化。结论YAP作为agrin下游信号分子调节神经肌肉接头形成。

电针阳陵泉、脾俞穴对重症肌无力模型大鼠神经肌肉接头传递的影响

以乙酰胆碱电位 (Ach P)、小终板电位 (MEPP)及血清抗乙酰胆碱受体抗体 (Ach RAb)滴度为观察指标 ,探讨了电针“阳陵泉”、“脾俞”穴对重症肌无力模型大鼠神经肌肉接头传递过程的影响及其作用机制。结果表明 ,电针“阳陵泉”穴或“脾俞”穴均能使重症肌无力 (MG)大鼠的 Ach P与MEPP振幅升高 ,但对 Ach P时程、MEPP的频率及血清 Ach RAb滴度却没有明显影响 ;同时电针“阳陵泉”、“脾俞”二穴 ,则使 MG大鼠的 Ach P、MEPP振幅升高更加显著 ;电针穴位临近肌肉则没有如此效应。提示 ,电针“阳陵泉”、“脾俞”穴有提高 MG大鼠神经肌肉接头传递的作用。

黄芪复方对实验性自身免疫性重症肌无力模型大鼠神经肌肉接头超微结构的影响

目的:复制实验性自身免疫性重症肌无力模型大鼠,观察中药黄芪复方干预后其神经肌肉接头超微结构的变化。方法:实验于2001-01/2004-12在辽宁中医药大学附属医院完成。①选取雌性Lewis大鼠24只,随机数字表法分为模型组、正常组、中药组、西药组,6只/组。②电鳐购于美国加州,捕捞后取出电器官空运,-60℃冻存。用冷磷酸盐缓冲液将电鳐的电器官制成匀浆,制备粗提物,亲和层析技术分离提纯乙酰胆碱受体用于大鼠免疫。③除正常组外,其余组均将含有30μg乙酰胆碱受体的弗氏完全佐剂200μL注射于鼠两后足垫皮内进行初次免疫,3周后行二次免疫,将含有20μg乙酰胆碱受体的弗氏完全佐剂200μL注射于鼠两前足垫皮内,建立实验性自身免疫性重症肌无力动物模型。④初次免疫后,观察各组大鼠肌无力症状(叫声低微与活动减少是判断实验性自身免疫性重症肌无力大鼠的首发症状),并根据Lennon标准进行评分(分为0～3分,分数越高代表症状越严重)。肌电图的改变亦是判断模型建立的重要指标,故采用肌电图检测重症肌无力衰减程度,以(第5个反应波幅-第1个反应波幅)/第1个反应波幅×100%表示。⑤成模后给予药物治疗。中药组灌胃给予自拟黄芪复方(黄芪、白术、枸杞、何首乌、枳壳、升麻)8.4g/(kg·d);西药组灌胃给予强的松片5.4mg/(kg·d);正常组及模型组均灌胃给予等体积生理盐水。各组给药1次/d,连续1个月。处死大鼠,电镜下观察神经肌肉接头超微结构的变化。结果:模型组2只、西药组1只大鼠因肌无力症状恶化于初次免疫后第3周死亡脱落,共21只大鼠进入结果分析。①肌无力症状Lennon标准检测结果:模型组、中药组、西药组大鼠于初次免疫后17d开始相继出现体质量下降、活动减少、叫声低微等肌无力症状,按Lennon分级评为1分;3只症状迅速恶化,呈濒死态,评为3分,随后1周内相继死亡,其余大鼠呈慢性发病。正常组大鼠均无肌无力症状表现。②重症肌无力肌电图检测结果:初次免疫后第4,8周,正常组大鼠腓肠肌电图波幅均无明显变化;而模型组、中药组、西药组大鼠肌电图波幅衰退程度均大于15%,证明造模成功。③给药1个月后各组大鼠神经肌肉接头超微结构电镜结果:正常组突触前、后膜结构完好;模型组突触间隙加大,神经肌肉接头褶排列紊乱,局部溶解消失,突触小泡数量减少;中药组出现新生轴突终末分支,内含丰富的突触小泡;西药组则无新生轴突,神经肌肉接头褶排列紊乱、溶解消失,突触前部线粒体及其他细胞器空泡化依然明显。结论:实验性自身免疫性重症肌无力动物模型经中药黄芪复方治疗后,可促进其神经肌肉接头新生轴突的产生,并增加突触小泡数量,从而减轻突触损伤。

腰神经根损伤后神经肌肉接头施旺细胞的作用和表现

目的 研究腰神经根损伤后神经肌肉接头部施旺细胞在神经再支配过程中的作用及与神经元纤维的关系。方法 采用免疫萤光双标记和激光共聚焦扫描技术 ,使用S 10 0多克隆抗体标记施旺细胞 ,抗神经元纤维蛋白 (NF)单克隆抗体标记神经轴突 ,观察了大鼠L5神经根受压后 10、2 0、30和 6 0天比目鱼肌神经肌肉接头的变性及再生修复过程。运用α bungarotoxin(α BTX)萤光结合剂显示运动终板。 结果 肌肉中的神经元纤维蛋白因失神经支配导致大幅度消失 ,随着神经再支配的进行又重新呈现。而位于运动终板及其周围的施旺细胞 ,在失神经支配期间先发出突起并形成一个精细的制作过程覆盖在神经肌内接头。再生期间 ,再生的神经轴突沿施旺细胞搭建的通道生长 ,此过程表现为再生轴突生长始终伴随并落后于施旺细胞的生长。随着神经再支配的逐渐完善 ,这个过程则逐渐消退。

大鼠脊髓圆锥损伤后膀胱逼尿肌及其神经肌肉接头形态学变化的研究

目的初步探讨大鼠脊髓圆锥损伤后膀胱逼尿肌及其神经肌肉接头(neuromuscular junction,NMJ)组织形态学的变化规律。方法成年SD大鼠48只随机分为六组,每组8只。分别为正常对照组,脊髓圆锥损伤术后4、6、8、10及12周组,依次记作A^F组。采用L4、5平面锐性横断性脊髓圆锥损伤的动物模型。分别于术后相应时间点取材,先作膀胱逼尿肌HE染色,以观测肌纤维截面积的变化规律;同时制作电镜标本,观察膀胱逼尿肌及其NMJ超微结构的变化规律;最后将逼尿肌行Masson三色染色,计算平滑肌及结缔组织所占的百分比。结果HE染色观察,大鼠逼尿肌肌纤维截面积在E、F组与A组间差异有统计学意义(P<0.05);透射电镜观察,B^F组逼尿肌细胞外形、大小不一致,分布不均匀,排列走行紊乱;间质中大量排列紊乱的胶原纤维,粗面内质网明显扩张,线粒体水肿,且程度逐渐加重。逼尿肌NMJ透射电镜观察,B、C及D组可见其形态结构类似于A组,但线粒体及突触小泡的数量略少;E组可见明显退变的NMJ,突触小泡含量明显减少,伴有线粒体等细胞器减少;F组NMJ进一步退变,突触小泡含量进一步减少甚至缺如,细胞器减少或消失,并可见退变小体。Masson三色染色可见逼尿肌中结缔组织所占的比例在E、F组与A组间差异有统计学意义(P<0.05);且E、F组间差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论大鼠圆锥脊髓损伤术后10周可作为逼尿肌及其NMJ发生变化的时间节点,神经修复手术宜在此前完成。

“温阳补气”针法对EAMG大鼠神经肌肉接头处乙酰胆碱受体表达的影响

目的探讨'温阳补气'针法对实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)大鼠神经肌肉接头(NMJ)处乙酰胆碱受体(AchR)表达水平的影响机制。方法乙酰胆碱受体α1(AchRα1)129~145多肽片段与弗氏完全佐剂(CFA)混合免疫接种SPF三级Lewis雌性大鼠,建立EAMG大鼠动物模型。随机选取建模成功的EAMG大鼠30只,分成针灸治疗组10只、药物对照组10只、模型对照组10只,并将同期购进的未建模的10只大鼠设为空白对照组。针灸治疗组大鼠予以'温阳补气'针法治疗,30 min/次,1次/d,7 d为1个疗程,疗程间休息1 d,连续治疗2个疗程;药物对照组予以溴吡斯的明灌胃治疗,18.5 mg·kg-1·d-1,连续治疗15 d;其余两组不予任何特殊处置,仅作对照观察。治疗结束后,采用ELISA法测定大鼠NMJ处AchR的含量。结果经治疗后,针灸治疗组、药物对照组与模型对照组比较,两组EAMG大鼠NMJ处AchR的表达水平显著升高,与模型对照组相比均具有显著性差异(P<0.01);针灸治疗组与药物治疗组比较,两种疗法对EAMG大鼠NMJ处AchR表达水平的影响无显著性差异(P>0.05)。结论 '温阳补气'针法可以促进EAMG大鼠NMJ处AchR的表达,从而发挥其治疗MG的作用,其治疗效果与溴吡斯的明相近。

运动性疲劳对大鼠神经肌肉接头乙酰胆碱脂酶活性的影响

目的:研究运动性疲劳对大鼠神经肌肉接头乙酰胆碱脂酶(AChE)活性的影响。方法:15只雄性SD大鼠随机按体重配对分为安静对照组、运动即刻组和运动后恢复6h组。运动即刻组和运动后恢复6h组大鼠按Bedford大强度运动模型运动至力竭。所有大鼠取带神经的腓肠肌,冰冻切片,行AChE的组织化学检测。结果:力竭后即刻AChE的染色较正常对照组弱,恢复6h后AChE染色逐渐加深,但还没有恢复到安静组水平;运动性疲劳后即刻AChE的平均灰度值增加,恢复6h后AChE的平均灰度值下降,但仍然高于安静对照组,且与安静对照组比差异都具有显著性;力竭后即刻AChE阳性产物的平均截面积较安静对照组和恢复6h组比较明显减小。结论:大鼠神经肌肉接头乙酰胆碱脂酶活性的下降可能与运动性疲劳的产生有关。

腰神经根损伤后神经细胞黏附分子在神经肌肉接头部的表达

目的 研究大鼠腰神经根损伤后 ,神经细胞黏附分子(N CAM )在神经肌肉接头部的表达。方法 采用免疫组织化学方法和激光共聚焦显微扫描技术 (Confocallaserscaningmicroscopy) ,观察了大鼠胚胎期 ,出生后 14d ,成年期以及L5神经根受压后 10、2 0和 30d ,大鼠比目鱼肌神经肌肉接头部N CAM的分布变化。结果 大鼠胚胎期 ,肌管的表面和神经肌肉接头部N CAM呈强烈着染 ,在发育过程中其浓度逐渐减退 ,至成年肌肉时几乎消失。而当肌肉失神经支配后可导致N CAM重新再现。结论 N CAM在肌肉中的表达是通过神经支配状况调节的。

罗库溴铵对大鼠膈肌神经肌肉接头微终板电位及终板电位的影响

目的 利用成年大鼠膈肌膈神经不均匀牵拉标本 ,研究罗库溴铵对神经肌肉接头部位的电生理学影响。方法 成年健康Wistar大鼠快速处死制备离体大鼠不均匀牵张膈肌膈神经标本 (INSMP) ,记录正常微终板电位 (MEPP)和终板电位 (EPP) ,观察相当于大鼠 4×ED95、2×ED95、1×ED95和 0 5×ED95剂量时的血药浓度的罗库溴铵对MEPP频率和幅度及EPP幅度的影响。结果 罗库溴铵在2 5 μg/ml浓度时对正常INSMP上的MEPP的频率及幅度无明显影响 ;5 μg/ml时 ,在 5min时点对MEPP频率及幅度产生明显抑制作用 (P <0 .0 5 ) ;10～2 0 μg/ml时 ,在 1min时点即对MEPP频率及幅度产生抑制作用 (P <0 0 1) ;2 0 μg/ml在 3min时点、10 μg/ml在 5min时点即能完全抑制MEPP的产生。罗库溴铵在 2 .5 μg/ml浓度时对正常INSMP上的EPP的幅度无明显影响 ;5 μg/ml时 ,在 3min时点开始对EPP幅度产生明显抑制作用(P <0 .0 5 ) ;10～ 2 0 μg/ml时 ,在 1min时点即产生对EPP幅度的抑制作用 (P <0 .0 1) ;随着时间的延长和剂量的加大 ,罗库溴铵对EPP幅度的抑制作用逐渐加强。结论 罗库溴铵能减少突触前递质的释放 ,推测它可能有早期较强的突触前作用。

庆大霉素雾化吸入致神经肌肉接头阻断反应1例

患者,女,30岁,因＂上呼吸道感染＂曾接受15 d抗炎治疗后症状有所缓解,但＂咳嗽、咳痰、声音嘶哑＂迁延不愈于2011-01-18来我科就诊。患者除肺纹理略增粗、咽部充血外生命体征、血常规未见异常;将庆大霉素8万U、地塞米松注射液5 mg加入20 ml注射用水中雾化吸入,当患者吸入5 min后出现胸闷、气短、呼吸困难、心慌、面色苍白。

先天性肠闭锁盲袋神经肌肉接头分布的研究

目的:探讨神经肌肉接头在先天性肠闭锁近端肠管的分布情况。方法:利用免疫组织化学染色技术对先天性肠闭锁近端肠管突触导素和神经细胞黏附分子进行检测。结果:先天性肠闭锁盲袋肠壁突触导素染色阳性突触显著减少,神经细胞黏附分子染色阳性纤维增加。结论:先天性肠闭锁盲袋肠壁的神经肌肉接头分布可能是导致先天性肠闭锁术后合并近端肠管运动障碍的原因之一。

神经肌肉接头在肠神经元发育异常病变肠段中的分布

目的应用两种神经肌肉接头的重要标记物———突触导素（ＳＹ）和神经细胞粘附分子（ＮＣＡＭ），对肠神经元发育异常症神经肌肉接头分布模式进行免疫组化的研究。方法分别取３０例先天性无神经节细胞症（ＨＤ）、３例肠神经节发育不良（ＮＩＤ）、２例肠神经节细胞减少症（ＨＹＰＧ）及１例神经节细胞未发育（ＩＭＧ）的病变肠壁全层作为病变组，取其正常的结肠壁全层作为对照组，采用免疫组化的方法对这两组肠壁的ＳＹ及ＮＣＡＭ分布方式进行光镜检查。结果正常组粘膜下神经丛和肌间神经丛有大量ＳＹ和少量ＮＣＡＭ染色的神经纤维，粘膜肌层、环肌和纵肌层有丰富的突触。ＨＤ病人组粘膜肌层、环肌和纵肌层ＳＹ染色的神经纤维及突触数量在狭窄段则明显稀少，ＮＣＡＭ染色的神经纤维数量明显增多；３例ＮＩＤ中，１例的粘膜肌层、环肌和纵肌层ＳＹ染色神经纤维数量减少明显，１例纵肌层和１例粘膜肌层无ＳＹ染色活性；在神经节细胞减少症组的肌间丛和肌层中只有少数神经肌肉接头。结论神经肌肉接头在肠神经元发育异常症中呈异常分布可能是肠神经发育异常症重要的发病机制，并可能是此类疾病肠运动障碍的原因之一。

神经肌肉接头的连续切片电镜观察与三维重建

神经肌肉接头是突触研究中的重要模型系统。在新生小鼠的神经肌肉接头,肌纤维被多个紧密并置的神经末梢共同支配。受分辨率的限制,在光镜下无法区分单个的神经末梢进行研究。利用透射电子显微镜的高分辨率对神经肌肉接头的超微结构进行连续切片观察和电镜图像的三维重建,准确、客观、形象地展示了轴突末梢的立体形态、空间位置和毗邻关系,为神经肌肉接头的发育研究提供了重要信息。

运动对神经肌肉接头的形态学影响

神经肌肉接头(neuromuscular junction,NMJ)作为运动神经元与骨骼肌之间的突触连接,一生中持续经历重构过程。NMJ的形态学变化可受肌体活动程度的影响并与年龄及肌纤维类型相关。目前,国内大部分相关研究主要集中在运动对骨骼肌整体及肌纤维类型的影响,而有关运动对NMJ形态影响的报道较少。就国外有关各种运动形式下NMJ产生的形态学适应性变化的研究予以综述。

重症肌无力和癌性肌病的神经肌肉接头处变化特点

目的探讨重症肌无力（ＭＧ）和癌性肌病（ＬＥＭＳ）时神经肌肉接头处（ＮＭＪ）的病理变化特点及其意义。方法应用ＨＲＰ－α－ΒｕＴｘ标记后，经计算机扫描及图像分析系统测量ＬＥＭＳ及ＭＧ组ＮＭＪ的各项指标与对照组比较分析。结果ＭＧ组突触后膜皱折减少、短缩，后膜简单化，后、前膜长度之比减少，神经末端部分囊泡空泡化，面积也减少，神经末端与突触后膜面积之比减少，ＡｃｈＲ减少了３５．８７５％；ＬＥＭＳ组突触后膜皱折增殖、延长，突触后、前膜长度比值增加，ＡｃｈＲ增加１４．７０３％，神经末端面积变小。结论ＮＭＪ超微结构变化特点：ＭＧ时突触后膜皱折短缩，简单化，ＡｃｈＲ减少；ＬＥＭＳ时突触后膜皱折增殖、延长，ＡｃｈＲ增加。

运动对成长期骨骼肌神经肌肉接头N乙酰胆碱受体表达的影响

研究目的：通过分析骨骼肌神经肌肉接头（NMJ）N乙酰胆碱受体（nAChR）亚基在成长期（离乳-性成熟）的表达特征,了解NMJ发育过程中的变化及运动对这一过程的影响。研究方法：对3周龄SD雄性大鼠进行运动增强（跑台运动）和运动减弱（尾部悬吊）干预,测定γ-、ε-、-δnAChR mRNA在3~8周龄的表达水平。结果：1）大鼠腓肠肌γ-、ε-、-δnAChR的表达水平在出生后3~5周迅速下降,至5周龄时仅有微量的表达;2）悬吊组-γnAChR在5周龄时表达水平高于对照组;运动组-γnAChR在8周龄时表达水平低于对照组;3）ε-和δ-nAChR表达水平在组间无显著性差异。结论：骨骼肌NMJ的发育在出生后早期具有典型的敏感期;运动训练可以促进胚胎型-γnAChR的消退,限制运动则显著延缓这一过程;成熟后的NMJ具有一定的结构稳定性。

红豆生物碱对大鼠神经肌肉接头的突触后作用

在不均匀牵拉法制动的离体大鼠膈神经膈肌标本上,用微管聚合药红豆生物碱探讨了终板膜的微管在神经肌肉接头乙酰胆碱受体兴奋中的作用。红豆生物碱(20μmol/L,10min)使有神经支配的膈肌终板区乙酰胆碱电位幅度下降了30％;但不影响其时程和膜电位。结果表明该药对神经肌肉接头有突触后抑制作用。其作用机制可能通过影响微管而致使终板膜反应性下降。