突变型Axin基因在神经胶质瘤细胞系C6中的功能研究

目的研究突变型Axin基因对C6细胞增殖及细胞周期的影响,以期揭示突变型Axin基因是否影响胶质瘤的发生。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法绘制细胞生长曲线,应用流式细胞仪(FCM)测定细胞周期的变化,并用平板克隆形成实验对细胞克隆形成能力进行了检测。采用SP法免疫细胞化学染色法检测Ki-67、cyclinD1表达。结果转染突变型Axin基因与转染野生型Axin基因的C6细胞在生长速度,克隆形成能力方面均显著降低,且组间无差别;C6、C6-Vector、C6-Vector-Axin、和C6-Vector-Axin806各组细胞经流式细胞仪检测S期的细胞比例分别为:27.2%、24.8%、18.9%和18.5%;Ki-67及cyclinD1在转染突变型Axin基因与转染野生型Axin基因的C6细胞中表达均降低,且组间无差别。结论突变型Axin基因明显抑制C6细胞的增殖能力,该位点突变可能并不是胶质瘤发生的关键因素。

miR-200c靶向DNMT1基因对人胶质瘤细胞增殖的影响

【目的】探讨miR-200c靶向调控DNA甲基转移酶1（DNMT1）对人胶质瘤U251细胞增殖的影响。【方法】采用实时荧光定量PCR（quantitative real—time PCR，qRT-PCR）检测24例胶质瘤组织和大脑正常组织中miR-200c与DNMT1的表达改变；将miR-200cmimics转染于胶质瘤U251细胞，以DNMT1 siRNA为阳性对照，采用qRT—PCR检测外源过表达miR-200c对DNMT1 mRNA表达水平的影响；采用MTT和法检测外源高表达miR-200c时胶质瘤U251细胞增殖能力的影响。【结果】qRT-PCR检测结果显示，miR-200c在24例胶质瘤组织中的表达水平较大脑正常组织明显下调，DNMT1在胶质瘤组织中的表达水平较大脑正常组织明显上调；外源过表达miR-200c下调胶质瘤U251细胞DNMT1mRNA的表达水平（P〈0．05），抑制胶质瘤U251细胞的生长（P〈0．05）。【结论】miR-200c通过靶向调控DNMT1抑制人胶质瘤细胞的增殖。

人端粒酶启动子联合 miR-34a 整合靶向系统在胶质瘤细胞中的表达及对增殖的影响

【目的】探讨人端粒酶启动子（hT ERT ）联合正常组织特异性miR‐34a （M IR）的整合靶向系统（hT ERT‐M IR）对胶质瘤细胞靶向性的影响。【方法】首先检测hT ERT、miR‐34a在人胶质瘤细胞株 U87、H4和人胶质细胞株HEB（正常细胞株）中的表达；通过质粒构建分别获得 hTERT‐Luc、hTERT‐MIR‐Luc、hTERT‐Bax 以及hTERT‐MIR‐Bax表达质粒，将hTERT‐Luc、hTERT‐MIR‐Luc质粒分别转染U87、H4和 HEB细胞中，检测三组细胞中hT ERT 与hT ERT‐M IR载体的表达活性；将hT ERT‐Bax以及hT ERT‐M IR‐Bax质粒分别转染U87、H4和HEB细胞中，比较三组细胞中hTERT‐Bax和hTERT‐MIR‐Bax对胶质瘤细胞增殖抑制能力的影响。【结果】hTERT在人胶质瘤细胞株U87和H4中特异性高表达，miR‐34a在人胶质细胞株HEB中特异性高表达；在正常胶质细胞株 HEB中，hTERT‐MIR的活性较 hTERT 明显减低（ P ＜0．01）；在胶质瘤细胞株 U87和 H4h中TERT‐Bax和hTERT‐MIR‐Bax 对细胞增殖抑制比较差异无显著性，但在正常胶质细胞株 HEB中，hTERT‐M IR‐Bax对细胞的增殖抑制明显小于hT ERT‐Bax。【结论】hT ERT‐M IR是胶质瘤基因靶向治疗的有效载体系统。

尼莫地平增强HyTK/ACV自杀基因对脑胶质瘤细胞的杀伤作用

目的 :探讨尼莫地平增强阿昔洛韦 (ACV)介导的转HyTK基因治疗诱导脑胶质瘤细胞的死亡方式及旁观者效应机制。方法 :构建含HyTK基因的逆转录病毒载体LNSHyTK ,并转染人脑胶质瘤BT32 5和SCW细胞。单用ACV和联合尼莫地平应用体外试验观察对BT32 5 tk和SCW tk的杀伤效果。同时应用转基因前和转基因后瘤细胞共培养观察其旁观者效应。结果 :低浓度尼莫地平联合ACV作用下转tk基因细胞的凋亡率明显高于单独使用ACV ,并明显提高旁观者效应。结论 :尼莫地平能增强HyTK ACV自杀基因对脑胶质瘤细胞的杀伤作用 ,为钙拮抗剂应用于转tk基因治疗提供了实验依据。

腺病毒介导PTEN基因抗脑胶质瘤作用的实验研究

目的 :探讨 10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物 (phosphataseandtensinhomologydeletedonchromo someten ,PTEN )对人脑胶质瘤细胞的抗增殖作用 ,包括细胞周期改变、抗血管生成的作用。方法 :用含PTEN基因的重组腺病毒载体 ,体外转染人脑胶质瘤细胞U87,用RT PCR、Westernblot检测基因及蛋白的表达。通过细胞生长试验、流式细胞仪分析技术检测转染细胞的增殖、细胞周期的改变 ,用MTT法检测PTEN对人脐静脉内皮细胞生长的影响 ,体内实验检测其致瘤能力。结果 :RT PCR、Westernblot检测转染AdPTEN病毒后的U87细胞PTEN表达由阴性转阳性 ,转染后对U87细胞的体外生长有明显抑制作用 ,使细胞出现G0 ～G1期阻滞 ,并抑制其体内肿瘤生长。含PTEN的上清对内皮细胞生长有明显抑制作用。体内实验表明 ,AdPTEN治疗组可明显抑制肿瘤的生长。结论 :重组腺病毒载体介导的PTEN基因在体内外对人脑胶质瘤细胞U87的生长有抑制作用 ,并抑制肿瘤血管生成 。

Cofilin-1基因在人胶质瘤细胞侵袭、迁移、粘附中的分子机制

【目的】探讨Cofilin-1基因在人胶质瘤细胞侵袭、迁移及细胞粘附中的分子机制。【方法】采用RNAi技术干扰人胶质瘤细胞系SHG-44细胞中Cofilin-1基因的表达。Real-time PCR及Western blot检测验证Cofilin-1干扰效果;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力;粘附作用实验检测细胞粘附能力;Western blot检测细胞中ICAM-1及胞质和胞核中NF-κB p65蛋白水平的表达。【结果】RNAi干扰可降低SHG-44细胞中Cofilin-1的表达水平;Cofilin-1表达干扰抑制SHG-44细胞迁移、侵袭及粘附能力,降低细胞中ICAM-1的表达,下调胞核中NF-κB p65的表达水平。【结论】干扰Cofilin-1表达能够抑制胶质瘤细胞的迁移、侵袭及粘附,可能通过调节NF-κB通路活化发挥作用,Cofilin-1可能成为胶质瘤的潜在治疗靶点。

人胶质瘤细胞系CHG-5和SHG-44差异表达基因的鉴定

目的:采用基因芯片技术分析不同恶性程度胶质瘤细胞CHG-5(WHO分级为级)和SHG-44(WHO分级为级)的差异表达基因。方法:抽提总RNA,进行RT-PCR,并用荧光染料Cy3和Cy5标记cDNA产物,然后进行芯片杂交,检测CHG-5和SHG-44基因表达的差异,并用Northern blot杂交来验证芯片结果。结果:与CHG-5相比,SHG-44细胞中检测到有103个基因表达明显上调,89个表达明显下调。芯片结果得到Northern blot杂交结果的支持。结论:初步揭示了胶质瘤进展的差异表达基因,为胶质瘤的进一步研究提供了基础资料。

一氧化氮抑制洛莫司汀对BT-325胶质瘤细胞的细胞毒作用

目的 :研究一氧化氮 (nitric oxide,NO)在体外实验中对洛莫司汀 (L omustine,CCNU)细胞毒作用的影响。方法 :使用不同浓度的细胞因子或 NO供体分别与 CCNU作用于 BT- 32 5细胞 ,用 Griess法测定 NO浓度 ,MTT法测定实验处理后肿瘤细胞的生存率 ,以此观察 NO对 CCNU细胞毒作用的影响。结果 :1IL - 1β和 LPS能刺激 BT- 32 5细胞生成 NO增加 ,并使 BT- 32 5细胞对 CCNU耐受性增强 (P<0 .0 5 ) ,这个作用能被 L- NAME所抑制。2 DETA NONOate能抑制 CCNU对 BT- 32 5细胞的细胞毒作用 (P<0 .0 5 ) ,在一定程度内呈剂量效应关系。3CCNU与 SNAP共培养 2 4 h后 ,其对 BT- 32 5细胞的细胞毒作用比单用 CCNU组明显增强 (P<0 .0 5 )。结论 :NO使 BT- 32 5细胞对 CCNU的耐受性增强 ,从而部分抑制 CCNU的细胞毒作用 ,这可能是 CCNU耐药的一个新机制 ;同时 NO能够缓解 CCNU在水溶液里的降解。

SOX9基因表达对脑胶质瘤细胞增殖能力的影响

【目的】探讨哺乳动物睾丸决定因子样HMG盒9(SOX9)基因表达对脑胶质瘤细胞增殖能力的影响.【方法】选取脑胶质瘤U87细胞,随机分为对照组、空白转染组和干扰组,其中空白转染组转染慢病毒,干扰组转染SOX9-慢病毒,采用MTT法检测细胞增殖,DAPI细胞核染色检测细胞凋亡,实时荧光定量PCR检测SOX9 mRNA表达,Western blot检测SOX9、SOX2、Nestin蛋白表达.【结果】干扰组细胞SOX9 mRNA表达明显低于空白转染组、对照组,空白转染组明显低于对照组(P<0.05);干扰组细胞凋亡率明显高于空白转染组、对照组,空白转染组明显高于对照组(P<0.05).干扰组培养48h、72h时OD值明显低于空白转染组、对照组,空白转染组培养48h、72h时的OD值明显低于对照组(P<0.05).干扰组SOX9、SOX2、Nestin蛋白相对表达量明显低于空白转染组、对照组,而空白转染组SOX9、SOX27蛋白相对表达量明显低于对照组(P<0.05).【结论】SOX9基因表达可抑制脑胶质瘤细胞增殖,促进细胞凋亡,下调SOX2、Nestin蛋白表达.