人神经营养因子-3基因在大肠杆菌中的克隆和表达

目的 :获得人神经营养因子 - 3 (hNT - 3 )在大肠杆菌中的克隆并表达。方法 :采用PCR方法从 2 0周人胎脑cDNA文库中扩增hNT - 3基因 ,通过双酶切法在M 13mp18载体上克隆获得全长基因 ,将正确全长基因插入PBV2 2 0载体 ,通过选择合适宿主菌获得hNT - 3的高效表达。结果 :获得全长基因完全正确的hNT - 3基因 ,获得占细菌总蛋白 3 0 %的hNT - 3表达菌株。结论 :本研究获得了序列正确的hNT - 3基因克隆 ,并实现了在大肠杆菌中的高效表达。

小鼠耳蜗神经营养因子-3基因的克隆及其基因工程细胞模型的建立

目的 克隆小鼠耳蜗组织神经营养因子－３（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３，ＮＴ３）基因，并转染该基因至体外培养的Ｔ淋巴细胞系的Ｊｕｒｋａｔ细胞，建立能够表达和分泌ＮＴ３的基因工程细胞模型，为后续体内应用作准备。方法 用反转录ＰＣＲ方法扩增ＮＴ３基因，定向克隆入测序载体ｐＵＣ１９。酶切和测序鉴定正确后，再以ｐＵＣ１９－ＮＴ３质粒为模板，通过 ＰＣＲ方法得到上下游能够与 ｐＣＤＮＡ３载体中酶切位点匹配的ＮＴ３片段，进一步克隆获得 ｐＣＤＮＡ３－ＮＴ３质粒。酶切鉴定正确的质粒经阳离子脂质体包埋转染入Ｊｕｒｋａｔ细胞，通过Ｇ４１８反复筛选后，有克隆形成再扩大培养；收集部分细胞提取其中的总ＲＮＡ，反转录ＰＣＲ检测有无ＮＴ３基因片段存在；并利用这些细胞的培养上清鉴定有无生物学活性。结果 正确克隆的小鼠耳蜗组织ＮＴ３基因转染Ｊｕｒｋａｔ细胞后，能够表达和分泌ＮＴ３蛋白并具有生物学活性，促进离体毛细胞和听觉神经元的存活。结论 在体外建立表达ＮＴ３基因并分泌ＮＴ３蛋白的基因工程细胞模型是可行的，为进一步应用到体内治疗感音神经性聋奠定了实验基础。

人神经营养因子-3基因的亚克隆及其基因工程细胞模型的建立

目的 亚克隆人神经营养因子-3(human neurotrophin-3,NT3)并转染至体外培养的人骨髓间充质干细胞(BM-MSCs),建立能够表达和分泌NT3的基因工程细胞模型。方法 采用低糖DMEM培养液+10％胎牛血清体外培养BM-MSCs,流式细胞仪分析其表面标记;构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/NT3并通过脂质体介导转染BM-MSCs;收集部分细胞提取其中的总RNA,经逆转录PCR检测NT3基因表达;利用培养上清液体外孵育毛细胞以鉴定其生物学活性。结果BM-MSCs表达CD13、CD29、CD59,不表达CD11、CD14、CD31、CD34、CD45、CD80、CD86、CD117、HLA-DR;pcDNA3.1(+)/NT3转染BM-MSCs后,能够表达和分泌NT3,并具有生物学活性,可促进离体的豚鼠耳蜗毛细胞存活。结论 在体外建立表达NT3基因并分泌NT3的基因工程细胞是可行的。

携带神经营养因子-3基因的重组腺病毒的构建和鉴定

目的:构建含人神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)的重组腺病毒载体,为初步研究NT-3的在体功能做准备。方法:酶切法从已构建好的真核表达载体NT-3-pIRES2-DsRed2质粒中切下含有NT-3和DsRed2(包括连接区域pIRES2)的目的片段,将其插入到腺病毒骨架质粒pAdShuttle-CMV的多克隆位点中,电穿孔法将腺病毒骨架载体pAdShuttle-CMV-NT-3-DsRed2和预转入人肠杆菌BJ5183的穿梭载体pAdEasy-1进行细菌内同源重组。PacⅠ酶切线性化鉴定正确的同源重组载体,脂质体法转染293T细胞,包装形成表达NT-3目的蛋白和红色荧光的腺病毒。通过293T细胞3轮扩增病毒,氯化铯密度梯度离心,获得高滴度的纯化腺病毒。Western blot方法检测蛋白表达情况。结果:同源重组质粒载体的DNA测序证实腺病毒载体中含有NT-3的目的片段,Western blot证实感染重组腺病毒的293T细胞中有相应的NT-3蛋白表达;病毒滴度为109PFU/ml。结论:利用细菌内同源重组的方法可以成功构建同时表达NT-3蛋白和红色荧光的重组腺病毒。

长链非编码RNA脑源性神经营养因子-反义物和信号素3B-反义物1在胃癌病人中的表达及联合超声检查在胃癌诊断中的应用

目的探究长链非编码RNA(lncRNA)脑源性神经营养因子-反义物(BDNF-AS)和信号素3B-反义物1(SEMA3B-AS1)在胃癌病人中的表达及联合超声检查在胃癌诊断中的应用价值。方法2021年1月~2023年2月收治的118例胃癌病人为胃癌组,同期113例胃部良性病变者为良性病变组。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测血清BDNF-AS和SEMA3B-AS1表达水平,并以平均值分为BDNF-AS高表达组(55例)和BDNF-AS低表达组(63例)、SEMA3B-AS1高表达组(57例)和SEMA3B-AS1低表达组(61例);Kappa检验分析超声诊断与临床病理诊断的一致性;受试者工作特征曲线(ROC)分析血清BDNF-AS和SEMA3B-AS1联合超声对胃癌的诊断价值。结果与良性病变组比较,胃癌组血清BDNF-AS和SEMA3B-AS1水平均明显下降(t=10.205,t=9.590,P<0.05);BDNF-AS和SEMA3B-AS1在肿瘤直径≥3 cm、浸润深度较深、分化程度较低、发生淋巴结转移的胃癌病人中表达水平明显较低(P<0.05);Kappa检验结果显示,超声诊断与临床病理诊断的一致性较高(Kappa值=0.723,P<0.05);ROC结果显示,血清BDNF-AS、SEMA3B-AS1水平和超声诊断胃癌的AUC分别为0.848、0.835、0.861,三者联合诊断的AUC(0.949)显著大于血清BDNF-AS单独诊断的AUC(Z=4.713,P=0.000)、血清SEMA3B-AS1水平单独诊断的AUC(Z=4.112,P=0.0015)和超声诊断的AUC(Z=3.350,P=0.0008),联合诊断的敏感度、特异度优于三者单独诊断。结论血清BDNF-AS和SEMA3B-AS1联合超声检查在胃癌的诊断上具有较高的应用价值。

中风活心软胶囊通过靶向微小RNA-126诱导缺氧诱导因子-1α/促凋亡调节蛋白BNIP3信号通路促进自噬减轻脑缺血再灌注损伤大鼠神经损伤的作用机制研究

目的探讨中风活心软胶囊通过靶向微小RNA(miRNA)-126诱导缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/促凋亡调节蛋白BNIP3信号通路促进自噬减轻脑缺血再灌注损伤大鼠神经损伤的作用机制。方法选取30只无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠,随机分为空白组、模型组与治疗组,每组10只。采用Zea Longa法建立右侧大脑中动脉缺血(MCAO)大鼠模型。治疗组给予中风活心软胶囊。采用改良神经功能损害评分(mNSS)评估大鼠神经功能缺损情况,透射电镜观察缺血半暗区皮质神经元及自噬囊泡超微结构,蛋白质免疫印迹(WB)法和实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)法分别检测缺血半暗区皮质雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、HIF-1α蛋白及其mRNA和miR-126的表达水平。结果模型组、治疗组mNSS评分均高于对照组,但治疗组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、治疗组缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1α蛋白表达水平均高于对照组,但治疗组低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、治疗组缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1αmRNA表达水平均高于对照组,miR-126表达水平低于对照组,但治疗组mTOR、HIF-1αmRNA表达水平低于模型组,miR-126表达水平高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗组缺血半暗区皮质神经元及电镜下自噬囊泡数量明显增加,细胞结构损坏减轻。结论中风活心软胶囊可显著提高脑缺血大鼠缺血半暗区皮质mTOR、HIF-1α因子表达,其作用机制可能是通过激活miR-126表达进而靶向调控mTOR/HIF-1α信号通路,促进自噬,从而发挥其脑保护效应。

急性缺血性脑卒中患者血清长链非编码RNA母系表达基因3和Zeste同源物增强子-2表达与神经功能损伤的相关性分析

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)母系表达基因3(MEG3)与Zeste同源物增强子-2(EZH2)在急性缺血性脑卒中(AIS)患者血清中的表达水平及其与神经功能损伤之间的关系。方法选取延安市人民医院2021年1月至2022年11月收治的92例AIS患者为脑卒中组,92例健康体检者为对照组,根据NIHSS评分将脑卒中组患者分为致残性损伤组19例,非致残性损伤组73例。采用实时荧光定量聚合酶链式反应、酶联免疫吸附法分别检测血清lncRNAMEG3、EZH2水平。采用Spearman相关分析法进行AIS患者血清lncRNAMEG3、EZH2表达水平与美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分之间的相关性分析;采用多因素Logistic回归分析AIS患者合并神经功能致残性损伤的影响因素,并绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析血清lncRNA MEG3、EZH2水平对AIS患者合并神经功能致残性损伤的诊断价值。结果脑卒中组患者血清lncRNA MEG3、EZH2表达水平均高于对照组(t=11.817、11.542,P<0.05)。Spearman相关分析显示,AIS患者血清lncRNA MEG3、EZH2水平与NIHSS评分均呈正相关(r=0.540、0.603,P<0.01)。致残性损伤组体质量指数、吸烟史占比、甘油三酯、总胆固醇、同型半胱氨酸、发病-到院时间(ODT)、lncRNAMEG3、EZH2水平均高于非致残性损伤组(t/χ2=2.103、5.050、9.121、5.585、2.276、5.448、4.638、4.682,P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,甘油三酯、总胆固醇、lncRNA MEG3、EZH2以及ODT均是AIS患者合并神经功能致残性损伤的影响因素(OR=4.853、4.277、2.674、3.052、3.901,P<0.05)。lncRNA MEG3、EZH2联合诊断AIS患者合并神经功能致残性损伤的曲线下面积(AUC)大于lncRNAMEG3以及EZH2单独诊断的AUC(Z=2.626、2.954,P<0.01),敏感度、特异度分别为94.74%、82.15%。结论AIS患者血清lncRNA MEG3、EZH2水平均上升,与AIS患者神经功能损伤程度均正相关,可用作AIS患者合并神经功能致残性损伤的诊断指标,且联合诊断效果更好。

神经营养因子3促进大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能恢复

目的:探讨神经营养因子3(NT-3)促进大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能恢复的作用及其机制。方法:将24只SD大鼠,随机分成假手术组(Sham)、大脑中动脉栓塞/再灌注(MCAO/R)组、MCAO/R+NT-3组。应用改良Garcia评分对各组大鼠进行神经功能评分。应用Western Blot检测各组脑组织中NT-3和LC3B表达。将新生大鼠皮质来源的神经元分成正常组(Normal)、糖氧剥夺(OGD)组、OGD+NT-3组、OGD+NT-3+PF-06273340(TrkC抑制剂)组、OGD+NT-3+ZSTK474(PI3K抑制剂)组、OGD+NT-3+CCT128930(AKT抑制剂)组。应用Western Blot检测神经元中TrkC、p-PI3K、p-AKT及LC3B的水平。观察Normal组、OGD组、OGD+NT-3组中神经元形态变化并应用自噬体荧光染色剂染色,观察神经元自噬现象。结果:通过动物实验发现,NT-3在缺血再灌注损伤的脑组织中表达增多(P<0.05),且应用外源性NT-3治疗后,改良Garcia评分升高(P<0.05),自噬水平减弱(P<0.05)。通过细胞实验发现,NT-3能够抑制缺血缺氧状态下的神经元自噬并且最大限度的维持神经元形态。应用PF-06273340后p-PI3K、p-AKT表达减少(P<0.05)。应用ZSTK474、CCT128930后,NT-3抑制自噬的作用减弱(P<0.05)。结论:NT-3经PI3K/AKT信号通路抑制自噬以维持神经元存活,从而促进大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能恢复。

神经营养因子3经受体切换促进大鼠脊髓损伤后神经功能的恢复

背景:神经营养因子是治疗脊髓损伤的新方法,调控自噬是其发挥作用的机制之一,但具体的信号通路尚不明确。目的:探讨神经营养因子3如何通过P75NTR/Trk C受体切换来调节少突胶质细胞的自噬以及促进脊髓损伤后神经功能恢复的作用,进一步明确具体的分子机制。方法:将24只SD大鼠随机分为3组:假手术组、脊髓损伤组和神经营养因子3组,通过大鼠后肢神经功能评分来评估神经营养因子3对脊髓损伤大鼠的治疗效果,采用Western blot检测各组大鼠脊髓组织中神经营养因子3、Olig1、MBP蛋白以及自噬标记蛋白LC3B的表达水平。在细胞实验中,将少突胶质细胞接种在培养皿中,分为糖氧剥夺组、糖氧剥夺+神经营养因子3组、糖氧剥夺+神经营养因子3+P75NTR质粒组、糖氧剥夺+神经营养因子3+Trk C质粒组、糖氧剥夺+3-甲基腺嘌呤(自噬抑制剂)组及糖氧剥夺+雷帕霉素(自噬激活剂)组。光学显微镜观察少突胶质细胞形态变化,TUNEL染色观察细胞凋亡现象,Western blot检测Trk C受体、P75NTR、LC3B表达及PI3K/AKT/m TOR和AMPK/m TOR信号途径的磷酸化状态。结果与结论:(1)动物实验显示,与假手术组相比,脊髓损伤后神经营养因子3的表达显著增加(P<0.05);与脊髓损伤组相比,外源性神经营养因子3治疗能够加快大鼠神经功能的恢复(P<0.05),并增加Olig1和MBP蛋白的表达(P<0.05);(2)细胞实验发现,3 h是损伤早期与中后期的分界点,与糖氧剥夺组相比,糖氧剥夺+神经营养因子3组少突胶质细胞能够更长时间地维持其形态,Trk C受体在早期表达水平较低而中后期显著上调(P<0.05),P75NTR则在早期上调而中后期下调(P<0.05),自噬水平呈现出先升高后降低的趋势(P<0.05);(3)通过对比糖氧剥夺+神经营养因子3组、糖氧剥夺+雷帕霉素组和糖氧剥夺+3-甲基腺嘌呤组的细胞形态和TUNEL染色结果,发现单独促进或抑制自噬对少突胶质细胞的存活均有不利影响,而类似神经营养因子3这样调节自噬的方法则能最大限度地维持细胞存活;(4)神经营养因子3在早期通过P75NTR/AMPK/m TOR信号通路促进自噬,而在后期通过Trk C/PI3K/AKT/m TOR信号通路抑制自噬。根据上述结果,得到如下结论,即神经营养因子3可以通过P75NTR/Trk C受体的切换能够双向调控少突胶质细胞的自噬,从而维持细胞存活,有助于脊髓损伤后大鼠的神经功能恢复。

脑源性神经营养因子和神经营养因子-5在女性生殖内分泌领域的研究进展

脑源性神经营养因子(BDNF)和神经营养因子-5(NT-5)属于神经营养因子家族,是一类由神经支配的靶组织分泌的分泌型多肽,两者通过作用于相同的受体发挥作用。BDNF和NT-5在卵巢表达广泛,发挥着促进卵泡组装和发育、卵母细胞成熟、排卵、调节颗粒细胞和膜细胞类固醇激素分泌等多种生理作用。不孕症是由多种病因导致的一种生育障碍状态,不孕症患者卵巢局部的BDNF和NT-5存在异常分泌情况。因此,了解BDNF和NT-5在女性生殖内分泌领域的研究进展,可能为不孕症治疗提供新方向,为辅助生殖结局的预测提供新指标。

依托咪酯对视神经损伤成年大鼠视网膜神经节细胞的保护作用及对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、脑源性神经营养因子蛋白表达的影响

目的:探讨依托咪酯对视神经损伤成年大鼠视网膜神经节细胞的保护作用及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白表达的影响。方法:选择成年雄性SD大鼠40只,随机选8只为正常照组,其余32只采用动脉夹夹持法损伤视神经建立视神经损伤模型并分组,即模型组(视神经损伤大鼠),依托咪酯低、中、高剂量组(依托咪酯腹腔注射),剂量分别为2、4、6 mg/kg。分析比较干预后各组大鼠眼压变化。并行HE染色观察视网膜组织结构,比较各组大鼠视网膜神经节细胞(RCGs)存活数目及存活率,Western blot法检测视网膜组织中Caspase-3、BDNF蛋白表达。结果:模型组、依托咪酯各组眼压高于正常组,依托咪酯各组末次给药后眼压降低,且呈剂量依赖性(均P<0.05)。模型组大鼠视网膜水肿增厚,以神经纤维层最为明显,且有空泡,RGC细胞肿胀,内、外核层细胞数量减少,排列紊乱。依托咪酯各组视网膜病理损伤均有改善,高剂量组好于中剂量组,中剂量组好于低剂量组。与正常组比较,模型组大鼠RCGs存活数目减少(P<0.05),与模型组比较,依托咪酯各组RCGs存活数目增多(P<0.05)。依托咪酯高剂量组RCGs存活数目、相对存活率高于中、低剂量组(均P<0.05)。正常组大鼠视网膜组织中BDNF蛋白表达高于模型组,Caspase-3低于模型组,依托咪酯各组视网膜组织中BDNF升高,Caspase-3下降,均呈剂量依赖性(均P<0.05)。结论:Caspase-3蛋白在大鼠视神经损伤中表达升高,BDNF蛋白表达降低,依托咪酯干预能够促进视网膜RGCs存活,对视神经损伤具有保护作用。

帕金森病患者血清同型半胱氨酸、脑源性神经营养因子、α-突触核蛋白水平与脑白质病变的关系研究

目的 探讨帕金森病患者血清同型半胱氨酸(Hcy)、脑源性神经营养因子(BDNF)、α-突触核蛋白(α-Syn)水平与脑白质病变的关系。方法 选取扬中市人民医院2022年6月至2023年6月收治的104例帕金森病患者为观察组,并选取同期健康体检者60例为对照组,收集两组临床资料并测定血清Hcy、BDNF、α-Syn水平;依据脑白质病变分级将观察组患者分正常组、轻度病变组、中度病变组及重度病变组,比较四组临床资料以及上述指标,并采用多因素Logistic回归分析帕金森病患者脑白质病变的影响因素、受试者工作特征曲线(ROC)分析生化指标对脑白质病变的预测价值。结果 观察组血清Hcy、α-Syn水平高于对照组,BDNF水平低于对照组(P<0.05);轻度病变、中度病变及重度病变组患者年龄、病程、Hoehn-Yahr(HY)分级、统一帕金森病评定量表(UPDRS)-Ⅲ评分、Hcy、α-Syn水平高(大)于正常组,BDNF水平低于正常组(P<0.05);多因素Logistic回归分析显示,Hcy、BDNF、α-Syn水平为帕金森病患者脑白质病变的影响因素(P<0.05);结果显示α-Syn水平诊断帕金森病患者脑白质病变的AUC值最高为0.949,敏感度、特异度分别为82.69%、96.67%;其次为BDNF(0.829);且α-Syn诊断AUC值明显高于BDNF、Hcy诊断(Z=2.832、4.991,P<0.05)。结论 Hcy、α-Syn升高是帕金森病患者脑白质病变的独立危险因素,BDNF升高是其保护因素,且Hcy、α-Syn、BDNF可作为帕金森病患者是否发生脑白质病变的生物标志物。

微RNA-509-3p/干扰素刺激基因15轴对喉癌细胞血管生成及血管内皮生长因子蛋白表达的影响

目的探究微RNA(miR)-509-3p/干扰素刺激基因15(ISG15)轴对喉癌细胞血管生成及血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响。方法2022年1―9月,将喉癌M4E细胞分为Con组、miR-NC组、miR-509-3p组、pcDNA-ISG15组。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞中miR-509-3p表达;细胞计数试剂盒(CCK8)检测细胞增殖能力;Transwell检测细胞侵袭能力;划痕实验检测细胞迁移能力;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Matrigel体外成管实验检测血管生成能力;蛋白质印迹法检测细胞中ISG15、VEGF蛋白表达;萤光素酶活性报告检测miR-509-3p和ISG15的靶向关系。结果与喉上皮细胞NP69中miR-509-3p表达(1.01±0.13)μg/L相比,喉癌细胞SCC-40、SCC-2、M4E中miR-509-3p表达[(0.61±0.08)、(0.45±0.07)、(0.18±0.07)μg/L]均降低,且M4E细胞中miR-509-3p表达低于SCC-40、SCC-2细胞(P<0.05)。与Con组相比,miR-509-3p组细胞中miR-509-3p表达增加[(1.17±0.05)μg/L比(118±0.03)μg/L];Con组细胞中miR-509-3p表达与miR-NC组相比差异无统计学意义(P>0.05)。与Con组相比,miR-509-3p组细胞增殖(1.71±0.02比3.09±0.07)、侵袭(55.33±2.52比150.67±2.52)、迁移(30.58±2.08比98.33±1.53)、形成小管数量(61.28±2.15比135.62±2.54)及细胞中ISG15(0.24±0.03比1.11±0.13)、VEGF(0.35±0.02比0.99±0.04)蛋白表达均降低,细胞凋亡率[(18.76±0.18)%比(5.61±0.08)%]增加(P<0.05);Con组细胞增殖、侵袭、迁移、形成小管数量、凋亡率及细胞中ISG15、VEGF蛋白表达和miR-NC组相比差异无统计学意义(P>0.05);与miR-509-3p组相比,pcDNA-ISG15组细胞增殖(3.25±0.06)、侵袭(144.00±2.65)、迁移(89.34±5.13)、形成小管数量(131.56±2.08)及细胞中ISG15(0.83±0.05)、VEGF蛋白(0.89±0.03)表达增加,细胞凋亡率降低(6.85±0.06)%(P<0.05)。结论过表达miR-509-3p可抑制喉癌细胞血管生成及VEGF蛋白表达。

NLRP3炎症小体通路在IL-6、TNF-α促进椎间盘髓核细胞神经营养因子和感觉神经肽P物质表达中的作用

目的探讨NLRP3炎症小体通路在细胞炎症因子IL-6和TNF-α促进椎间盘髓核细胞(NP细胞)神经营养因子(NGF)和感觉神经肽P物质(SP)表达中的作用。方法从3只Sprague-Dawley大鼠椎间盘组织中提取原代NP细胞,分为对照组、处理组和MCC950组。对照组不经过任何处理,处理组用浓度1、10和100 ng/mL的IL-6或TNF-α处理48 h,MCC950组用1μmol/L的NLRP3抑制剂MCC950处理1 h后,用100 ng/mL的IL-6或TNF-α处理48 h。采用ELISA检测细胞培养上清液中NGF和SP的水平。结果与对照组相比,1、10和100 ng/mL IL-6或TNF-α处理NP细胞后,NGF和SP蛋白水平升高(P均<0.05)。MCC950组NGF、SP蛋白水平均较100 ng/mL IL-6或TNF-α处理组降低(P均<0.05)。结论细胞炎性因子IL-6和TNF-α能够通过激活NP细胞中NLRP3炎症小体信号通路,促进NGF和SP的表达。

外源性神经生长因子激活Wnt3α/β-catenin信号通路促进骨折愈合

目的:分析外源性神经生长因子激活Wnt3α/β-catenin信号通路促进骨折愈合的作用。方法:选取40只SPF级SD大鼠,10只大鼠作为对照组,30只构建胫骨骨折模型,共有27只大鼠建模成功,分为模型组9只、低剂量组9只、高剂量组9只。观察各组大鼠病理组织学、骨钙、骨磷水平、血液流变学指标、BMD、骨痂直径、血管生成相关因子、炎症因子水平、Wnt3α/β-catenin通路关键基因Wnt3a、β-catenin、GSK-3β的mRNA表达量、Wnt3α/β-catenin通路关键蛋白Wnt3a、β-catenin、GSK-3β的表达。结果:与对照组相比,另外三组骨钙、骨磷、BMD、血管生成相关因子、Wnt3α、β-catenin相关mRNA表达量、Wnt3α、β-catenin表达量降低,全血黏度、血浆黏度、炎症因子水平、GSK-3β相关mRNA表达量、GSK-3β表达量升高,与模型组相比,低、高剂量组骨钙、骨磷、BMD、骨痂直径、血管生成相关因子、Wnt3α、β-catenin相关mRNA表达量、Wnt3α、β-catenin表达量升高,全血黏度、血浆黏度、炎症因子水平、GSK-3β相关mRNA表达量、GSK-3β表达量降低;且高剂量组体现出最高骨钙、骨磷、BMD、骨痂直径、血管生成相关因子、Wnt3α、β-catenin相关mRNA表达量、Wnt3α、β-catenin表达量,最低全血黏度、血浆黏度、炎症因子水平、GSK-3β相关mRNA表达量、GSK-3β表达量(P<0.05)。结论:采用外源性神经生长因子对胫骨骨质大鼠干预,可促使大鼠骨折的愈合,其作用机制可能与激活Wnt3α/β-catenin信号通路有关,具有较好的使用效果。

三酰甘油-葡萄糖指数、脑源性神经营养因子对非糖尿病维持性血液透析患者的肌肉减少症的诊断价值分析

目的探讨三酰甘油-葡萄糖指数(triglyceride-glucose index,TyG)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)对非糖尿病维持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)患者的肌肉减少症的诊断价值。方法选择2021年1月—2023年1月南京中医药大学附属南京医院肾内科收治的MHD患者,根据2019年亚洲肌少症工作组(Asian Working Group for Sarcopenia,AWGS)修订的诊断标准统计肌肉减少症患病情况,检测血清三酰甘油、葡萄糖、BDNF水平,计算TyG。Pearson分析TyG、BDNF与骨骼肌质量指数(skeletal muscle mass index,SMI)、握力、步速的相关性。多因素Logistic回归分析影响MHD患者合并肌肉减少症的因素,受试者工作特征(ROC)曲线TyG、BDNF诊断MHD患者合并肌肉减少症的价值。结果126例MHD患者中39例(30.95%)患者合并肌肉减少症,与非肌肉减少症组比较,肌肉减少症组患者TyG较高、血清BDNF水平偏低(t=7.974、14.699,均P<0.001)。肌肉减少症组患者TyG与SMI、握力、步速呈负相关(r=-0.365、-0.319、-0.452,均P<0.001),BDNF与SMI、握力、步速呈正相关(r=0.326、0.275、0.395,P<0.001、0.003、P<0.001)。年龄偏大(OR=1.861,95%CI:1.040~3.330,P=0.019)、高TyG(OR=2.050,95%CI:1.049~4.008,P=0.015)是MHD患者合并肌肉减少症的危险因素,高白蛋白(OR=0.694,95%CI:0.515~0.935,P=0.008)、高BDNF(OR=0.630,95%CI:0.430~0.923,P=0.010)是MHD患者合并肌肉减少症的保护因素。TyG、BDNF诊断MHD患者合并肌肉减少症的曲线下面积为0.740(95%CI:0.654~0.814,P<0.001)、0.727(95%CI:0.641~0.803,P<0.001),联合TyG、BDNF诊断MHD患者合并肌肉减少症的曲线下面积为0.939(95%CI:0.882~0.974,P<0.001),高于单独诊断(Z=4.075、4.241,P均<0.001)。结论MHD患者TyG值增加,血清BDNF水平降低与合并肌肉减少症有关,联合TyG和BDNF可提高对MHD患者肌肉减少症风险评估价值。

灯盏乙素通过环状GMP-AMP合酶-干扰素基因刺激因子通路抑制BV-2小胶质细胞介导的神经炎症

目的探讨灯盏乙素对脂多糖(LPS)诱导的BV-2小胶质细胞神经炎症的影响。方法培养BV-2小胶质细胞系,将BV-2小胶质细胞分为对照组(Ctrl)、环状GMP-AMP合酶(cGAS)抑制剂RU320521(RU.521)组、LPS组、LPS+RU.521组、LPS+灯盏乙素预处理(LPS+S)组、LPS+S+RU.521组,共6组。Western blotting及免疫荧光双标染色法检测并观察BV-2小胶质细胞中cGAS、干扰素基因刺激因子(STING)、核因子κB(NF-κB)、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)、PYD结构域蛋白3(NLRP3)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达变化(n=3)。结果Western blotting和免疫荧光双标染色均显示,与对照组相比,LPS诱导后,BV-2小胶质细胞中cGAS、STING、p-NF-κB、NLRP3和TNF-α蛋白的表达水平显著升高(P<0.05);与LPS组相比,LPS+S组中cGAS、STING、p-NF-κB、NLRP3和TNF-α蛋白的表达水平显著下降(P<0.05)。使用cGAS通路抑制剂RU.521后显示了与灯盏乙素预处理组相似的作用效果。此外,NF-κB在各组的变化不明显(P>0.05)。结论灯盏乙素干预抑制BV-2小胶质细胞介导的神经炎症反应,可能与cGAS-STING信号通路有关。

神经营养因子赖氨酸激酶受体1型基因突变致先天性无痛无汗症1例并文献复习

目的 报告先天性无痛无汗症(CIPA)1例并文献复习,增加其病因及临床特点的了解,减少误诊误治。方法 采集2021年12月安徽省儿童医院收治的病儿及其父母外周血进行医学全外显子组基因检测,并对候选基因变异进行Sanger测序验证。结果 基因分子遗传学分析结果提示病儿在神经营养因子赖氨酸激酶受体1型(NTRK1)中存在2个分别来自父母双方的杂合突变(c.575-19G>A和c.444C>A),结合病儿临床表现符合CIPA。结论 CIPA为单基因遗传病,临床罕见,基因分子遗传学分析有助于诊断。

缓释神经营养因子3和神经节苷脂GD1a的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球修复大鼠脊髓损伤

背景:非侵入式脊髓损伤治疗方法亟待开发。纳米材料能够递送药物,提高治疗效果,具有明显优势。目的:制备缓释神经营养因子3和神经节苷脂GD1a的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球,探究其对大鼠脊髓损伤的修复作用。方法:采用油水乳液挥发有机溶剂法,制备缓释神经营养因子3的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球和缓释神经节苷脂GD1a的聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球,检测微球的缓释性能。采用随机数字表法将60只雌性SD成年大鼠分为5组:假手术组打开椎板后直接缝合,脊髓损伤组建立脊髓T9撞击损伤模型,神经营养因子组脊髓T9损伤区域注射缓释神经营养因子3的纳米微球悬液,神经节苷脂组脊髓T9损伤区域注射缓释经节苷脂GD1a的纳米微球悬液,实验组脊髓T9损伤区域注射缓释神经营养因子3的纳米微球和缓释神经节苷脂GD1a的纳米微球混合悬液,每组12只。术后每周进行旷场实验及BBB评分,术后4,8周进行脊髓组织形态学观察。结果与结论:(1)体外浸泡于PBS 14 d内,缓释纳米微球可持续释放神经营养因子3和神经节苷脂GD1a。(2)术后7,8周,与脊髓损伤组比较,神经营养因子组、实验组大鼠的BBB评分、旷场总移动距离增加(P<0.05)。尼氏染色显示,实验组术后4,8周的脊髓灰质前角运动神经元多于脊髓损伤组(P<0.05),神经营养因子组术后8周的脊髓灰质前角运动神经元多于脊髓损伤组(P<0.05)。免疫荧光染色显示,与脊髓损伤组比较,神经营养因子组术后8周、实验组术后4,8周的脊髓白质腹侧神经纤维增多(P<0.05),神经节苷脂组、实验组术后4,8周的脊髓白质腹侧髓鞘碱性蛋白表达增加(P<0.05),神经营养因子组术后8周的髓鞘碱性蛋白表达增加(P<0.05),神经营养因子组、实验组术后8周的下行脊髓固有束增加(P<0.05)。(3)结果表明,神经营养因子3微球单独应用,或是与神经节苷脂GD1a微球联合应用,能够促进脊髓损伤区周边运动神经元及神经纤维存活,并可改善大鼠后肢运动功能。

神经营养因子3-壳聚糖载体诱导神经干细胞分化为神经元的亚型及其电生理特性

背景:前期研究已证实神经营养因子3-壳聚糖载体可支持神经干细胞的存活和增殖,同时可高效诱导神经干细胞向神经元方向分化。目的:观察神经营养因子3-壳聚糖载体对神经元发育进程、发育各阶段电生理特性及发育成熟神经元亚型的影响。方法:取第3代新生大鼠脊髓神经干细胞,分4组培养:空白对照组加入神经干细胞培养基,壳聚糖组加入含壳聚糖的神经干细胞培养基,NT3组加入含神经营养因子3的神经干细胞培养基,NT3-壳聚糖组加入含神经营养因子3-壳聚糖载体的神经干细胞培养基。利用免疫荧光染色观察神经干细胞发育各阶段标志物表达情况,借助全细胞膜片钳技术评价神经干细胞发育过程中电生理特性的变化情况,利用免疫荧光染色观察神经干细胞分化21 d后中间神经元的亚型。结果与结论:①Nestin、DCX、Tuj1及MAP2免疫荧光染色显示,神经营养因子3-壳聚糖载体维持了神经干细胞池的稳态,并且通过加速神经母细胞的发育进程来促进神经元发育成熟;②全细胞膜片钳记录发育过程中的细胞发现,营养因子神经营养因子3和神经营养因子3-壳聚糖在发育早期对神经干细胞膜功能以及细胞膜上离子通道的发育成熟具有一定的促进作用,但是仅有神经营养因子3-壳聚糖可将这一优势维持到发育中后期,即分化后7-14 d;③免疫荧光染色显示,神经干细胞分化21 d后,NT3-壳聚糖组成熟神经元可表达运动神经元特异性标记物HB9、V1类型中间神经元FOXP1、V2类型中间神经元特异性标记物LHX3,以及调控机械性痛觉感觉中间神经元的特异性标记物VGLUT3;④结果显示,神经营养因子3-壳聚糖载体促进了神经干细胞向神经母细胞的发育,在发育早期对细胞膜功能及细胞膜上的离子通道发育成熟具有一定的促进作用,可诱导发育成熟的神经元亚型多样化。