神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤大鼠中的实验研究

目的探讨神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤大鼠中的作用，以进一步了解其在脊髓损伤治疗中的应用价值。方法将90只健康Wistar大鼠采用Allen打击法建立脊髓损伤模型，将其随机分为A组（空白对照组）30只、B组（神经干细胞移植组）30只和C组（神经干细胞联合神经营养因子3基因转染的施万细胞移植组）30只。三组大鼠分别于移植前、移植后1、3个月进行BBB评分、皮质诱发电位及神经功能相关指标评估及比较。结果移植后1、3个月B组和C组的BBB评分中0～7分比例（B组：70％、60％，C组：50％、30％）、皮质诱发体感和运动电位[B组皮质诱发体感电位：（201．37±23．06）、（227．63±26．48）μV，C组皮质诱发体感电位：（241．36±27．34）、（278．53±31．46）μV；B组皮质诱发运动电位：（150．23±22．67）、（193．57±27．18）μV，C组皮质诱发运动电位：（186．72±26．83）、（242．57±30．56）μV]，均优于A组[90％、90％，皮质诱发体感电位：（53．86±6．75）、（56．96±7．35）μV，皮质诱发运动电位：（32．64±4．07）、（34．15土4．12）μV]。另外，B、C组神经功能相关指标也均明显优于A组，而C组则优于B组，且C组移植后3个月神经功能指标水平明显优于移植后1个月。差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论神经营养因子3基因转染的施万细胞在脊髓损伤大鼠中的作用较佳．有利于脊髓损伤的改善，对改善患者的感觉、运动等指标均发挥着积极作用。

神经营养因子3基因转染对庆大霉素性耳聋保护作用的实验研究

目的 :探讨阳离子脂质体介导的神经营养因子 3(NT3)基因转染对豚鼠庆大霉素性耳聋的保护作用。方法 :将携带外源性基因NT3的重组真核表达载体 pIRES2 EGFP NT3与阳离子脂质体复合物注入豚鼠耳蜗 ,术后给予庆大霉素肌肉注射 (12 0mg/kg) 14d ,分别于停药后 1d、2周进行听性脑干反应 (ABR)及畸变产物耳声发射 (DPOAE)测听并观察转染基因在耳蜗的表达和分布及耳蜗毛细胞受损情况。结果 :NT3组DP gram幅值降低较对照组明显减轻 ,ABR阈值升高亦无对照组显著 (P <0 .0 5 )。耳蜗基底膜FITC phalloidin染色见NT3组耳蜗毛细胞的缺失较对照组明显减轻。结论 :阳离子脂质体介导的NT3基因转染对豚鼠庆大霉素性耳聋具有一定程度的保护作用。

神经营养因子3纳米微球载体基因工程转染许旺细胞

背景:纳米微球基因转染技术携带或增强种植细胞可持续稳定延长其释放,保持其活性和作用时间。目的:观察纳米微球载体转染神经营养因子3基因修饰的许旺细胞对坐骨神经缺损的促进和修复作用。方法:采用纳米微球载体将神经营养因子3基因转染入体外培养的新生Wistar大鼠许旺细胞。取Wistar成年大鼠80只制作坐骨神经缺损模型,将4种不同的移植物注入细胞外基质凝胶-聚乳酸聚羟基乙酸共聚物管桥接管内:空白对照组未注入其他任何物质,细胞组注入许旺细胞,基因组注入神经营养因子3基因,实验组注入神经营养因子3基因修饰的许旺细胞。结果与结论:术后坐骨神经及肌纤维横截面积染色比较,实验组优于细胞组、基因组(P<0.01),细胞组、基因组均优于空白对照组(P<0.01),细胞组、基因组组间比较差异无显著性意义(P>0.05)。表明神经营养因子3基因转染许旺细胞移植,可相互促进,再造神经再生的微环境,促进并修复缺损坐骨神经缺损。

血管内皮生长因子165、神经营养因子3、血管生成素1基因转染诱导骨髓间充质干细胞向神经元及血管内皮细胞分化

背景:骨髓间充质干细胞是一种多功能间充质干细胞,具有多向分化潜能,可通过腺病毒转染等方法对其进行基因修饰,使其能够产生多种生长因子,如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、神经营养因子3(neurotrophin 3,NT-3)、血管生成素1(angiopoietin 1,Ang-1)等,从而应用于组织工程研究中。目的:探讨VEGF165、NT-3、Ang-1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞向神经元及血管内皮细胞诱导分化的可能性。方法:采用差速贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,进行流式细胞术和成骨、成脂诱导分化能力鉴定。以巨细胞病毒(CMV)作为启动子,构建2个腺病毒载体,其一为双顺反子载体,携带h VEGF165及Ang-1基因(Adv-Bic);其二为携带NT-3基因载体,即Adv NT-3。以不同感染复数值将Adv-Bic(绿色荧光)及Adv NT-3(红色荧光)同时转染大鼠骨髓间充质干细胞,转染2 d后根据荧光显微镜下绿色及红色荧光蛋白表达情况确定最佳感染复数值。将生长良好的第3代骨髓间充质干细胞分为2组,实验组以最适感染复数值转染Adv-Bic(无荧光标记)及Adv NT-3(无荧光标记);对照组以相同感染复数值转染空白对照病毒。两组分别于体外培养7 d后进行免疫荧光及q PCR检测。结果与结论:(1)间质干细胞表面分子CD29、CD44呈阳性表达,造血干细胞表面分子CD34、CD45呈阴性表达。骨髓间充质干细胞能够定向分化为成骨细胞及脂肪细胞;(2)病毒转染骨髓间充质干细胞48 h后荧光显微镜下观察有绿色及红色荧光蛋白表达,随着感染复数值增大荧光表达量逐渐增强,感染复数值为100时荧光表达最强烈;(3)免疫荧光及q PCR结果显示,实验组VEGF165、NT-3、Ang-1表达水平高于对照组,且血管内皮特异性标记物CD31、CD34表达水平高于对照组,神经元特异性标记物NSE、Nestin表达水平高于对照组;(4)结果提示,VEGF165、NT-3、Ang-1基因转染骨髓间充质干细胞,使其过表达VEGF165、NT-3、Ang-1生长因子,能够诱导骨髓间充质干细胞定向分化为神经元及血管内皮细胞。

腺病毒介导神经营养素-3基因转染施万细胞

【目的】构建神经营养素-3(NT-3)基因转染的施万细胞。【方法】NT-3基因重组腺病毒(AdvNT-3)扩增、纯化和测定后,转染体外培养的施万细胞(SCs)。用免疫细胞化学和ELISA方法分别检测NT-3基因转染SCs的NT-3表达及培养液中NT-3的含量。【结果】实验中获得的AdvNT-3中外源基因序列与大鼠NT-3的DNA序列完全一致,与未基因转染SCs相比,NT-3基因转染SCs的NT-3阳性增强,培养液中NT-3含量增高。【结论】通过腺病毒介导可以获得NT-3过量表达的基因转染SCs。

神经营养素3基因转染神经干细胞及其表达(英文)

背景:应用包括神经营养素3的神经营养因子促进周围神经再生是当今周围神经再生研究的热点之一,但是临床应用上缺乏安全、有效的给药途径。基因转染技术为神经营养因子的临床应用提供了新的思路和途径。目的:用神经营养素3基因修饰神经干细胞,并观察在转染后的神经干细胞内的表达情况。设计:完全随机试验。单位:广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科和华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科。材料:实验选用健康SD大鼠3只,鼠龄4个月,雌雄不拘,由华中科技大学同济医学院动物房提供。用于转染神经干细胞的重组腺病毒表达载体由华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室构建,浓度为0.15g/L。方法:实验于2002-12/2004-03在华中科技大学同济医学院协和医院骨科实验室和同济医院中心实验室完成。采用阳离子脂质体介入法,将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒pAd-神经营养素3转染原代培养的神经干细胞,转染72h后采用荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白在神经干细胞上的表达,测定转染率。采用免疫细胞化学染色法和反转录-聚合酶链反应检测转染72h,1,5周后神经营养素3基因在神经干细胞中的表达和转录情况。主要观察指标:神经营养素3基因在转染后的神经干细胞内的表达情况。结果:①重组质粒pAd-神经营养素3转染神经干细胞:转染72h绿色荧光蛋白在部分神经干细胞上有表达,转染率为40%。5周后仍可见绿色荧光蛋白的表达。②神经营养素3基因在神经干细胞中的转录与表达:转染72h,1,5周后神经干细胞中均有神经营养素3mRNA的转录,转染5周后仍有神经营养素3mRNA的表达。结论:神经营养素3基因以阳离子脂质体为载体,通过腺病毒的介导,可有效的转染培养的神经干细胞并长期表达。

腺病毒介导脑源性神经营养因子基因转染对大鼠视神经损伤后视觉电生理的影响

目的 了解正常及视神经损伤大鼠闪光视觉诱发电位 (F VEP)及眼内应用腺病毒转染脑源性神经营养因子 (brain derivedneurotrophicfactor,BDNF)基因对F VEP的影响。方法 应用多功能电生理检查仪检测正常大鼠F VEP。建立大鼠视神经不全损伤模型 ,同时将含有BDNF基因的重组腺病毒经玻璃体腔注射到大鼠眼内 ,观察伤后 2h ,1、2、3、4周F VEP中P1波振幅和峰潜时的变化。结果 本实验系统测得的正常大鼠F VEP中P1波振幅为 (15 .5 1± 3.6 7) μV ,峰潜时为 (86 .2 0± 4 .30 )ms(n =2 0 )。视神经不全损伤后急性期P1波振幅降低 ,峰潜时延长 (P <0 .0 1)。BDNF腺病毒组P1波较对照组波幅高 ,峰潜时短 ,且在 1～ 3周具有显著性差异 (P <0 .0 5 )。结论 腺病毒介导BDNF基因转染对大鼠视神经损伤后早期功能的恢复有促进作用。

腺病毒介导脑源性神经营养因子基因转染在大鼠视网膜中的表达

目的 :研究腺病毒介导脑源性神经营养因子 (brain derivedneurotrophicfactor,BDNF)基因转染在活体大鼠视网膜的表达 .方法 :将BDNF腺病毒注入大鼠玻璃体内 ,于不同时间点免疫荧光染色检测表达 ;酶联免疫吸附实验 (enzymelinkedimmunosorbentassay ,ELISA)检测转染因素、损伤因素对视网膜表达BDNF的影响 .结果 :免疫荧光染色显示 3d节细胞即出现绿色荧光 ,可持续 4wk ,对照组荧光着色细胞数、荧光强度均低于各时间点转染组 ;ELISA显示经BDNF转染各组在各时间点表达均显著高于非转染组 (P <0 .0 1 ) ,损伤非转染组在 3d和 1wk时高于正常组 (P <0 .0 1 ) .结论 :腺病毒介导BDNF基因转染可在大鼠视网膜有效表达 。

非病毒载体介导脑源性神经营养因子基因的体外转染小鼠耳蜗螺旋神经节细胞实验研究

目的探究经聚醚酰亚胺(polyetherimide,PEI)表面修饰后的纳米羟基磷灰石载体介导脑源性神经营养因子(derived neurotrophic factor,BDNF)体外转染效率,表达产物对庆大霉素所致小鼠耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGCs)细胞损伤的保护作用。方法构建经PEI表面修饰的纳米羟基磷灰石载体和BDNF基因真核表达质粒,体外培养并转染小鼠耳蜗SGCs细胞;分别采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)、蛋白质免疫印迹和细胞计数试剂盒kit-8(cell counting kit-8,CCK-8)细胞毒实验,检测体外培养小鼠耳蜗SGCs细胞及纳米羟基磷灰石载体介导BDNF基因的体外转染及表达效率,对耳毒性药物庆大霉素所致SGCs细胞损伤的保护作用。结果 DNA核酸电泳结果显示成功构建带有巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)启动子的BDNF真核表达质粒;qRT-PCR和蛋白质免疫印迹结果显示与转染空质粒对照组相比,转染BDNF表达载体构建后SGCs原代细胞中BDNF的mRNA水平显著上调4.19倍(t=5.744,P<0.05),蛋白水平显著上调3.03倍(t=6.627,P<0.05),差异有统计学意义。此外,蛋白质免疫印迹和CCK8细胞毒实验结果表明,庆大霉素处理可显著抑制小鼠耳蜗SGCs细胞内BDNF基因表达,加剧细胞毒性,转染纳米羟基磷灰石载体介导qRT-PCR BDNF基因可明显逆转庆大霉素对SGCs的细胞毒作用,差异有显著统计学意义(t=10.015,P<0.01)。结论经PEI表面修饰的纳米羟基磷灰石载体可显著增强BDNF基因的跨膜能力,显著上调SGC细胞内BDNF表达产物的表达及对庆大霉素所致SGCs细胞损伤的保护作用,为内耳基因治疗的临床开展及应用提供实验和理论依据。

豚鼠骨髓间充质干细胞培养及体外转染神经营养因子-3的研究

目的建立豚鼠骨髓间充质干细胞(bone-mesenchymal stem cells,BMSCs)的体外培养体系,体外脂质体2000介导神经营养因子-3(neurotrophic factor-3,NT-3)转染BMSCs,为内耳移植提供前期研究基础。方法 (1)采用全骨髓贴壁法培养豚鼠BMSCs并传代,取P3代做生长曲线图,流式细胞仪上检测BMSCs的表面标志物CD29,CD90以及造血细胞表面标志物CD45;(2)按照不同质粒-脂质体配比介导p EGFP-N1-NT3转染P3代BMSCs,转染后48 h计算转染效率,选择最佳配比将p EGFP-N1-NT3质粒转染P3代BMSCs,转染后1、3、7、14 d,观察其荧光表达情况;(3)转染后3 d的BMSCs提取蛋白,Western Blot验证NT-3蛋白表达。结果 (1)全骨髓贴壁法获得细胞数量多,增殖快,传代可以纯化细胞。生长曲线符合Logistic生长曲线。流式细胞仪检测细胞CD29和CD90阳性表达,CD45阴性表达,符合BMSCs特征;(2)不同配比中质粒:脂质体为4μg:12μl时转染率最高,为最佳配比;(3)转染后48 h荧光表达较强,7 d荧光表达但较前明显减弱,14 d基本未见明显荧光表达。Western Blot验证NT-3基因成功表达。结论 (1)全骨髓贴壁法可以成功培养出增殖快,细胞纯度高的BMSCs;(2)脂质体法成功介导NT-3真核质粒在BMSCs内表达,BMSCs可能作为内耳基因治疗的理想载体。

胶质细胞源性神经营养因子基因转染雪旺氏细胞的实验研究

目的应用胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因转染雪旺氏细胞,观察GDNF基因在雪旺氏细胞内的表达效果,以及对雪旺氏细胞的营养作用。方法将雪旺氏细胞分为空白对照组、载体组、空载体组,通过阳离子脂质体介导,将GDNF基因转染雪旺氏细胞。用细胞增殖实验(MTT)、免疫组化、流式细胞仪观察在24h、48h、72h各组转染后对细胞的营养作用。结果在载体组细胞的生长状况较其他两组增殖良好。免疫组化可见GDNF在载体组细胞内呈现高表达。流式细胞仪观察基因转染后对雪旺氏细胞有明显的营养作用。结论GDNF基因转染雪旺氏细胞后,在细胞内呈现高表达,并对细胞有明显的营养作用。

脑源性神经营养因子基因转染修复大鼠坐骨神经损伤的组织学观察及功能评价

目的观察重组腺病毒载体AxCA-BDNF转染大鼠损伤坐骨神经后的脊髓前角运动神经元存活、神经生长和功能恢复情况。方法将90只成年Wistar大鼠分成3组,AxCA-BDNF转染组(硅胶管内置AxCA-BDNF原液)、BDNF组(硅胶管内置BDNF溶液)和对照组(硅胶管内置空白病毒稀释液),每组30只,另取5只Wistar大鼠作为正常组。应用组织学图像分析技术对脊髓前角运动神经元和新生神经纤维进行计数,对新生神经髓鞘厚度进行测量分析;应用足印分析和电生理检查技术,从功能角度判定BDNF基因转移的生物效应。结果在3、7、14d及1个月4个时相点,光镜、电镜病理组织学检查和图像分析证实,AxCA-BDNF转染组和BDNF组脊髓前角运动神经元存活的数量、新生神经纤维数目及其髓鞘厚度均明显优于对照组(P<0.01);HRP逆行示踪也证实神经联接的再形成优于对照组(P<0.01);在坐骨神经功能指数测定、神经传导速度和复合肌肉动作电位振幅等神经功能恢复指标上,AxCA-BDNF转染组和BDNF组均优于对照组(P<0.01)。结论应用腺病毒介导的BDNF基因转移,不仅能促进损伤神经纤维再生,也能保护损伤的脊髓神经元,大鼠的神经功能得到了明显改善。

胶质细胞源性营养因子及内皮素B受体基因共转染小鼠神经干细胞(英文)

背景:胶质细胞源性神经营养因子与内皮素B受体基因的缺失将导致肠神经系统发育异常。神经干细胞移植不仅可以从解剖和功能上修复神经系统,还可以作为基因转染的载体。目的:拟将携带胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因的重组腺病毒转染至小鼠神经干细胞,并观察目的基因的表达。设计:细胞-基因学观察。材料:新生昆明小鼠由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供。jetPEI转染试剂为PolyPlus公司产品;携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子、内皮素B受体基因共表达腺病毒由本室孙念峰博士和张景辉博士构建并惠赠。方法:无菌条件下取新生小鼠脑组织,制备单细胞悬液。取携带绿色荧光蛋白的胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因共表达腺病毒,溶解于NaCl中制备JetPEI/DNA复合体。用DMEM/F12完全培养基调整次代神经干细胞密度为5×108L-1,向24孔板中每孔加入400μL细胞悬液、100μLJetPEI/DNA复合体,置37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中,分别于转染24,48,72h后收集神经干细胞。主要观察指标:采用荧光显微镜、流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR检测目的基因在神经干细胞内的表达。结果:转染24h后即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达,转染24,48,72h后绿色荧光蛋白阳性率分别为15.36%,24.67%,25.73%。各转染时间点神经干细胞均表达胶质细胞源性神经营养因子及内皮素B受体基因,转染24h条带亮度较低,72h时外源基因表达水平最高。结论:运用jetPEI试剂成功将目的基因转染至小鼠神经干细胞内,且胶质细胞源性神经营养因子和内皮素B受体基因在靶细胞中得到有效转录和表达。

睫状神经营养因子基因转染延缓失神经肌萎缩的作用(英文)

背景:睫状神经营养因子(CNTF)对失神经支配骨骼肌萎缩有防治作用,但是否可以应用CNTF基因转染方法延缓失神经支配骨骼肌萎缩尚不清楚。目的:探索一次性电穿孔介导CNTF转染延缓失神经骨骼肌萎缩的疗效。设计:随机对照研究。地点和对象:在上海交通大学附属第一人民医院动物房完成,雄性SD大鼠36只,年龄两三个月,体质量250～300g,由上海中科院实验动物中心提供。干预:制备36只大鼠右下肢腓肠肌失神经支配模型,随机平均分成失神经对照组,CNTF基因转染组。两组于术后2,4,8周分别取6只大鼠进行实验评价。主要观察指标:两组术后2,4,8周肌湿重维持率、肌细胞截面积、肌肉蛋白含量、胶原纤维与肌细胞面积比和细胞凋亡数。结果:2周和4周CNTF基因转染组的肌湿重维持率、肌细胞截面积和肌肉蛋白含量均明显高于失神经对照组(P<0.05),而胶原纤维与肌细胞面积比和细胞凋亡数明显低于失神经对照组(P<0.05)。8周后,两组间各参数无明显区别(P>0.05)。结论:一次性电穿孔介导CNTF基因转染可延缓失神经骨骼肌萎缩4周。

神经营养素-3基因转染神经干细胞的实验研究

目的:用神经营养素-3(NT-3)基因修饰神经干细胞,并观察在转染后的神经干细胞内的表达情况,为进一步的研究奠定基础。方法:采用阳离子脂质体介入法,将含绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺病毒表达载体pAd-NT-3转染原代培养的神经干细胞,观察GFP及NT-3两种蛋白的表达,镜下测定转染率,采用免疫组化和逆转录酶-多聚酶链反应(RT-PCR)方法进行鉴定。转染后的神经干细胞经G418筛选,获得成功转染NT-3基因的NSCs克隆。结果:镜下观察到绿色荧光蛋白长期表达在转染后的神经干细胞,转染率可达40%。免疫组化和RT-PCR结果显示NT-3在转染后的神经干细胞可以长期表达。结论:NT-3基因,通过腺病毒的介导,以阳离子脂质体为载体,可有效的转染培养的神经干细胞并长期表达。

NT3基因转染对噪声性耳聋的影响研究

目的验证阳离子脂质体介导神经营养因子3(Neurotrophin-3,NT3)基因转染对噪声致豚鼠耳聋的保护作用。方法选取广西医科大学动物实验中心提供的60只健康花色黑目豚鼠为研究对象,按随机数字表法分为5组,每组12只(实验过程中部分动物死亡,实际实验数据按每组10只统计)。Ⅰ组未受噪声影响,Ⅱ组注入人工外淋巴液未受噪声刺激,Ⅲ组注入人工外淋巴液后受噪声刺激,Ⅳ组在注入空质粒后受噪声刺激,V组在注入含NT3基因的质粒后受噪声刺激。噪声为4 kHz的稳态白噪声,强度100 dB,8 h/d,连续10 d,休息5 d,再通过听性脑干反应(Auditory Brain-Stem Response,ABR)测试和免疫组织化学染色来评估听阈变化和耳蜗螺旋神经节细胞中NT3蛋白的表达情况。结果V组ABR阈值高于Ⅰ、Ⅱ组,但低于Ⅲ、Ⅳ组,差异有统计学意义(P均<0.05)。耳蜗螺旋神经节细胞处NT3蛋白表达量以V组较其余各组更高,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论NT3基因转染后阈值增幅减小,听功能受损有一定程度减轻,对噪声致豚鼠耳聋具有一定程度的保护作用。

神经营养因子-3质粒转染失神经肌肉的表达

目的:观察外源性神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)基因直接转染失神经肌肉的表达及治疗效果。方法:SD大鼠40只,制成腓肠肌失神经支配模型。实验组术后胖肠肌内注射人NT-3质粒10μl(1μg/μl),对照组注射等量生理盐水10μl/d,不同时间点取材采用免疫组化检测蛋白的表达,并进行肌湿重、肌纤维横截面积和运动终板检测。结果:实验组2d后肌细胞出现外源性NT-3免疫组化染色阳性,7 d时达到高峰,14 d和 28 d时有所下降,但与 2 d相比,仍维持在较高水平。而对照组免疫组化染色结果为阴性。实验组与对照组检测指标比较差异有显著性。结论:NT-3基因直接转染可在肌细胞内表达蛋白,为失神经肌肉萎缩的基因治疗提供了初步的理论和实验依据。

神经营养素-3基因转染小胶质细胞及其表达

目的用神经营养素-3(NT-3)基因转染小胶质细胞并检测其表达情况。方法小胶质细胞分离纯化后,分为非转染组、空转染组及转染组,非转染组小胶质细胞不经质粒转染,空转染组及转染组分别将空质粒pcDNA3.1及真核重组质粒pcDNA3.1/NT-3转染小胶质细胞。然后经过G418筛选后,采用RT-PCR方法检测3组小胶质细胞中的NT-3mRNA水平,酶联免疫吸咐法(ELISA法)检测各组细胞培养液的吸光度值及NT-3蛋白的浓度。结果 RT-PCR检测显示,转染组可得到一250bp的基因片段。ELISA法检测显示,转染组细胞培养液的吸光度值明显高于非转染组及空转染组,差异有显著性(F=57.23,t=14.28、12.93,P<0.05)。转染组细胞培养液NT-3蛋白浓度亦明显高于非转染组及空转染组,差异有显著性(F=49.56,t=15.32、11.47,P<0.05)。结论 NT-3基因成功转染小胶质细胞,并获得高效表达。

阳离子脂质体介导小鼠原代螺旋神经节细胞NT-3基因转染的实验研究

目的通过阳离子脂质体携带构建的神经营养因子-3(NT-3,Neurotrophin-3)-绿色荧光蛋白基因(pEGFPC2)转染小鼠耳蜗原代培养的螺旋神经节细胞,观察NT-3-pEGFPC2的共表达及其对螺旋神经节细胞生长的影响。方法构建携带绿色荧光蛋白报告基因的重组质粒-NT3 pEGFPC2,建立体外培养原代小鼠耳蜗螺旋神经节细胞的方法,并用神经丝蛋白(NF200)单克隆抗体进行免疫组化染色鉴定。利用阳离子脂质体携带重组质粒瞬时转染原代小鼠耳蜗螺旋神经节细胞,观察转染后NT-3的表达及对螺旋神经节细胞生长数量的影响。结果成功培养了小鼠原代耳蜗螺旋神经节细胞。基因转染后24 h在荧光显微镜下观察到胞体及轴突发出绿色荧光的螺旋神经节细胞。用Western blot方法检测到相应NT-3蛋白表达。继续培养12 d后各组细胞数量均减少,但NT-3转染组细胞减少数量低于空载体组。结论阳离子脂质体可作为NT-3基因的载体。NT-3的基因转染对抑制耳蜗螺旋神经节细胞的退行性变有一定作用。

NT-3基因转染对骨髓间充质干细胞增殖及向神经元分化的影响

目的研究神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖和向神经元分化的影响,探讨转染NT-3基因的MSCs体内移植治疗脊髓损伤的可行性。方法体外培养稳定表达NT-3蛋白的MSCs,通过MTT法检测NT-3对MSCs增殖的影响;应用免疫细胞化学和免疫印迹方法检测转染NT-3的MSCs表达神经元标志物NeuN蛋白的情况。结果转染NT-3基因的MSCs生长曲线上移,细胞增殖率显著升高,与对照组相比,两者有显著差异(P<0.05),表明转染NT-3后细胞生长加快。免疫荧光染色结果显示转染NT-3的MSCs的NeuN阳性细胞数明显增多,与对照组比较有显著差异(P<0.05);Western印迹检测结果显示转染NT-3的MSCs内NeuN蛋白表达明显增多,与对照组比较有显著差异(P<0.05),表明NT-3促进MSCs向神经元方向分化。结论 NT-3基因转染可促进MSCs的增殖,并诱导其向神经元方向分化。